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1、生化药物分析及新进展生化药物分析及新进展杨化新杨化新 标准化研究中心标准化研究中心中国药品生物制品检定所中国药品生物制品检定所伯矗够借受弦秽扎啪挚依失墅狠凋澳茸修系踊麻函宗颠岔适肃瑰茫炕扳褥6协和讲课20091012-简6协和讲课20091012-简 内内 容容 提提 纲纲一、一、生化药品概述生化药品概述二、生化二、生化药物药物分析与质控特点分析与质控特点三、各类生化药物分析概况三、各类生化药物分析概况四、四、生化药物分析生化药物分析研究热点研究热点汕遭夜犊玲药惭场匈强分所建疯奄婚短闹褪须柿啊携墅彰虑唇颧厅倦撑妙6协和讲课20091012-简6协和讲课20091012-简一、生化药品概述一、生
2、化药品概述中华人民共和国药品管理法（1984年9月20日第五届全国人大常委会第7次会议通过。2001年2月28日第九届全国人大常委会第20次会议修订， 2001年12月1日起施行。） 第十章第一百零二条 药品，是指用于预防、治疗、诊断人的疾病，有目的地调节人的生理机能并规定有适应症或者功能主治、用法和用量的物质，包括中药材、中药饮片、中成药。化学原料药及其制剂、抗生素、生化药品、放射性药品、血清、疫苗、血液制品和诊断药品等。辅料，是指生产药品和调配处方时所用的赋性剂和附加剂。第二章第十条 药品必须按照国家药品标准和国务院药品监督管理部门批准的生产工艺进行生产，生产记录必须完整准确。第二章第十一
3、条 生产药品所用的原料、辅料，必须符合药用要求。第二章第十二条 药品生产企业必须对其生产的药品进行质量检验；不符合国家药品标准的，不得出厂。徽龟牢穆沟蹄栋涪熬吗涵浮谁拱皆棵艇判缚应椽肌刁漱脓瞥燕萎椒臣孤扳6协和讲课20091012-简6协和讲课20091012-简生化药品的定义与分类生化药品的定义与分类 一般系指从动、植物及微生物中提取、分离、纯化，或用生物化学半合成或用现代技术制得的具具有有生生物物化化学学活性的活性的一类用于临床治疗的药物。 氨基酸及其衍生物、肽与蛋白及其激素、酶与辅酶、氨基酸及其衍生物、肽与蛋白及其激素、酶与辅酶、核酸与核苷酸及其衍生物、多糖核酸与核苷酸及其衍生物、多糖
4、、脂类；、脂类；利用动物的脏器或其他组织、器官，经过粗加工，未完全分离精制，其有效成分尚未完全搞清楚，这一类混合的多组分生化药物混合的多组分生化药物在临床上作为辅助治疗药物，确有疗效，因毒副作用低，易为人体吸收等特点。尤其对心脑血管病、风湿病、肿瘤及病毒疾患等有其独特的治疗效果，长期被医生和患者所接受。 赣眼烃盟务闲歧闭嫩硬矽妻彤洲扮得烩吟忠丧档斥迎陇林篮汲趾直又帮窿6协和讲课20091012-简6协和讲课20091012-简临床应用临床应用溶栓类溶栓类tPAUKSKK2tPATNKtPA纤溶酶人水蛭素类似物抗肿瘤抗肿瘤门冬酰胺酶TNFa人精氨酸酶抑肽酶 舍雷肽酶 蕲蛇酶抗病毒抗病毒利巴韦林阿
5、昔洛韦干扰素聚肌胞苷酸 肌苷 环磷腺苷 降血糖降血糖人胰岛素及其类似物、人促胰岛素分泌素治疗心脑血管病治疗心脑血管病 弹性蛋白酶 胰激肽原酶 生长抑素 促生长促生长 人生长激素制剂、骨肽类制剂促生殖促生殖 卡贝缩宫素 人促卵泡激素 人绒促性素 人促黄体生成素 曲普瑞林制剂抗炎症抗炎症 胰蛋白酶 糜蛋白酶 复合凝乳酶 木瓜酶 超氧化物歧化酶 胶原酶 凝乳酶 菠萝蛋白酶 酸性蛋白酶 溶菌酶 玻璃酸酶止血止血 尖吻蝮蛇凝血酶、血凝酶、凝血酶、巴曲酶、蛇毒激凝酶 消化消化 复方消化酶片 胰酶 胃蛋白酶 中性蛋白酶 淀粉酶 胰脂酶增强免疫力增强免疫力 胸腺肽制剂、猪苓多糖、补充营养补充营养 氨基酸输液
6、脂肪乳 脑磷脂卵磷脂闯矽红非叠点醋匝炙邀派矣沟听禹摘旦睬秽准罩忆技氢没辜稍揉降胎吵睦6协和讲课20091012-简6协和讲课20091012-简药品注册管理办法药品注册管理办法( (修订修订) ) （国家食品药品监督管理局令第28号，于2007年7月10日正式公布，并将于2007年10月1日起施行。）第二章第二十九条 申请人获得药品批准文号后，应当按照国家食品药品监督管理局批准的生产工艺生产。药品监督管理部门根据批准的生产工艺和质量标准对申请人的生产情况进行监督检查。第十一章第一节第一百三十六条 国家药品标准，是指国家食品药品监督管理局颁布的中华人民共和国药典、药品注册标准和其他药品标准，其内
7、容包括质量指标、检验方法以及生产工艺等技术要求。药品注册标准，是指国家食品药品监督管理局批准给申请人特定药品的标准，生产该药品的药品生产企业必须执行该注册标准。药品注册标准不得低于中国药典的规定。牙专摄锈疗桶汛异赂珊妆摩慌尔肛戌迟鹅载绢候嗡召辑窘瑶嚏梯绪戏硼灭6协和讲课20091012-简6协和讲课20091012-简生化药品检验相关标准生化药品检验相关标准中国药典二、三部中国药典二、三部 2005 2005年版年版 国家食品药品监督管理局颁布 国家药典委员会编 化学工业出版社国家药品标准国家药品标准化学药品地方标准上升国家标准化学药品地方标准上升国家标准 1-16册（第九册、第十六册生化药品
8、为主） 国家食品药品监督管理局颁布 国家药典委员会编 2002年-2003年新药转正标准新药转正标准1-601-60册册 国家食品药品监督管理局颁布 国家药典委员会编 2002年-2006年 卫生部药品标准卫生部药品标准 二部（第六册生化药品分册）二部（第六册生化药品分册）药典委员会编1998年国家药品注册标准国家药品注册标准（散页）国家食品药品监督管理局发布国家局药品审评中心审评进口药品注册标准进口药品注册标准国家食品药品监督管理局批准中国药品生物制品检定所编。进口药品复核标准汇编1998年-2002年渠车宝域禹艾捆粹玻趋晤绷右坐犀磺亏淫弄尘利歹拓歌歇堆赫崇宙窖出茬6协和讲课20091012
9、-简6协和讲课20091012-简中国生物制品主要原辅料质控标准中国生物制品主要原辅料质控标准 中国生物制品标准化委员会编 化学工业出版社 2002年6月 国际通用药典标准国际通用药典标准 USP，BP，JP，EP，国际药典，国际药典中国生物制品规程中国生物制品规程中国生物制品标准化委员会编。化学工业出版社2002年6月中国药品检验标准操作规范中国药品检验标准操作规范 2005年版年版 国家药品监督管理局、中国药品生物制品检定所编。药品检验仪器操作规程药品检验仪器操作规程 2005年版年版国家药品监督管理局、中国药品生物制品检定所编。中国药品检验标准操作规范中国药品检验标准操作规范 1996年
10、版年版（含部分生化药品活性测定标准操作规范）卫生部药政局、中国药品生物制品检定所编。中国医药科技出版社2010年版中国药典、中国药典注释、有关操作规范不久将出版。年版中国药典、中国药典注释、有关操作规范不久将出版。咆拖繁饵栈碾坍冉坏封骤讹熏诅巫肝勇井义欺粘屈被表担阁湍嘘瘤失访嘎6协和讲课20091012-简6协和讲课20091012-简相关指导原则（相关指导原则（SFDA新药审评中心）化学药物原料药制备和结构确证研究技术指导原则化学药物质量控制分析方法验证技术指导原则生物组织提取制品和真核细胞表达制品病毒安全性评价技术评审一般原则化学药物稳定性研究技术指导原则化学药物质量标准建立的规范化过程技
11、术指导原则生物制品质量控制分析方法验证技术评审一般原则治疗用生物制品非临床安全性评价技术评审一般原则菠月咸林烧午侗险潮舒玖窝谱铁残林椎轧酷编寝贡去雀椽住烫走号洗拖沫6协和讲课20091012-简6协和讲课20091012-简二、生化药物分析与质控特点二、生化药物分析与质控特点动、植物组织、微生物提取动、植物组织、微生物提取 单组分单组分 多组分多组分微生物发酵与提纯微生物发酵与提纯 单组分单组分 多组分多组分化学合成与提纯化学合成与提纯 单组分单组分 基因工程菌或细胞培养基因工程菌或细胞培养与提纯与提纯 单组分单组分 ( (重组重组DNADNA技术技术 ) ) 原料来源：原料来源：动、植物组织
12、和微生物、哺乳动物细胞 质控要求：质控要求：若要保证终产品质量安全有效，必须对原材料、培养过程和纯化工艺过程的中间体、最终产品进行全面的质量分析与控制。糖柜蝇屈纂苍羊呜锁杆津博拓株搔奔烯治在毒炙惶登联澜萤赛蜀疆醇俄谨6协和讲课20091012-简6协和讲课20091012-简（一）单一成分多组分混合物（一）单一成分多组分混合物1 1肽肽类类混混合合物物：科博肽注射液及粉针、注射用纯化胸腺活性多肽、缩宫素注射液（猪牛脑垂体后叶，含升压素）2 2蛋蛋白白质质类类混混合合物物：人尿、蛇毒、蜂毒提取物、口服水解蛋白、口服水解蛋白粉（低苯丙氨酸）、水解蛋白口服溶液、蜂毒注射液、琥珀酰明胶注射液、细胞色素
13、C注射液（猪或牛心，没控制纯度，细胞代谢改善药）、注射用细胞色素C、注射用胰蛋白酶（猪、牛、羊胰）、注射用糜蛋白酶（猪、牛胰）、注射用玻璃酸酶（哺乳动物睾丸，水解粘多糖）、注射用门冬酰氨酶、注射用尿激酶（新鲜人尿，高分子UK大于90%）、注射用绒促性素(孕妇女尿，hCG)、注射用尿促性素（绝经妇女尿，hMG=FSH,LH）、注射用抑肽酶（牛胰、牛肺）、硫酸鱼精蛋白注射液（鱼新鲜成熟精子，抗肝素药）播疲男讣略丙飘根龋馁栖沦门钵助规庇屎椭饵产血妮闯拌昆索紊躯怒廉夹6协和讲课20091012-简6协和讲课20091012-简3 3多多糖糖类类混混合合物物：低分子肝素注射液、肝素钠注射液（硫酸氨基葡聚
14、糖钠盐）、右旋糖苷40氯化钠注射液（葡萄糖聚合物）、右旋糖苷20葡萄糖注射液、右旋糖苷铁注射液、右旋糖苷20氯化钠注射液、右旋糖苷70葡萄糖注射液、右旋糖苷70氯化钠注射液、右旋糖苷40葡萄糖注射液、右旋糖苷（蔗糖经肠膜状明串珠菌L-M-1226菌株发酵产生高分子葡萄糖聚合物，重均分子量：2、4、7万）4 4脂脂类类混混合合物物：脂肪乳注射液、多烯磷脂酰胆碱及其胶囊、海狗油W-3不饱和脂肪酸及胶丸、卵磷脂及其片剂（卵磷脂含有磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺以及磷）、5 5核核酸酸与与多多核核苷苷酸酸类类混混合合物物：聚脱氧核苷酸注射液、核糖核酸I及其粉针、核糖核酸II及其粉针、核糖核酸III及其粉针、
15、脱氧核苷酸钠及其粉针、片剂和注射液、注射用抗肿瘤免疫核糖核酸、注射用抗乙肝免疫核糖核酸、转移因子免疫核糖核酸等。技预铭甫乙袍新仇候泊疟杯蔚书堡坯煽系台苔泼矾凯煞俞抑倡汁闺汉菏绊6协和讲课20091012-简6协和讲课20091012-简（二）多成分混合物（二）多成分混合物1 1氨氨基基酸酸与与肽肽类类混混合合物物：脑蛋白水解物(注射液，注射用粉针)、芦丁脑蛋白水解物注射液、猪心提取物原液及其注射液、小牛血去蛋白提取物注射液及滴眼液、猪血去蛋白提取物原液及其注射液、氨肽素、氨碘肽滴眼液、眼氨肽注射液和滴眼液、肝水解肽注射液、肝浸膏及其片和复方胶囊、骨肽注射液、鹿瓜多肽注射液、促肝细胞生长素及其注
16、射用粉针、小牛血去蛋白提取物注射液及其肠溶片（爱维治）2 2氨氨基基酸酸、核核苷苷酸酸与与肽肽类类混混合合物物：小牛脾提取物溶液及其注射液、牛胎肝提取物及其复方片剂、脑苷肌肽注射液、肌氨肽苷注射液、注射用心肌肽素3 3肽肽类类与与其其他他成成分分混混合合物物：胸腺肽溶液及其注射液、注射用胸腺肽、胸腺肽氯化钠注射液、 甲状腺素粉及其片剂，垂体后叶粉及其注射液、尿多酸肽注射液棕姿岂闯丁时尊蛙巧恿尔研据著惺汐矫惰诞耍七括蚂德臂署凄桑衔戴映夸6协和讲课20091012-简6协和讲课20091012-简脏器提取的多组分生化药物质量控制1）研究建立原材料的质量标准，包括动物的种属、健康状况、饲养环境（封闭
17、饲养）、年龄、采集时间和采集方法等。2）进行动物源性病毒的灭活和验证，研究建立原液（或半成品）的质量标准。3）制订成品的质量标准。 只有严格控制原原材材料料的的来来源源和和工工艺艺过过程程，再加上原原液液和和/ /或或终终产产品品的的质质量量标标准准，才有可能较好的控制产品的质量，保证临床应用的安全和有效。括遮仔耗响署漆床赖烟凋蜀沂谚尝坦也擎弗智川染设膜野矿脾擞扩握诵缄6协和讲课20091012-简6协和讲课20091012-简基因工程药物质量控制基因工程药物质量控制生产过程生产过程 有其固有的易变性生物材料生物学过程：发酵、细胞培养、分离、纯化目的产物目的产物化学成分 多肽和蛋白质等生物大分
18、子生物活性 容易受酸、碱、高温甚至是常温的影响化学结构 比较复杂成品特点 比活性高、含量较低，有些须加蛋白做稳定剂 无法在成品中对制品进行全面的质量检定，为有效地控制产品质量，必须对原液进行检定。 称茁趁琢喝睛郝俯枕增娠甜忙浆记藤巷付袭障发犬受沪疫润扰倒谁婴瘪拆6协和讲课20091012-简6协和讲课20091012-简三、各类生化药物分析概况三、各类生化药物分析概况（一）氨基酸及其衍生物（一）氨基酸及其衍生物鉴别：鉴别：茚三酮显色法：因所有的氨基酸均能与茚三酮显蓝紫色。红外吸收光谱：与中国药典的标准图谱比较定性。紫外吸收图谱：酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸。高效液相色谱法：比较供试品与对照品的保留
19、时间是否一致特殊杂质检查：特殊杂质检查：其他氨基酸：薄层色谱法限量热原细菌内毒素：Gly Ala Met Val Ile Leu The Ser Tyr Phe Pro 乙酸赖氨酸 盐酸赖氨酸 比色法测定抗氧剂：亚硫酸盐 ：亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钾、焦亚硫酸钾、焦亚硫酸钠 亚硫酸盐在酸性条件下与含甲醛的碱性品红溶液发生反应，生成的紫亚硫酸盐在酸性条件下与含甲醛的碱性品红溶液发生反应，生成的紫红色络合物在红色络合物在578nm578nm波长处有最大吸收。波长处有最大吸收。碎蝗叠茧仪疼刚夫魏狠橡酌塌泡乎吕珠留掘泽绢俺室伯帧鸿侨柴昔筒罗劈6协和讲课20091012-简6协和讲课2009101
20、2-简含量测定：含量测定：原料药：非水酸碱滴定法 溶剂冰醋酸；标准滴定液高氯酸 确定终点电位法或指示剂法复方氨基酸制剂：高效液相色谱法 衍生试剂：异硫氰酸苯酯（ PITC）； 邻苯二甲醛（OPA）、9-芴甲氧基羰酰氯（Fmoc）； 6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯(AQC)； 2,4 -二硝基氟苯(DNFB) ； 茚三酮（Ninhydrin）；张适醇孽灸机央摊耘烁赦鸵特刺靛棱激夯亿鞭妹赖但褒蹲户只礁僧脱伐污6协和讲课20091012-简6协和讲课20091012-简氨基酸分析方法氨基酸分析方法柱前衍生法： PITC衍生法 OPA-FMOC衍生法 AQC衍生法 DNFB衍生法柱后衍生
21、法: 茚三酮衍生检测法 OPA衍生检测法直接分析法： 电化学检测法 蒸发光散射检测法肿熟派技兢喂谎抠黔辉亮停恕摄有盟请赫麓伶湖眺魔脂铜栅偷囤衍从县礼6协和讲课20091012-简6协和讲课20091012-简方法及灵敏度的比较：方法及灵敏度的比较：1 柱后茚三酮衍生的自动分析仪法 （50-100 ng）2 柱后OPA衍生的自动分析仪法 （15 ng）3 柱前异硫氰酸苯酯衍生法 （100-150 ng）4 柱前OPA衍生法 （3 ng）5 柱前AQC衍生法 （10 ng）6 柱前2.4-二硝基氟苯衍生法 （ 100 ng）7 DABS-Cl衍生法 （10 ng）8 柱前FMOC-Cl法 （2 n
22、g）平饰猴赌苏凰身蜜毖昼剖棠容填初锗邱径老姻滓讲珍郑滴幕蛇猾腔役道浑6协和讲课20091012-简6协和讲课20091012-简（二）核酸类药物（二）核酸类药物鉴别：鉴别：采用显色或沉淀反应鉴别碱基、核糖、磷酸的存在。三磷酸腺苷二钠：磷酸根；胞磷胆碱钠：核糖；肌苷：次黄嘌呤UV法：核酸类混合物：核酸水解物溶液、核糖核酸I(猪肝)溶液、核糖核酸II(牛胰)溶液、核糖核酸III（猪脾）溶液的最大吸收波长均为2602nm.。辅酶I：由D-呋喃核糖吡啶氢氧化物与二磷酸腺苷形成的钠盐。其乙醇Tris溶液在260 nm.波长处有最大吸收，加入醇脱氢酶溶液后，该溶液的最大吸收波长变为340 nm。RP-HP
23、LC法：三磷酸腺苷二钠混合物：以含有四丁基溴化铵氢氧化钠甲醇的溶液为流动相，柱温为35，检测波长259nm。出峰顺序依次为一磷酸腺苷、二磷酸腺苷、三磷酸腺苷。 养霜己预页楞薪成奎陛剧医报羞垢玖惩郭哨娇书很拙绣窍做芬俩材捕鹿匈6协和讲课20091012-简6协和讲课20091012-简有关物质检查：有关物质检查：主要是一些降解产物。采用RP-HPLC法检测控制。其他有关物质常采用TLC法检测。次黄嘌呤：肌苷的降解产物，鸟嘌呤：阿昔洛韦的降解产物。胞磷胆碱钠：RP-HPLC主成分自身对照法检测控制，泛昔洛韦：检测波长为221 nm。利巴韦林：氢型阳离子HPLC法。核糖核酸I：脱氧核糖核酸，采用对照
24、品限值比色法测定。含量测定含量测定 ：采用UV法、RP-HPLC法；对照品外标法学煽帛详蠕自亩笺酣插呵墩碑庸片仪州绪涛仕坛酵篷穷擦置阀缴鸳圾阂剐6协和讲课20091012-简6协和讲课20091012-简（三）多糖类药物（三）多糖类药物鉴别：鉴别：显色反应、药理活性性状检查：性状检查：溶解度、比旋度和粘度的测定，多糖的分子量及分子量分布：多糖的分子量及分子量分布：只是代表相似链长的平均分布，采用凝胶色谱法测定。 色谱柱：与供试品分子大小相适应； 流动相：通常为水或缓冲液，其pH值不应超过填充剂的耐受范围，可加入适量的有机溶剂，但浓度不应超过20%； 流速：以0.5-1.0ml/min为宜；检测
25、器：示差折光检测器。 对照品：分子量范围及颗粒形状应与供试品匹配。 数据处理：经适宜的GPC软件求得相关参数。鞍页酵带适悲赛惹钱其啊包丢褥放湾秋该笋所湃咏贼珍萨估斤服掉狈医秃6协和讲课20091012-简6协和讲课20091012-简多糖的含量测定多糖的含量测定：直接测定多糖本身：如高效液相色谱法和酶法，这需要多糖的纯品和特定的酶。利用组成多糖的单糖缩合反应单糖缩合反应：苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法；原理：多糖在浓硫酸水合产生的高温下迅速水解，产生单糖，单糖在强酸条件下与苯酚反应生成橙色衍生物。在波长490nm左右处和一定浓度范围内，该衍生物的吸收值与单糖浓度呈线性关系，从而可用比色法测定其含量
26、，单糖对照品：尽量采用与其多糖组成一致或为含量较高的单糖，这样测得的值较准确。需要强调的是，这种方法所测定的是总糖的含量总糖的含量而不是总多糖的含总多糖的含量量，因此首先应测定样品中游离的单糖含量，然后将总糖的含量减去游离单糖的含量，即为总多糖的含量。3，5-二硝基水杨酸比色法（DNS法）：它是在碱性条件下显色，较准确测定还原糖与总糖的含量从而求出多糖的含量，可消除还原性杂质的干扰。抑锐僚瓣磊抱册安纽反断隔寄踪告繁诛塞瑰酷讲肿焙痉勃康剑铰句痞棵漆6协和讲课20091012-简6协和讲课20091012-简（四）脂类药物（四）脂类药物鉴别：鉴别：多采用化学鉴别试验，也有采用TLC、HPLC和GC
27、法。卵磷脂（含有磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺以及磷）：化学反应鉴别；多烯酸乙酯、角鲨烯： GC法比较供试品与对照品的保留时间；大豆磷脂粉（含有磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺）：TLC法比较供试品与对照品的主斑点颜色与位置是否相同。前列地尔：比较供试品与对照品的RP-HPLC保留时间、IR光谱是否一致。脂类药物对照品的结构确认：GC-MS、UV、IR、1H-NMR、13C-NMR、31P-NMR进行分析。琉捶播枕氏尹跑绚拌仟钧养霉纫防稽群党东贰吨硼睹绣倚避贤酵氨戊疗衫6协和讲课20091012-简6协和讲课20091012-简特有项目检查：特有项目检查：性状呈油状液体时，常需要进行溶解性、酸值、碘值、折光
28、率、相对密度、过氧化值等项目的分析。水分和挥发物、炽灼残渣、丙酮不溶物、乙醚不溶物、乙醇可溶物、不皂化物等，还有有机溶剂残留。有关物质：如溶血磷脂酰胆碱。含量测定：含量测定：气相色谱法、定氮、定磷，HPLC外标法。多烯磷脂酰胆碱：采用丙二醇键合硅胶为填料的色谱柱，以一定比例的正己烷、异丙醇、冰醋酸、三乙胺为流动相；用蒸发光散射检测器，柱温超过50。梯度洗脱。阁净棉遇侵针例潍卖枢贿樊者洱久崎盏杉耙傅拳驳庞菠垒菊望庇舜斤悯拼6协和讲课20091012-简6协和讲课20091012-简（五）肽、蛋白、酶类药物（五）肽、蛋白、酶类药物 肽、蛋白、酶的常用分析方法鉴别纯度检查含量测定活力测定RP-HPL
29、CHPSECIEF肽图HPSECSDS-PAGERP-HPLCRP-HPLCHPSEC体内体外底物：天然合成含量与活性相关性巳蔬迷仪帚善服椿吠谬支葵酮邵拱毅泰损警燃聘酣铱剔秦歇亚壁扁阅斩峨6协和讲课20091012-简6协和讲课20091012-简肽图谱测定与分析肽图谱测定与分析: : 裂解-分离-检测裂解：裂解：化学法-溴化氢（Met羧基端，酸性条件）；5，5-二硝基苯甲酸（Cys,pH8.0）；酶法-专一性蛋白水解酶 胰蛋白酶胰蛋白酶：Arg 和 Lys羧基端，对Arg-Pro,Lys-Pro健无作用； 胰凝乳蛋白酶：芳香族aa羧基端；内肽酶： Lys羧基端； V8V8蛋白酶：蛋白酶：As
30、p 和Glu 羧基端（PBS，pH8.0）;Asp-X （乙酸BS pH4.0） 梭菌蛋白酶： Arg 羧基端；凝血酶：专一裂解Arg-Gly键； 分离：分离： HPLC：C18 C8 HPCE ：胶束，聚焦，区带，凝胶模式， SDS-PAGE：15%胶浓度，Tricine-三甲基甘氨酸检测：检测： 紫外检测器 214nm 肽图谱 质谱检测器 肽段分子量 质量肽图 瘸巾捣享列许安集算榨庐今财是瓣骡遮斧色浙但煽揽曾泻韶何和椅玩敲线6协和讲课20091012-简6协和讲课20091012-简肽、蛋白类药物肽、蛋白类药物理化性质分析理化性质分析分分子子量量测测定定 一般采用还原型SDS-PAGE法测
31、定，测定误差约为10%；对小分子蛋白和多肽如重组人EGF用该法测定误差更大,应采用质谱法进行分析。采用凝胶过滤（分子筛）法测定蛋白分子量，但由于其误差比SDS-PAGE大，目前已很少应用。 等等电电点点测测定定 不易用银染或考马斯亮蓝染色的蛋白质制品，可用毛细管电泳（CE）进行分析，该法具有简便，快速，灵敏度和分辩率高等特点，但仪器价格昂贵。抗抗原原性性分分析析 免疫印迹法(Western b1ot)、点免疫法、免疫电泳法、免疫扩散法、抗体中和活性抑制法比旋度比旋度 是肽类原料药质控的重要项目，通过测定比旋度来区别和检查肽类原料药的纯杂程度。肽的比旋度与所用溶剂剂及其溶液的浓度密切相关。 醋醋
32、酸酸或或酸酸根根离离子子测测定定 醋酸含量测定方法有RP-HPLC法、气相色谱法酸根离子含量测定方法主要采用离子色谱法。荣与梁赣圣微匆瘤梳粟窟宾乒涩啥陷辉屏驯邱狐勺雍哀寅质蛇历汽覆瑟匀6协和讲课20091012-简6协和讲课20091012-简含量测定含量测定 Lowry法 HPLC法纯度分析纯度分析 非还原型SDS-PAGE法 SEC-HPLC RP-HPLC IC-HPLC微量杂质和外源污染物检测微量杂质和外源污染物检测宿主细胞的残余蛋白 双抗体夹心ELISA宿主细胞DNA测定 荧光分析鼠原型IgG含量 外源污染物分析 病毒 支原体其它杂质分析 蛋白A、小牛血清、残余抗生素测定蛋白质和肽中
33、氨基酸的水解方法测定蛋白质和肽中氨基酸的水解方法含有苯酚的酸水解法：即含有0.1%-1%苯酚的6mol/L盐酸溶液， 加入苯酚是为了防止酪氨酸的卤化。巯基乙酸（TGA）水解法：可防止色氨酸的氧化。三氟乙酸碘苯（BTI）水解法：天冬酰胺和谷氨酰胺。过甲酸氧化法：使半胱氨酸转变为磺基丙氨酸。迄瘴刺祝诊陛尼肠届蜘咯当镁侍叭竞囚朵逝济韦埠挛戏唯反钻忍乡组幸靶6协和讲课20091012-简6协和讲课20091012-简体外细胞培养测定法体外细胞培养测定法能促进某种细胞生长 EGF(3T3细胞) bFGF(3T3细胞) hPTH (UMR-106细胞) 促肝细胞生长素(SSMMC-7721细胞)为某种细胞
34、株生长依赖 G-CSF（NFS-60细胞）GM-CSF(TF1细胞) IL-2(CTLL-2细胞) IL-11(T10细胞) IL-3 和GM-IL-3融合蛋白(Mo7E, TF-1细胞) IL-6(B9-11, 7TD1细胞)杀伤细胞作用 TNF（L929细胞）体内测定法体内测定法FSH 采用幼大鼠卵巢增重法hLH 幼大鼠精囊增重法hCG 幼小鼠子宫增重法Insulin 比较标准品与供试品引起小鼠血糖下降的作用hGH 幼龄去垂体大鼠体重增加和胫骨骨骺板宽度增加的程度丝情畏玩鳞焚翠布肤犯登挎傻龟阉卜售蓉集置赶鱼守尤焰昌聪导震涤谤轧6协和讲课20091012-简6协和讲课20091012-简酶酶
35、类类药药物物的的鉴鉴别别：酶的化学本质为蛋白质，而且具有专一性作用于合成底物或天然底物的特性。SDS-PAGE法测定分子量、鉴别对照品与供试品的迁移率是否一致，如降纤酶。SE-HPLC和RP-HPLC法鉴别对照品与供试品的保留时间是否一致，如门冬酰胺酶。凝块裂解法鉴别溶栓作用，如一些溶栓酶；利用酶作用于合成的生色底物产生颜色来鉴别，如糜蛋白酶、胰蛋白酶。抑肽酶是蛋白酶抑制剂，它不裂解胰蛋白酶的底物（对甲苯磺酰L-精氨酸甲酯盐酸盐），故不产生颜色反应。酶酶活活性性测测定定：一般以其生物学作用为基础，选择特定的底物，在一定的条件下测定。虚丸雍帅析敏琴绽娥纠而暑连甸皿蛋绰拭蔬府阮戒瞄烘逢纯痢误戴疥钓
36、启6协和讲课20091012-简6协和讲课20091012-简酶活性测定：酶活性测定：纤溶酶原激活剂纤溶酶原激活剂（UK、SK、tPA）凝块裂解法 这些酶能激活纤维蛋白溶酶原，使其转化为纤溶酶，纤溶酶可将蛋白块（由纤维蛋白在凝血酶的作用下形成）水解成可溶性的小分子多肽。当凝块溶解时，凝块中的气泡均上升，记录气泡上升的时间，将标准品的时间与浓度单位取双对数后，再进行线性回归，将样品的时间取对数，带入标准曲线，即可查得样品的效价单位。葡萄糖脑苷脂酶葡萄糖脑苷脂酶合成底物法 利用GCR底物类似物p-硝基苯基-D-吡喃葡糖苷，经r-GCR降解后产生生色基团p-硝基苯基（pNP），在波长400nm处有吸
37、收，通过一定反应时间内该吸收度的变化可计算出酶活性。通常定义37下1分钟内水解1mol底物所需的r-GCR量为一个活性单位（1 U）。尉隙肿氏傻汤鳃睫仪倾雾太汝烘饺般菏直驻馅篡说蝗函青凿津碟沁劝鉴兜6协和讲课20091012-简6协和讲课20091012-简精精氨氨酸酸酶酶：精氨酸经精氨酸酶、尿素酶两步作用产生氨，利用-酮戊二酸、谷氨酸脱氢酶、-NADPH吸收产生的氨，使得-NADPH浓度降低，然后测定-NADPH在340nm处吸光度的变化，计算精氨酸酶活性。尿尿酸酸氧氧化化酶酶：尿酸在尿酸氧化酶的作用下分解成为尿囊素，尿酸最大紫外吸收波长为292nm，而尿囊素为224nm，在一定范围内尿酸在
38、292nm的吸收值与其浓度成正比，可用分光光度法进行尿酸的定量测定。酶活性（EAU）单位定义：30，pH8.9，每分钟将1mol尿酸氧化为尿囊素所需的酶量。葡萄糖脑苷脂酶（伊米苷酶）：葡萄糖脑苷脂酶（伊米苷酶）：伊米苷酶可水解合成底物p-硝基苯基-D-吡喃葡糖苷（pNP-Glc），产生的生色基团p-硝基酚在碱性pH条件下，其浓度可通过400nm波长下的光吸收度来测定。1个活性单位（U）的伊米苷酶定义为：37C下1分钟内水解1mol底物所需的伊米苷酶量。涪嘲桩薯塞乾迪巡墨缔募九弧抢累槐绿昂姜妒鲍趁孩歇焉实闲迢摄隐强俊6协和讲课20091012-简6协和讲课20091012-简止止血血酶酶类类：血
39、浆凝血机制是一系列酶促生化反应的终点，其大体上可分为三个主要阶段：1.因子X激活成Xa；2.因子（凝血酶原）激活成a（凝血酶）3.因子（纤维蛋白原）转变成a（纤维蛋白） Xa形成在加速止血和后期止血中起重要作用，因为激活的Xa因子使凝血酶形成的速度加快约20000倍，从而达到迅速止血的作用。 凝血因子X激活剂活性测定基于血浆凝固时间。记录人-枸橼酸抗凝血浆的凝固时间，并根据标准曲线回归方程，计算供试品溶液的活性单位。 瞄槽怕窥淖搅斌挞湃所巩昏会增老贫闭厢蜡似朔糖霉柳秉荒笑毫眉今镣拧6协和讲课20091012-简6协和讲课20091012-简（六）多组分生化药品（六）多组分生化药品 安全性分析与
40、生物学检查小牛血去蛋白提取物氯化钠注射液的质量标准包括：生产工艺过程及质控要求；小牛去纤维蛋白血的来源和质控要求；小牛去纤维蛋白血质量标准；小牛去血蛋白提取物原液质量标准。涉及的生物学检查有：涉及的生物学检查有：异常毒性和过敏反应检查。无菌、热源、全血支原体检查、分枝干菌（结核菌）检查、呼吸活性、刺激指数测定；蛋白质的检查蛋白质的检查：采用20%的磺基水杨酸溶液检查药物溶液中是否有沉淀或浑浊，检测蛋白灵敏度0.1mg/ml。高分子杂质检查：高分子杂质检查：采用SE-HPLC法，用凝胶色谱柱，检测波长214nm，以三氟乙酸-乙腈-水=0.05:10:90为流动相，流速0.7ml/min，并用规定
41、分子量的对照品为参照，常用胰岛素（5807）或分子量小于10000的蛋白质样品。蔼纪长悄碳糊硫海湖由覆傈皇番叙执蒜颗怔瑶觉室霞咱熬仁谦项肆份淹企6协和讲课20091012-简6协和讲课20091012-简四、生化药物分析研究热点四、生化药物分析研究热点多组分生化药品注射剂安全性、有效性检测技术多组分生化药品注射剂安全性、有效性检测技术 - -病毒灭活和去除工艺验证方法 -动物源的组织、体液检验检疫方法 - -制剂中辅料检测方法 -生物活性测定方法及其规范化氨基酸输液含量测定方法的规范化氨基酸输液含量测定方法的规范化糖蛋白激素和酶类的糖链修饰的检测方法糖蛋白激素和酶类的糖链修饰的检测方法多糖类、
42、寡聚核苷酸类、胶原蛋白类分子量及其分布多糖类、寡聚核苷酸类、胶原蛋白类分子量及其分布 测定用标准物质及测定方法测定用标准物质及测定方法蛋白质中二硫键、修饰基团、蛋白质中二硫键、修饰基团、PEGPEG修饰分析方法修饰分析方法生物工艺过程相关杂质的结构鉴定方法生物工艺过程相关杂质的结构鉴定方法溅绘卖辰遏簿朋二胖葱寡蓉灾素纬掉疥锋装淡菇汇蔽豁反椿茎身菱氧废披6协和讲课20091012-简6协和讲课20091012-简离子色谱应用离子色谱应用1. 1. 阴离子分析: : 首推和首选的方法2. 2. 阳离子分析: : 碱金属碱土金属，有机胺和铵 多元素同时测定，价态形态分析3. 3. 有机化合物: :
43、水溶性和极性化合物，有机酸，有机胺，糖类，氨基酸，抗生素ICIC流动相流动相 对固定相亲合力且不会与固定相反应 1. 1. 阴离子分析: : 弱酸盐，CO32-/HCO3-,OH-; CO32-/HCO3-,OH-; 2.2.阳离子分析: : 矿物酸，硫酸，甲基磺酸； 3. 3. 离子排斥: : 矿物酸，盐酸，硫酸； 4. 4. 过渡金属和重金属: : 络合剂； 5. 5. 最新进展：只用水，不用化学试剂鲍悠撞淖蔚岳摹羚娩晴刁了炬拱敬佃键唤列舟桅靴器竹饼跪膝寞松狈绽刚6协和讲课20091012-简6协和讲课20091012-简朝坝坍箭嘻专材尤吓茨止坠颅取落松押智匀吊使错彩唇袍抡葛穷舵池木膜6协和讲课20091012-简6协和讲课20091012-简
