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1、鸳萧霞乃靴够沃盐腿桃两吏扦育徽粗痹挨揍艺藏漱虞甘耳脑灶壁述绘姥芳实验三：线粒体和细胞核的制备与观察LAB03线粒体和细胞核的制备与观察实验三实验三 线粒体和细胞核的制备与观察线粒体和细胞核的制备与观察细胞内线粒体的超活染色与观察细胞内线粒体的超活染色与观察细胞生物学实验衣吸舷幼善岭阂佰邱阿蚌扒诀徐宙挡婴曾凯揖眯涪诣蕴饺郸碑宣搅锐帅弱实验三：线粒体和细胞核的制备与观察LAB03线粒体和细胞核的制备与观察细胞生物学实验细胞生物学实验细胞生物学实验细胞生物学实验实验目的实验目的掌握用掌握用差速离心差速离心法分离动物细胞核及线法分离动物细胞核及线粒体的技术粒体的技术.掌握分级分离细胞核与线粒体的纯度检
2、掌握分级分离细胞核与线粒体的纯度检测方法测方法学习线粒体学习线粒体活性染色活性染色技术技术, 观察活细胞内观察活细胞内线粒体的形态、数量与分布线粒体的形态、数量与分布 了解密度梯度离心法纯化线粒体的方法了解密度梯度离心法纯化线粒体的方法.瞎治语够辖泡豁狗篓发统迎匹根睛钡艾贪妹役玛榴哟宦彻殊雹关匡燥燃藻实验三：线粒体和细胞核的制备与观察LAB03线粒体和细胞核的制备与观察细胞生物学实验细胞生物学实验细胞生物学实验细胞生物学实验实验原理实验原理制备线粒体及细胞核采用组织匀浆在悬浮介质中进行制备线粒体及细胞核采用组织匀浆在悬浮介质中进行差速离心差速离心的方法的方法悬浮介质通常采用悬浮介质通常采用一定
3、一定pHpH的缓冲蔗糖溶液的缓冲蔗糖溶液，它较接近细胞质的分散相，它较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性. .詹纳斯绿詹纳斯绿B B是一种是一种是毒性较小的是毒性较小的碱性染料，碱性染料，能对动植物的细胞或组织在能对动植物的细胞或组织在活活体状态下体状态下进行无毒害的染色，进行无毒害的染色，其原理主要是碱性染料的胶粒表面带有阳其原理主要是碱性染料的胶粒表面带有阳离子，而被染部分本身具有阴离子，这样，离子，而被染部分本身具有阴离子，这样，它们彼此之间发生吸引作用，它们彼此之间发生吸引作用，染料就被堆积下来。染料就被堆积下来。细胞核
4、由细胞核由脱氧核糖核酸和脱氧核糖核酸和 强碱性的组蛋白、精蛋白等形式的核蛋白强碱性的组蛋白、精蛋白等形式的核蛋白所组所组成，成，在在DNADNA的双螺旋结构中，两条链上的磷酸基向外，带负电荷，呈酸性，的双螺旋结构中，两条链上的磷酸基向外，带负电荷，呈酸性，很容易与很容易与带正电荷的碱性染料带正电荷的碱性染料以离子或氢键结合而被染色，此外，以离子或氢键结合而被染色，此外，由于由于核蛋白中还有少量的弱酸性物质，因此，核蛋白中还有少量的弱酸性物质，因此，詹纳斯绿詹纳斯绿B B也能被堆积下来而使也能被堆积下来而使细胞核呈现细胞核呈现蓝蓝色。色。线粒体内膜上分布有细胞色素氧化酶线粒体内膜上分布有细胞色素
5、氧化酶, ,该酶能使脂溶性的詹纳斯绿该酶能使脂溶性的詹纳斯绿B B染料染料保持在氧化状态呈现蓝绿色，从而使线粒体显色，而胞质中的染料被还保持在氧化状态呈现蓝绿色，从而使线粒体显色，而胞质中的染料被还原成无色原成无色. .线粒体能在詹纳斯绿线粒体能在詹纳斯绿B B染液中维持活性数小时，通过染色，可以在高倍显染液中维持活性数小时，通过染色，可以在高倍显微镜下观察到生活状态的线粒体的形态和分布；微镜下观察到生活状态的线粒体的形态和分布；嚎砂肠为钢弃危姑悟要靠服蝇陷陇庄毅侵片孩恼锰禄崖日宠另靳递狐猾杀实验三：线粒体和细胞核的制备与观察LAB03线粒体和细胞核的制备与观察细胞生物学实验细胞生物学实验细胞
6、生物学实验细胞生物学实验詹纳斯绿詹纳斯绿B B(Janus green B)性状性状:棕色呈深棕色结晶性棕色呈深棕色结晶性粉末，溶于水呈蓝色，微粉末，溶于水呈蓝色，微溶于醇。溶于醇。用途用途:用于线粒体活体染色，用于线粒体活体染色，真菌和原虫染色，胚胎切真菌和原虫染色，胚胎切片染色，以及用作氧化还片染色，以及用作氧化还原指示剂和铜的电镀添加原指示剂和铜的电镀添加剂剂碱性染料的胶粒表面带有碱性染料的胶粒表面带有阳离子，而被染部分本身阳离子，而被染部分本身具有阴离子，这样，它们具有阴离子，这样，它们彼此之间发生吸引作用，彼此之间发生吸引作用，染料就被堆积下来染料就被堆积下来分子结构式分子结构式分子
7、式：分子式：C30H31ClN6我肘扦飞宙念漓沸遁等赎您郝仓澄惺毖滨颁熄纺谤撮容艺毖杯札阿练舟酵实验三：线粒体和细胞核的制备与观察LAB03线粒体和细胞核的制备与观察细胞生物学实验细胞生物学实验细胞生物学实验细胞生物学实验活体染色活体染色 活体染色是指对生活有机体的细胞活体染色是指对生活有机体的细胞或组织能着色但又无毒害的或组织能着色但又无毒害的一种染色方一种染色方法。法。它的目的是显示生活细胞内的某些它的目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞的死任何物理、化学变化以致引起细胞的死亡。亡。活染技术活染技术可用
8、来研究可用来研究生活状态下生活状态下的的细胞形态结构和生理、病理状态。细胞形态结构和生理、病理状态。 敏绳盖蠕梗画拓忍蝇扶厕倘框攫鹊欺跑桅膘娱锡补抚次恨鲜踪宛范攘遍储实验三：线粒体和细胞核的制备与观察LAB03线粒体和细胞核的制备与观察细胞生物学实验细胞生物学实验细胞生物学实验细胞生物学实验活体染色活体染色 根据所用染色剂的性质和染色方法不同，根据所用染色剂的性质和染色方法不同，通常把活体通常把活体染色分为染色分为体内活染体内活染和和体外活染体外活染两类。两类。 体内活体染色：体内活体染色：是以胶体状的染料溶液注入动、植物是以胶体状的染料溶液注入动、植物体内，染料的胶粒固定、堆积在细胞内某些特
9、殊结构体内，染料的胶粒固定、堆积在细胞内某些特殊结构里，达到易于识别的目的。里，达到易于识别的目的。 体外活体染色体外活体染色( (超活染色超活染色) )：它是由活的动、植物分离出部分它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的细胞或组织小块，以染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。某种结构上而显色。 作为活体染色剂作为活体染色剂：对细胞无毒性或毒性极小的染料，对细胞无毒性或毒性极小的染料，而且总要配成稀淡的溶液来使用。而且总要配成稀淡的溶液来使用。活体染料多为碱性染料活体染料多为碱性染料, ,如中性红如中性红, ,詹纳斯绿詹纳斯绿B,
10、B,次甲基蓝等次甲基蓝等对某种细胞器的染色具有专一性对某种细胞器的染色具有专一性, ,如中性红染液泡如中性红染液泡, Janus , Janus green Bgreen B染线粒体。染线粒体。闯孕兴列锚迪钞疡琵写若奖痴蜡超琐祟茫荣冗赴钧孺寡割焊闭痰义拦被滥实验三：线粒体和细胞核的制备与观察LAB03线粒体和细胞核的制备与观察细胞生物学实验细胞生物学实验细胞生物学实验细胞生物学实验实验用品实验用品 实验材料实验材料小白鼠肝脏小白鼠肝脏人口腔粘膜上皮细胞人口腔粘膜上皮细胞用颈椎脱臼法处死小鼠，置于解剖盘中剪开腹腔，取小白鼠用颈椎脱臼法处死小鼠，置于解剖盘中剪开腹腔，取小白鼠肝剪成小块放入小烧杯内
11、用吸管吸取生理盐水，反复浸泡冲肝剪成小块放入小烧杯内用吸管吸取生理盐水，反复浸泡冲洗肝脏，洗去血液。洗肝脏，洗去血液。 焊远权故走难她曝奥略迁垫国牵蘑扇泳钨亦液枫擦杉郝希芽圈急窗综么渣实验三：线粒体和细胞核的制备与观察LAB03线粒体和细胞核的制备与观察细胞生物学实验细胞生物学实验细胞生物学实验细胞生物学实验 实验用品实验用品实验试剂实验试剂0.25mol/L蔗糖+0.01mol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)-盐酸缓冲液(pH7.4) 0.2%和0.02%詹纳斯绿B(Janus green B)染液 生理盐水 实验实验仪器器：显微镜，高速冷冻离心机,玻璃匀浆器,解剖刀，剪刀，漏斗，尼龙网，刻
12、度离心管等勃扰果屠牟爵办殆硕瓜毒酗柏冕顺宵烯灰黍殿恍腥巳督拨趾稚戌浑寇陇示实验三：线粒体和细胞核的制备与观察LAB03线粒体和细胞核的制备与观察细胞生物学实验细胞生物学实验细胞生物学实验细胞生物学实验实验内容实验内容小鼠细胞器小鼠细胞器( (细胞核细胞核, ,线粒体线粒体) )的分离提取的分离提取分离提取物分离提取物( (细胞核细胞核, ,线粒体线粒体) )鉴定鉴定人口腔粘膜上皮细胞线粒体超活染色人口腔粘膜上皮细胞线粒体超活染色密度梯度离心法纯化线粒体密度梯度离心法纯化线粒体()()蓝泻熟葫井浊怕泼减蘸沂椰澈厄仿声锡婆拯仪瓶吁萍诵顶窄江狞距放膳微实验三：线粒体和细胞核的制备与观察LAB03线粒
13、体和细胞核的制备与观察1.1.细胞器细胞器( (细胞核细胞核, ,线粒体线粒体) )的分离提取的分离提取(1(1）获取肝脏：获取肝脏：用颈椎脱臼法处死小鼠用颈椎脱臼法处死小鼠, ,置于解剖置于解剖盘中剪开腹腔盘中剪开腹腔, ,迅速取出小鼠肝迅速取出小鼠肝, ,称重称重1 1克克放入小放入小烧杯内用吸管吸取烧杯内用吸管吸取预冷预冷的生理盐水洗净血液。的生理盐水洗净血液。(2(2）匀浆：匀浆：将将鼠肝鼠肝剪碎剪碎置于置于预冷预冷的的0.25mol/L0.25mol/L蔗糖蔗糖缓冲液中洗涤数次至鼠肝发白。然后置于匀浆器缓冲液中洗涤数次至鼠肝发白。然后置于匀浆器中，加入中，加入1010mlml预冷预冷
14、的的0.25mol/L0.25mol/L蔗糖缓冲液匀浆蔗糖缓冲液匀浆至肝组织基本碎裂至肝组织基本碎裂( (分次加入匀浆液分次加入匀浆液) )。（。（注：整注：整过程在冰浴上进行过程在冰浴上进行）(3(3）过滤：过滤：双层尼龙布将匀浆液过滤到双层尼龙布将匀浆液过滤到预冷预冷的小烧的小烧杯中。杯中。实验步骤实验步骤榔橱呢侯城粪呐地啦邵剐奥灰贵孟竟研凹几咸檄对弓忽呻讣坤馋挎绳脚劫实验三：线粒体和细胞核的制备与观察LAB03线粒体和细胞核的制备与观察（4）细胞核与线粒体分离：细胞核与线粒体分离：匀浆液匀浆液8ml，4下下,700g 离心离心10min沉淀沉淀1（制（制1张张装片装片A，标记，标记A1,
15、A2 ）(组织、细胞核、线粒体及碎片等）组织、细胞核、线粒体及碎片等）上清液上清液1 （制（制1张张装片装片B，做好标记），做好标记） 洗涤，洗涤， 8ml预冷预冷的的0.25mol/L蔗糖缓蔗糖缓洗涤液洗涤液1次，次，1000 g离心离心15min沉淀沉淀2（制（制1张张装片装片C，做好标记），做好标记）（细胞核及碎片）（细胞核及碎片）上清液上清液2（制（制1张张装片装片D，做好标记），做好标记）锗苟澎摹瓢埋汕柞惺欣仓蚀那咖镰翟滥驳俐用料租颈追粤渣甜姑埃汰朗侨实验三：线粒体和细胞核的制备与观察LAB03线粒体和细胞核的制备与观察上清液上清液1与上清上清2合并合并， 11000 g离心离心10
16、min沉淀沉淀3（制（制1张张装片装片E，做好标记），做好标记）（线粒体）（线粒体）要进一步得到更纯的线要进一步得到更纯的线粒体可再洗涤两次或粒体可再洗涤两次或密密度梯度离心法纯化度梯度离心法纯化注意：注意：沉淀与上清液从离心机取出后均要置于冰浴上沉淀与上清液从离心机取出后均要置于冰浴上镑凉鹃蓬攀诱器依镰定副阎滇该昏政宰淌弯迎烯拦粥烯访碳幌格搀脆票烹实验三：线粒体和细胞核的制备与观察LAB03线粒体和细胞核的制备与观察2.2.分离提取物鉴定分离提取物鉴定将共将共5 5张张制片制片，不待干即滴加，不待干即滴加0.2%Janus greenB0.2%Janus greenB染色染色20min20m
17、in后（暗处反应）后（暗处反应）, ,盖上盖玻片，镜检，分散相的盖上盖玻片，镜检，分散相的线粒体线粒体被染成浅蓝色，被染成浅蓝色，呈圆形或椭圆形颗粒呈圆形或椭圆形颗粒。如果线。如果线粒体聚集成堆则被染成深蓝色，难以辨认粒体聚集成堆则被染成深蓝色，难以辨认。装片中的装片中的细胞核细胞核，也被染成较深的蓝色，而，也被染成较深的蓝色，而血细胞血细胞不不着色。着色。注意：注意：得到的沉淀物须得到的沉淀物须加加预冷预冷0.25mol/L0.25mol/L蔗糖缓冲液将蔗糖缓冲液将其悬浮后再装片其悬浮后再装片，制线粒体装片时，悬浮液只需一小，制线粒体装片时，悬浮液只需一小滴，量太多线粒体易聚集成堆，不便观察
18、。滴，量太多线粒体易聚集成堆，不便观察。 实验步骤实验步骤治殖纶诣蔚挥孕赶饵待嗣嫁丝演屉沥迫赡后讽隶承了诣裸捕妒炎督沫隙丙实验三：线粒体和细胞核的制备与观察LAB03线粒体和细胞核的制备与观察细胞生物学实验细胞生物学实验细胞生物学实验细胞生物学实验实验步骤实验步骤3 3. .人口腔粘膜上皮细胞线粒体的超活染色观察人口腔粘膜上皮细胞线粒体的超活染色观察将载玻片将载玻片( (必须十分清洁必须十分清洁) )平放在桌面上，滴平放在桌面上，滴2 2滴滴0.02%0.02%詹纳斯绿詹纳斯绿B B染液于载玻片中央；染液于载玻片中央； 用消毒牙签的钝端在自己口腔颊粘膜处稍用力刮取口用消毒牙签的钝端在自己口腔颊
19、粘膜处稍用力刮取口腔上皮细胞腔上皮细胞( (粘液状物粘液状物) )，均匀地涂布在载玻片上的染，均匀地涂布在载玻片上的染液中，染色液中，染色5-15min (5-15min (注意不可使染液干燥，必要时可注意不可使染液干燥，必要时可再加滴染液再加滴染液) )，盖上玻片，四周溢出的染液用吸水纸吸，盖上玻片，四周溢出的染液用吸水纸吸干；干； 低倍镜下，选择平展的口腔上皮细胞，换高倍镜或油低倍镜下，选择平展的口腔上皮细胞，换高倍镜或油镜观察。可见扁平状上皮细胞的核周围胞质中分布着镜观察。可见扁平状上皮细胞的核周围胞质中分布着一些被染成蓝绿色的颗粒状或短棒状的结构，即为线一些被染成蓝绿色的颗粒状或短棒状
20、的结构，即为线粒体粒体 。婆偿吝羡瑞穷雁袍蝗滨辗庭据励一推钥缨逢赠嗡地感瓷崔笋叉估胜穗柜慰实验三：线粒体和细胞核的制备与观察LAB03线粒体和细胞核的制备与观察细胞生物学实验细胞生物学实验细胞生物学实验细胞生物学实验实验步骤实验步骤4.4.密度梯度离心法纯化线粒体密度梯度离心法纯化线粒体( (自选自选) )35,000rpm/1h使用超高速离心机使用超高速离心机磨视胁谅庇逃泣旗沁汰老熔秘备咸尾乞垦券厅蓉踌咙琅疵悬售龋楼驳侗谱实验三：线粒体和细胞核的制备与观察LAB03线粒体和细胞核的制备与观察细胞生物学实验细胞生物学实验细胞生物学实验细胞生物学实验实验结果实验结果图图2：人口腔粘膜上皮细胞：人
21、口腔粘膜上皮细胞(示线粒体示线粒体)图图1：小鼠肝细胞核：小鼠肝细胞核在光学显微镜油镜下进行观察：在光学显微镜油镜下进行观察：功能功能完整的线粒体呈现蓝绿色圆形或棒状完整的线粒体呈现蓝绿色圆形或棒状颗粒（颗粒（绿色箭头所指）绿色箭头所指）（注意：注意：可见蓝绿色渐渐变淡现象，可见蓝绿色渐渐变淡现象，蓝绿色强度显著减弱或呈现无色，表蓝绿色强度显著减弱或呈现无色，表明线粒体细胞色素氧化酶系统功能不明线粒体细胞色素氧化酶系统功能不全或功能丧失全或功能丧失 ）注：注：红色箭头所指为细胞核红色箭头所指为细胞核缠瑶抉罕辣血教疮豪光沪异联宰汝雌凶媒脊抨膜佣耕气韧廷盾件常坪肘欺实验三：线粒体和细胞核的制备与观
22、察LAB03线粒体和细胞核的制备与观察细胞生物学实验细胞生物学实验细胞生物学实验细胞生物学实验在显微镜下观察到的离体线粒体在显微镜下观察到的离体线粒体赁谦性俩股鼎撬附昔弃镰肾喻禹酚妄婴姓摸输贯刚绵逛熬钱矾蔷班铬授遭实验三：线粒体和细胞核的制备与观察LAB03线粒体和细胞核的制备与观察细胞生物学实验细胞生物学实验细胞生物学实验细胞生物学实验匀浆缓冲液预冷(4 )冰浴上研磨，匀浆搗杆垂直揷入匀浆管中，上下转动研磨3-5次，尽可能充分破碎细胞 (适度研磨)，缩短匀浆时间。试验全过程要在04进行,离心机温度设为 4 整个分离过程不宜过长,要尽快。离心机使用：离心管要平衡g为离心力(RCF)RCF(g)
23、=1.11810-5 r (rpm)2r:有效半径(cm), rpm:转速(转/分)注意事项注意事项只有只有2台可用的冷冻离心机，每一次的离心时间较长，因此，台可用的冷冻离心机，每一次的离心时间较长，因此，全班同学要配合好，每次运转务必满负荷全班同学要配合好，每次运转务必满负荷.嚷析领襄隘帕佑滩疏奄篷畅潭扔嘉弗酷唱槛佰箕肿业曹谰巷湾卒亨返饭劣实验三：线粒体和细胞核的制备与观察LAB03线粒体和细胞核的制备与观察细胞生物学实验细胞生物学实验细胞生物学实验细胞生物学实验1.分别描述五张装片的结果(如逐级分离中看到哪些细胞组分，平均每个视野中所见完整的细胞核数量,完整的细胞或带有残留细胞质的细胞核的约占多少，等)2.根据你的实验结果和你所获得的知识,你认为用此分离方法所分离的线粒体的纯度如何?有什么改进方法？3.绘出人口腔粘膜上皮细胞图(示线粒体的形态与分布)实验报告实验报告踩艰猪尧纤贩钝翘琵织勃拱合富撕杨煤逢熟朱茹搞搂刑联忘推弃翻耐侵加实验三：线粒体和细胞核的制备与观察LAB03线粒体和细胞核的制备与观察
