j目的基因的表达实用教案

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1、第1页/共168页第一页，共169页。遗传信息从DNA到蛋白质的传递过程(guchng)中心法则（central dogma）。 一、基因(jyn)表达：第2页/共168页第二页，共169页。二、克隆基因(jyn)的表达：外源基因(jyn)在宿主细胞中表达。外源基因(jyn)表达载体重组载体导入宿主细胞在宿主细胞中表达出蛋白质提取蛋白宿主细胞：原核细胞或真核细胞。第3页/共168页第三页，共169页。用原核生物(shngw)作宿主A dividing E. coli第一节 外源基因(jyn)在原核细胞中的表达原核(yun h)或噬菌体启动子MCSSD序列终止子第4页/共168页第四页，共169

2、页。识别原核细胞的启动子，催化所有(suyu)的RNA合成。数个相关的结构基因与其调控区结合形成一个表达的协同(xitng)单位。一、原核(yun h)生物基因表达的特点2. 以操纵子为单位1. 只有一种RNA聚合酶第5页/共168页第五页，共169页。53转录(zhun l)mRNA53翻译(fny)蛋白质NC533. 转录和翻译(fny)偶联、连续进行。第6页/共168页第六页，共169页。第7页/共168页第七页，共169页。4. 不含内含子，缺乏转录后的加工(ji gng)系统。5. 调控主要在转录(zhun l)水平上。 含有一个启始密码子和一段同核糖体16SrRNA3末端(m du

3、n)碱基互补的序列，叫Shine-Dalgarno（S-D）序列。6. mRNA的核糖体结合位点Shine-Dalgarno（S-D）sequence:第8页/共168页第八页，共169页。二、原核表达(biod)系统的注意事项!外源基因(jyn)不能带有内含子。2. 必须(bx)用cDNA3. 不能直接用真核基因组DNA。4. 必须利用原核细胞的调控原件（启动子等）5. 防止外源基因产物对宿主细胞的毒害。第9页/共168页第九页，共169页。是DNA上的能与RNA聚合酶结合(jih)并能起始mRNA合成的序列。大肠杆菌的所有(suyu)启动子中都有两段一致顺序（consensus seque

4、nce）。三、原核生物(shngw)基因表达的调控1. 启动子-35 Box 和 -10 Box（1） 启动子序列 第10页/共168页第十页，共169页。consensus sequences第11页/共168页第十一页，共169页。5-TTGACA-35-TATAAT-3 -10box（Pribnow Box）TTGACATATAAT转录(zhun l)起始位点17bp5核糖体结合(jih)位点RNA聚合酶 亚基的识别(shbi)位点 。 -35box第12页/共168页第十二页，共169页。原核启动子共有(nyu)序列的功能第13页/共168页第十三页，共169页。（2）翻译(fny)的

5、起始位点核糖体结合(jih)位点（ RBS）1）Shine-Dalgarno（SD） sequence：mRNA上与核糖体16sRNA结合(jih)的序列。ribosome binding siteSDmRNA 5AGGAGGUAUG16S rRNA3UCCUCCAS-D序列距离AUG的距离也影响翻译第14页/共168页第十四页，共169页。AUG（91%）GUG（8%）UUG（1%）位于(wiy)SD序列下游。ii）起始(q sh)密码：第15页/共168页第十五页，共169页。2.转录(zhunl)终止子内终止子intrinsic terminator：中促使(csh)转录终止的DNA位置

6、有一段反向回文顺序，其后紧接一串A，称为内终止子，形成终止信号。在表达载体(zit)克隆位点的下游一般设计一段转录终止子。启动子操纵子S-D序列目的基因终止子第16页/共168页第十六页，共169页。由于茎环3段紧接一串A/U的配对(pi du)，稳定性比较差，有利于转录物脱落而不利于转录延续。 原因(yunyn)：反向回文顺序(shnx)被转录后，立即形成一个茎环结构，使转录物与模板之间配对的碱基数降低，整个减弱了RNA 与DNA的互作 茎环结构 多聚A/U第17页/共168页第十七页，共169页。5-CCCACAGCCGCCAGTTCCGCTGGCGGCATTTTAA CT TCT TTC

7、T-33-GGGTGTCGGCGGTCAAGGCGACCGCCGTAAAATTGAAGAAAGA-5(模板(mbn)转录(zhun l)5-CCCACAGCCGCCAGUUCCGCUGGCGGCAUUUU-OH-3(RNA)RNA折叠(zhdi)mRNA折叠U CCU GGCAUCGCGGCCGCGGCA ACCCAC UUUU3DNARNA聚合酶脱落第18页/共168页第十八页，共169页。第19页/共168页第十九页，共169页。大肠杆菌偏爱UAA。一般(ybn)安置上全部的三个终止密码防止核糖体跳跃（skipping）。4. 翻译翻译(fny)增增强子强子Translation enha

8、ncer能够显著增强外源基因在大肠杆菌细胞(xbo)中的表达效率的特殊序列。T7噬菌体基因10前导序列（简称g10-L序列）;大肠杆菌atpE基因mRNA5-UTR中富含U的区段。213 .翻译终止密码翻译终止密码第20页/共168页第二十页，共169页。 必须(bx)是一种强启动子能使外源基因的蛋白产量达到(d do)细胞总蛋白的10%-30%以上。应是可诱导型的用温度(wnd)或化学试剂诱导。（1）最佳启动子必须具备的条件）最佳启动子必须具备的条件5. 基因工程常用的原核启动子基因工程常用的原核启动子 p87第21页/共168页第二十一页，共169页。来自大肠杆菌(d chn n jn)的

9、乳糖操纵子。用乳糖或其类似物IPTG充当诱导(yudo)物，与阻遏蛋白结合，解除抑制。PlacO目的(md)基因（2）乳糖启动子lac第22页/共168页第二十二页，共169页。（3）色氨酸启动子trptrpRP1OtrpEtrpDP2trpCtrpBtrpAtrpR阻遏(z )蛋白基因；P1P2启动子；O操纵基因；衰减(shui jin)子来自(li z)大肠杆菌的色氨酸操纵子。第23页/共168页第二十三页，共169页。trpRP1OtrpEtrpDP2trpCtrpBtrpA邻氨基(nj)苯甲酸合成酶吲哚(yn du)甘油硼酸合成酶色氨酸合成酶链链分支(fnzh)酸邻氨基苯甲酸磷酸核糖基

10、邻氨基苯甲酸CDRP吲哚甘油-磷酸色氨酸阻遏物转录（P1是主要启动子，P2的作用只有3%。）没有色氨酸时，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，能转录合成色氨酸所需要的酶。第24页/共168页第二十四页，共169页。trpRP1OtrpEtrpDP2trpCtrpBtrpA阻遏物色氨酸结合(jih)不转录(zhun l)用于表达载体的trp启动(qdng)子一般只包含启动(qdng)基因、操纵基因、和部分trpE基因。P1OtrpE目的基因有色氨酸时，阻遏蛋白与色氨酸结合后才能与操纵基因结合，从而阻止色氨酸合成酶类的转录（称为corepressor）。第25页/共168页第二十五页，共169页。第26页

11、/共168页第二十六页，共169页。第27页/共168页第二十七页，共169页。四、外源蛋白在大肠杆菌(dchnnjn)中的表达部位1. 细胞质中表达(biod)（1）包涵(bo hn)体（inclusion body） P93是存在于细胞质中的一种不溶性蛋白质聚集折叠而成的晶体结构物。形成原理未知。第28页/共168页第二十八页，共169页。在大肠杆菌细胞在大肠杆菌细胞(xbo)(xbo)内表达人生长激素（内表达人生长激素（human growth hormone, human growth hormone, hGHhGH）。）。例：使重组蛋白(dnbi)易于分离、免受蛋白(dnbi)酶降解

12、、不损害寄主细胞回收的蛋白(dnbi)生物活性差。 缺点 优点第29页/共168页第二十九页，共169页。2. 周质中表达(biod)（1）周质（periplasm）格兰氏阴性大肠杆菌位于(wiy)内膜和外膜之间的细胞结构部分。蛋白质从细胞质转运到周质的复杂机理目前不完全(wnqun)清楚优点：容易被浓缩和纯化、有利于正确折叠、被降解的少。第30页/共168页第三十页，共169页。phoA、OmpA、OmpT、OmpF、LamB、-内酰胺酶（lactamase）、肠毒素（enterotoxin）ST-II、LT-B等（3）常用(chn yn)的原核信号肽大肠杆菌(d chn n jn)的信号肽

13、：能带领蛋白穿过膜到达周质。但以后(yhu)需要正确切割掉。（2）信号肽（signal peptide）第31页/共168页第三十一页，共169页。鼠源RNase、人生长激素(shn chn j s)信号肽。也能在细菌(xjn)中起作用。（2 2）真核信号肽胡萝卜欧氏杆菌的PelB蛋白(dnbi)。金黄色葡萄球菌的蛋白A。枯草芽孢杆菌的内切葡聚糖酶 （endoglucanase）。第32页/共168页第三十二页，共169页。由于需要(xyo)穿过两层膜，大肠杆菌只能分泌极少的蛋白质到培养基中，效果都不太理想。用溶血素（hemolysin）基因构建分泌性融合(rngh)蛋白；使在大肠杆菌细胞中表

14、达的外源蛋白(dnbi)分泌到细胞外的培养基中。3. 胞外表达或与细菌素释放蛋白（bacteriocin release protein)共表达。第33页/共168页第三十三页，共169页。第34页/共168页第三十四页，共169页。载体表达出的外源基因蛋白质不与细菌(xjn)的任何蛋白质融合在一起。S-D序列(xli)ATG-外源基因(jyn)-TAG优点五、几种类型的原核表达载体1. 非融合型表达载体产物结构接近于真核细胞体内的蛋白质结构。缺点：容易被宿主菌的蛋白酶所破坏。第35页/共168页第三十五页，共169页。哈佛大学(h f d xu)的Gilbert实验室建立的。表达能力强。（1

15、）pKK223-3 载体(zit)P87组成(z chn)结构： 强启动子: tac（trp-lac）:trp的-35区lacUV5的-10区lac操纵基因操纵基因：乳糖操纵子系统。第36页/共168页第三十六页，共169页。终止子：调节(tioji)基因：Lac I宿主(szh)菌染色体上的乳糖操纵子系统。 如JM105菌。rrnB的强终止子rrnB强终止子S-D插入(ch r)位点区S-D序列和插入位点区：第37页/共168页第三十七页，共169页。tac PLac OS-D插入(ch r)位点区rrnB T宿主(szh)lac I载体(zit)的其余部分：来自pBR322质粒。表达诱导物

16、： IPTG（乳糖的类似物，不会被降解）阻遏物IPTG第38页/共168页第三十八页，共169页。必须(bx)选择一个有lacI的宿主菌。条件(tiojin)：第39页/共168页第三十九页，共169页。载体表达出的外源蛋白质与细菌(xjn)的分泌信号肽连在一起，可被宿主菌分泌到细胞周质中。如：pIN III系列(xli)： 2. 分泌型表达(biod)载体P92pIN III-comA1, pIN III-comA2, pIN III-comA3,（1）组成结构第40页/共168页第四十页，共169页。Ipplac Plac OS-D/ATGompa插入(ch r)位点Ipp（脂蛋白基因(j

17、yn)启动子）和lacUV5启动子。调节基因：lac IS-D序列和起始密码(m m)ATG。分泌信号肽：大肠杆菌外膜蛋白基因ompa。插入位点区（多克隆位点）。 强启动子：第41页/共168页第四十一页，共169页。pIN III-comA1以pBR322为基础构建的。调节(tioji)基因不必借助于宿主的lacI.第42页/共168页第四十二页，共169页。表达出的外源基因产物蛋白是与质粒载体(zit)上的菌体蛋白连接在一起的。启动子：tac操纵基因(jyn)：lacP调节基因(jyn)：lacIS-D序列3. 融合蛋白(dnbi)表达载体系统-pGEX系列P90（1）优点（2）组成结构便

18、于融合蛋白的分离和纯化。22第43页/共168页第四十三页，共169页。lacItac lac OS-D/ATGGST插入(ch r)位点TGAlacPori：pBR322 ori融合(rngh)肽：GST(谷胱甘肽巯基转移酶）GST融合蛋白(dnbi)用Glutathione Sepharose亲和层析柱分离纯化。（3）产物提纯第44页/共168页第四十四页，共169页。（4）产物(chnw)分离用凝血酶或Xa因子可以(ky)把外源蛋白从GST上切下来。柱（column）GST外源蛋白(dnbi)凝血酶外源蛋白柱（column）GSTGST洗脱柱（column）可再利用第45页/共168页第

19、四十五页，共169页。pGEX插入(ch r)区：pGEX-1TCTG GTT CCG CGT GGA TCC CCG GAA TTC ATC GTG ACT GAC TGA CGALeu Val Pro Arg Gly Ser Pro Glu Phe Ile Val Thr AspEcoR IBamH I凝血酶第46页/共168页第四十六页，共169页。 CTG GTT CCG CGT GGA TCC CCG GGA ATT CAT CGT GAC TGA CTGACGLeu Val Pro Arg Gly Ser Pro Gly Ile His Arg AspEcoR IBamH I凝血酶

20、ATC GAA GGT CGT GGG ATC CCC GGG AAT TCA TCG TGA CTGACTGACIle Giu Gly Arg Gly Ile Pro Gly Asn Ser SerEcoR IBamH IXa因子(ynz)pGEX-2X的插入(ch r)区：pGEX-3X的插入(ch r)区：Sma ISma I第47页/共168页第四十七页，共169页。（5）其他融合蛋白(dnbi)系统P91His-tag（组氨酸标签(bioqin)）：在外源多肽(du ti)的N端或C端接上6个组氨酸（His）。His-tag能与Ni2+柱结合，但很容易被EDTA（或咪唑溶液）洗脱下来

21、，可以纯化蛋白质。第48页/共168页第四十八页，共169页。5-TTGACA-35-TATAAT-3 -35box -10box（Pribnow Box）六、影响外源基因表达效率(xio l)的因素1. 启动子的结构(jigu)对表达效率的影响RNA聚合酶 亚基的识别(shbi)位点（1）一致顺序第49页/共168页第四十九页，共169页。（2）-35区与-10区之间的距离(jl)间隔(jin g)为17bp时，启动子最强。（3） -35区和-10区的碱基顺序(shnx)越接近一致顺序，启动子越强。5-TTGACATATAAT一致顺序lactrpPLrecAtac Itac II5-TTTA

22、CATATGTT5-TTGACATTAACT5-TTGACAGATACT5-TTGATATATAAT5-TTGACATATAAT5-TTGACATTTAAT-35box-10box第50页/共168页第五十页，共169页。5-AGGAGGU-3S-D序列后面(hu mian)的4个碱基：如果是A（T）, 翻译效率最高；如果是G（C）,效率只有50%或25%。2. 翻译起始(q sh)序列对表达效率的影响（1）S-D序列(xli)？第51页/共168页第五十一页，共169页。AUG左侧(zu c)的三个碱基也有影响。（2）起始(q sh)密码AUG-半乳糖苷酶的mRNA中：AUG左侧(zu c)

23、如果是UAU或CUU时，最为有效；如果是UUC、UCA或AGG时下降20倍。第52页/共168页第五十二页，共169页。SD序列(xli)与翻译起始密码子之间的距离为3-9个碱基。 在翻译起始区周围的序列(xli)不易形成明显的二级结构。（3） 其它(qt)第53页/共168页第五十三页，共169页。3. 启动子与外源基因(jyn)之间的距离第54页/共168页第五十四页，共169页。转录终止(zhngzh)区的存在保证载体不会转录非必须基因，不必浪费源量和能量、不会干扰正常的表达。增加载体的拷贝数会增加转录出的mRNA数目。增加表达(biod)效率。4. 转录终止(zhngzh)区对表达效率

24、的影响5.载体拷贝数及稳定性对表达效率的影响6.外源蛋白在菌体中的稳定性对表达效率的影响但过度的外源基因的表达会影响宿主的正常生长。第55页/共168页第五十五页，共169页。选择(xunz)强启动子序列，如tac 等七、提高表达水平(shupng)常用的方法2. 调整(tiozhng)S-D序列与AUG碱的距离距离过长或过短都影响真核基因的表达。根据不同的启动子选择不同的距离。3. 改变起始密码下面的几组密码子一般为3-9bp。能提高翻译的起始效率。第56页/共168页第五十六页，共169页。4. 增加(zngji)mRNA的拷贝数和稳定性5. 减轻(jinqng)宿主细胞的代谢负荷合理地调

25、节(tioji)代谢负荷与外源基因高效表达的关系。将宿主生长代谢与外源基因表达分开。（1）诱导表达 一般采用温度诱导或药物诱导。去除转录物内的衰减和非特异终止，加入抗终止的序列元件，加放正常转录终止序列。选用RNase缺失的受体菌第57页/共168页第五十七页，共169页。cI857阻遏物有活性，抑制PL启动子，外源基因(jyn)不表达，宿主大量生长。32C:42C:cI857阻遏物失活，PL启动子启动，外源基因高水平表达(biod)，宿主生长受到限制。cI857PL外源基因(jyn)PO PL启动子是温度诱导型第58页/共168页第五十八页，共169页。调节(tioji)基因lac I（位于

26、宿主基因组内或载体上）始终产生阻遏物。无IPTG:阻遏物与lac操纵基因结合，抑制外源基因转录。宿主(szh)大量生长。有IPTG:阻遏物与IPTG结合，lac操纵基因解放，外源基因大量转录(zhun l)。宿主生长受抑制。tac启动子是药物诱导型第59页/共168页第五十九页，共169页。（2）表达载体诱导(yudo)复制 将宿主的生长与载体的复制(fzh)分开。当宿主大量生长后，再诱导(yudo)载体制粒的复制，增加拷贝数。当需要宿主大量生长时，抑制载体质粒的复制。第60页/共168页第六十页，共169页。N末端：由原核基因编码(bin m)一段多肽，C末端：是完整的真核外源基因。（1）设

27、计成融合(rngh)蛋白 这是避免被降解(jin ji)的最好措施。质粒基因产物目的基因产物NC切割6. 提高表达产物的稳定性防止被宿主的酶降解。第61页/共168页第六十一页，共169页。使用次黄嘌呤核苷（lon）缺陷型菌株，减少宿主菌的蛋白酶合成。大肠杆菌的htp R基因(jyn)突变也减少蛋白酶的降解作用。T4噬菌体的pin基因(jyn)产物能抑制细菌的蛋白酶。可把pin增加到载体上。（2） 使用突变(tbin)菌株，保护外源蛋白不被降解 减少宿主(szh)菌本身的蛋白酶的表达。第62页/共168页第六十二页，共169页。（3）表达分泌(fnm)蛋白 细胞质外膜内膜周间质质粒染色体“外排

28、”： 蛋白质从细胞质跨过内外(niwi)膜到培养液中。“分泌”： 蛋白质从细胞质跨过内膜到周间质中。第63页/共168页第六十三页，共169页。细菌(xjn)蛋白分泌的条件：位于N端，一般为15-30aa 。真核与原核的结构相似, 功能(gngnng)相似，可以互换。 碱性(jin xn)氨基酸N疏水氨基酸核心区切割位点Arg、LysLeu、IleAlaGlySer信号肽酶外源蛋白 有信号肽。第64页/共168页第六十四页，共169页。 细胞内的转运(zhun yn)机制。真核细胞中的分泌蛋白(dnbi)能在大肠杆菌中很好地分泌表达；但非分泌蛋白(dnbi)很难在大肠杆菌中分泌。信号(xnho

29、)肽酶I、信号(xnho)肽酶II等近20多种蛋白质的参与。 蛋白质内有与分泌相关的aa 序列。为蛋白指明目的地。第65页/共168页第六十五页，共169页。九、外源蛋白质表达(biod)后的正确修饰分子(fnz)内二硫键、分子(fnz)间二硫键。二硫键异构酶催化。使蛋白质能够正确折叠。1. 形成(xngchng)正确的二硫键 第66页/共168页第六十六页，共169页。人胰岛素分子(fnz)第67页/共168页第六十七页，共169页。抗体(kngt)分子人血红蛋白(xuhng dnbi)分子第68页/共168页第六十八页，共169页。如信号肽、内含(ni hn)肽（intein）等序列的切割

30、。2. 前体切割(qig) 第69页/共168页第六十九页，共169页。（1）O-糖基化（Ser, Thr）增加蛋白质的稳定性和某些特殊(tsh)性质。3. 蛋白质糖基化 糖基第70页/共168页第七十页，共169页。（2）N-糖基化（Asn）Dol：长醇Mannose：甘露(gnl)糖Glucose：葡萄糖N-AcGlc：N乙酰氨基(nj)葡萄糖第71页/共168页第七十一页，共169页。磷酸化、乙酰化、硫酸(li sun)化、丙烯酸化、羰基化、豆冠酸化、软脂化4. 氨基酸残基的修饰(xish) 羟脯氨酸甲基组氨酸羟赖氨酸羧基(su j)谷氨酸第72页/共168页第七十二页，共169页。缺乏

31、(quf)蛋白质的加工。（如糖基化、氨基酸修饰等）。十、原核细胞表达(biod)的缺陷第73页/共168页第七十三页，共169页。酵母菌、植物原生质体、动物(dngw)培养细胞等。第二节 外源基因(jyn)在真核细胞中的表达真核或病毒(bngd)启动子MCSPolyA信号终止子外源基因第74页/共168页第七十四页，共169页。 能在中克隆(k ln)和扩增。1. 酵母(jiom)克隆载体一、在酵母(jiom)中表达P275Leu2+、His+、Ura3+、Trp1+; 有合适的克隆位点。 有酵母的选择标记Ori有大肠杆菌的选择标记Ampr、Tetr。第75页/共168页第七十五页，共169页

32、。Dividing Saccharomyces cerevisiae (bakers yeast) cells第76页/共168页第七十六页，共169页。由大肠杆菌(d chn n jn)质粒和酵母的DNA片断（选择标记）构成。ColE1酵母(jiom)Leu 2+如 PYeleu10:（1）整合型载体(zit)(YIp) 第77页/共168页第七十七页，共169页。转化(zhunhu)率低（1-10转化(zhunhu)子/微克DNA）。特点(tdin)：载体上只有细菌的复制区，没有酵母(jiom)的自主复制区。可与受体细胞的染色体DNA同源重组，随染色体一起复制。不能在酵母细胞中自主复制整合

33、到酵母的染色体上不能从酵母细胞中提取载体。第78页/共168页第七十八页，共169页。由大肠杆菌质粒和酵母的DNA片断(选择(xunz)标记和酵母DNA自主复制顺序ARS）构成。大肠杆菌(d chn n jn)质粒酵母(jiom)ARS（2）复制型载体(YRp) 酵母选择标记第79页/共168页第七十九页，共169页。ARSARS（automously replicating sequence）:ATTTTATATTTAT G T250bp保守(boshu)区第80页/共168页第八十页，共169页。特点(tdin)：转化(zhunhu)率高（102-103转化(zhunhu)子/微克DNA)

34、 。不稳定，容易(rngy)丢失。可从大肠杆菌和酵母中提取质粒。既能在大肠杆菌中复制，又能在酵母细胞中自主复制。穿梭载体（shuttle vector）第81页/共168页第八十一页，共169页。在YRp质粒中插入(ch r)酵母染色体的着丝粒区。特点(tdin)：YRp质粒酵母(jiom)着丝粒（3）着丝粒质粒(YCp) 不易从细胞中提取。行为像染色体，能稳定遗传。单拷贝存在。第82页/共168页第八十二页，共169页。由大肠杆菌(d chn n jn)质粒、2m质粒及酵母染色体DNA选择标记构成。大肠杆菌(d chn n jn)质粒酵母(jiom)选择标记2m质粒如pYF92:pBR322

35、2m酵母his 3+（4）附加体型载体(YEp) 第83页/共168页第八十三页，共169页。2 m质粒：质粒：酿酒酵母的内源质粒，长度(chngd)是2m 。含有自主复制起始区ori和STB序列（使质粒在供体中维持稳定）。第84页/共168页第八十四页，共169页。特点(tdin)：很高的转化活性（103-105转化子/微克DNA）.拷贝数多（25-100分子(fnz)/细胞）。比YRp稳定。第85页/共168页第八十五页，共169页。YEp24第86页/共168页第八十六页，共169页。Leu- 酵母(jiom)原生质体感受态酶去壁CaCl2、PEG整合(zhn h)到染色体上，或独立在酵

36、母细胞内转化(zhunhu)Leu营养缺陷型培养基筛选转化子克隆生长酵母载体大肠杆菌提取插入外源基因鉴定克隆发酵表达外源基因产物分离、纯化2. 酵母转化和表达的一般过程 第87页/共168页第八十七页，共169页。 （1）优点(yudin)对其遗传学和生理学的研究比较深入。小量培养和大规模反应器中都能生长。已经分离出很强的启动子。有翻译后的加工(ji gng)。本身自然分泌很少，便于胞外蛋白的纯 化。安全性高（FDA确认的安全生物），不 需要宿主的安全性检验。3. 酵母表达(biod)系统的特点 第88页/共168页第八十八页，共169页。常常发生(fshng)质粒丢失。重组蛋白常常超糖基化表

37、达(biod)量普遍低。（2）缺点(qudin)每个N-寡糖链上含有100多个甘露糖，分泌困难。正常的高甘露糖寡糖链上仅有8-13个甘露糖。分泌型蛋白有时会留在壁膜间隙，第89页/共168页第八十九页，共169页。4. 在啤酒酵母中表达的重组(zhn z)蛋白第90页/共168页第九十页，共169页。24第91页/共168页第九十一页，共169页。（1）细胞质内表达(biod)例：人Cu/Zn-SOD在酵母(jiom)中表达：5. 在啤酒酵母中表达(biod)外源蛋白的方式超氧化物H+H2O2H2O过氧化物酶表达出的SOD修饰正确：起始氨基酸被切掉，第二个氨基酸丙氨酸也被乙酰化。SOD(超氧化

38、物歧化酶)第92页/共168页第九十二页，共169页。宿主：亮氨酸合成缺陷(quxin)型酵母。GAPD：甘油醛磷酸(ln sun)脱氢酶第93页/共168页第九十三页，共169页。（2 2）表达分泌）表达分泌(fnm)(fnm)型蛋白型蛋白在啤酒酵母中，只有(zhyu)分泌型的蛋白质才能被糖基化。需要糖基化的重组蛋白必须是分泌蛋白。方法(fngf)：构建载体构建载体在重组蛋白的前面加一段编码酵母菌交配类型因子a1的前导肽，与重组蛋白的N端通过Lys-Arg相连。前导肽（leader peptide）：第94页/共168页第九十四页，共169页。蛋白(dnbi)质分泌到壁膜间隙时，酵母菌的内切

39、蛋白(dnbi)酶识别这个切点信号，把重组蛋白(dnbi)正确切下来。信号肽的切割(qig)：前导(qindo)肽Lys-Arg重组蛋白（水蛭素）内切蛋白酶第95页/共168页第九十五页，共169页。6.6.其它酵母表达其它酵母表达(biod)(biod)系统系统（1）乙肝表面抗原在嗜甲烷(ji wn)酵母中表达在大型发酵反应器中容易生长(shngzhng)；以甲醇作唯一的碳源和能源，成本低。有甲醇时，表达的乙醇氧化酶高达胞内总蛋白的40%！嗜甲烷酵母（Pichia pastoris）的特点第96页/共168页第九十六页，共169页。HBsAg: 乙肝表面抗原。可以作为疫苗。Aox1：乙醇氧化

40、酶基因1启动子（受甲醇激活调控）。His4：组氨酸合成所需的组氨酸脱氢酶基因。3-aox1：整合到特定(tdng)染色体的位点序列。表达(biod)(biod)载体构建（整合型）：诱导(yudo)物：甲醇。产量：9106剂疫苗/240L发酵罐。第97页/共168页第九十七页，共169页。整合(zhnh)到染色体中第98页/共168页第九十八页，共169页。（2 2）牛溶菌酶）牛溶菌酶C2C2在嗜甲醇在嗜甲醇(ji chn)(ji chn)酵酵母中的表达母中的表达作为(zuwi)饲料添加剂促进反刍动物消化。产量(chnling)：10L，200h连续发酵产出50g溶菌酶。第99页/共168页第九

41、十九页，共169页。二、昆虫二、昆虫(knchng)(knchng)培养细胞培养细胞表达系统表达系统1. 杆状病毒（Baculovirus）广泛侵染包括(boku)许多昆虫在内的无脊椎动物。（1）侵染(qn rn)周期：两种形式单独病毒粒子形式病毒粒子宿主细胞病毒粒子侵染释放第100页/共168页第一百页，共169页。病毒(bngd)粒子宿主(szh)细胞侵染(qn rn)宿主细胞侵染合成多角体蛋白裂解释放多面体溶解一般使用苜蓿银纹夜蛾细胞核型多角体病毒（Autographa california multiple nuclear polyhedrosis virus，AcMNPV）多面体形式

42、多面体形式第101页/共168页第一百零一页，共169页。（2 2）杆状病毒的表达）杆状病毒的表达(biod)(biod)特点特点感染后36-48h，病毒开始(kish)合成大量的 多角蛋白。多角蛋白的启动子特别强。多角蛋白基因可以被替换掉而不影响 病毒(bngd)的繁殖。第102页/共168页第一百零二页，共169页。多角体基因被外源基因取代后，病毒仍然能形成(xngchng)有感染能力的病毒粒子，但不能形成(xngchng)多面体。3. 转化(zhunhu)子筛选通过显微镜检查看是否(sh fu)有多面体形成。源自草地夜蛾的细胞株，在这种细胞中，多角蛋白的启动子特别活跃。2. 最普遍应用的

43、宿主细胞株最普遍应用的宿主细胞株第103页/共168页第一百零三页，共169页。（1）转移(zhuny)载体的构建大肠杆菌质粒，插入两段AcMNPV序列以供同源(tn yun)重组。4. 4. 杆状病毒转化杆状病毒转化(zhunhu)(zhunhu)载体载体杆状病毒的基因组太大（13kb环状DNA），不能直接插入。必须使用同源重组的办法。多角蛋白的启动子和终止子及polyA加尾信号。启动子与终止子之间插入多克隆位点第104页/共168页第一百零四页，共169页。转移(zhuny)载体第105页/共168页第一百零五页，共169页。（2 2）杆状病毒载体转化）杆状病毒载体转化(zhunhu)(z

44、hunhu)过程过程 转移载体中插入(ch r)外源基因 转移(zhuny)载体与野生型AcMNPV DNA共同转染宿主细胞 转移载体与病毒基因组发生双交换 外源基因被交换转入病毒基因组中 重组病毒侵染宿主4-5天后即可收获重组蛋白。第106页/共168页第一百零六页，共169页。第107页/共168页第一百零七页，共169页。4.4.目前已经用杆状病毒在真核生物细胞目前已经用杆状病毒在真核生物细胞(xbo)(xbo)中表达的外源蛋白中表达的外源蛋白第108页/共168页第一百零八页，共169页。5. 5. 杆状病毒大规模表达存在杆状病毒大规模表达存在(cnzi)(cnzi)的问题的问题杆状病

45、毒侵染昆虫幼虫，在幼虫体内(t ni)表达外源蛋白，成为“低成本蛋白工厂”。22只粉蚊夜蛾幼虫4天后表达的人腺苷酸脱氢酶占幼虫总蛋白的2%-5%。共产出9mg很纯的产物。（1）寿命短感染4-5天后宿主细胞裂解(li ji)或幼虫死亡。（2）共同转染率低重组率更低。0.1%-1%。第109页/共168页第一百零九页，共169页。三、外源基因(jyn)在植物中表达根瘤(gnli)存在于能引起(ynq)植物形成冠瘿瘤的土壤农杆菌中，诱导冠瘿瘤形成，又称肿瘤诱导质粒（tumor inducing plasmid）。1. Ti质粒质粒: 第110页/共168页第一百一十页，共169页。Ti plasmi

46、d第111页/共168页第一百一十一页，共169页。环状双链DNA，105105bp（185kb）(相当于细菌(xjn)染色体的3%-5%）。（1）Ti质粒的结构(jigu)第112页/共168页第一百一十二页，共169页。 转移DNA，编码(bin m)冠瘿碱的合成，能随机整合到植物的染色体上。长度一般为12-24kb，是Ti质粒最重要的部分。左边界(binji)右边界(binji)生长素基因细胞分裂素基因冠瘿碱合成T-DNA（transfer-DNA）生长素基因:iaaM（tms1）和iaaH（tms2）编码合成吲哚乙酸（植物生长激素）的酶iaaM: 色氨酸-2-单加氧酶第113页/共16

47、8页第一百一十三页，共169页。色氨酸-2-单加氧酶色氨酸吲哚(yn du)-3-乙酰胺iaaH:吲哚(yn du)-3-乙酰胺水解酶吲哚(yn du)-3-乙酰胺水解酶吲哚-3-乙酰胺吲哚乙酸细胞分裂素基因tmr（ipt）：异戊烯转移酶, 催化：二磷酸异戊烯（IPP）异戊烯酰嘌呤单磷酸（IPA）5-AMP第114页/共168页第一百一十四页，共169页。章鱼(zhn y)碱（octopine)胭脂(yn zhi)碱（nopaline）NH-(CH2)3-CH-COOHNHCH3-CH-COOHHN=CNH2NH-(CH2)3-CH-COOHNHHOOC-(CH2)2-CH-COOHHN=CN

48、H2Arg与丙酮酸缩合成(hchng)Arg与酮戊二醛缩合成冠瘿碱（opine）的类型和化学结构第115页/共168页第一百一十五页，共169页。农杆碱（agropine）冠瘿碱（opine）的作用(zuyng)冠瘿碱是在冠瘿瘤内合成并分泌出来(ch li)的，是农杆菌的碳源和氮源。大部分其他土壤微生物都不能利用冠瘿碱。Glu的二环糖衍生物。第116页/共168页第一百一十六页，共169页。毒性(d xn)基因（vir）决定土壤农杆菌对植物的感染和T-DNA的转移， 进入(jnr)和整合。vir的产物能诱导Ti质粒产生T-DNA区域的单链拷贝。单链拷贝从Ti质粒脱离后，可与vir的产物VIR

49、D2蛋白结合，并在VIR D4和VIR B蛋白的帮助下穿过浓杆菌(gnjn)内膜、外膜、壁和植物细胞壁、细胞膜及核膜，最后整合到植物染色体上。单链的5端是右边界区域，含有25bp重复序列，参与整合。第117页/共168页第一百一十七页，共169页。章鱼(zhn y)碱代谢基因和胭脂碱代谢基因： 冠瘿碱代谢(dixi)基因分别编码代谢这两种冠瘿碱的酶。维持农杆菌(gnjn)生长。第118页/共168页第一百一十八页，共169页。（1）第一步:植物(zhw)受伤植物受伤后能分泌酚类化合物（如乙酰丁香酮、羟基乙酰丁香酮），诱导Ti质粒上的毒性基因(jyn)表达。2. 农杆菌的感染(gnrn)和生存第

50、119页/共168页第一百一十九页，共169页。（1）第二步 感染(gnrn)植物（3）第三步 毒性基因(jyn)（vir）表达T-DNA上的产物催化(cu hu)产生过量的生长素和细胞分裂素，形成植物冠瘿瘤。脓杆菌吸附于植物的表面伤口部位（常在茎的基部）。virA、virG、virD、virB（4）第四步 T-DNA转移T-DNA被vir基因产物切下来，并运送到植物细胞核里，整合到植物基因组中。（5）第五步 诱导冠瘿瘤第120页/共168页第一百二十页，共169页。第121页/共168页第一百二十一页，共169页。（6）第六步 土壤(trng)农杆菌代谢冠瘿碱。第122页/共168页第一百二

51、十二页，共169页。3.Ti质粒的种类(zhngli)根据(gnj)所编码的冠瘿碱（opine），分为（1）章鱼(zhn y)碱（octopine)型质粒第123页/共168页第一百二十三页，共169页。（3）农杆碱（agropine）型质粒（2）胭脂(yn zhi)碱（nopaline）型质粒第124页/共168页第一百二十四页，共169页。裸子植物、双子叶被子植物(biz-zhw)、禾谷类单子叶植物（玉米）。（1）能够(nnggu)自发地整合到植物的染色体上。（2）能转化多种植物。（3）强启动子4. Ti质粒转化(zhunhu)的对象5. Ti质粒作为载体的可能性T-DNA的opine合成

52、酶基因上有一个强启动子，能启动外源基因的表达。25第125页/共168页第一百二十五页，共169页。（1）分子量太大（120kb）！（2）限制性酶切位点太多。（3）被转化(zhunhu)的植物细胞成为肿瘤，不能 再分化。（4）在大肠杆菌中不能复制。6. 天然(tinrn)Ti质粒作载体的缺点第126页/共168页第一百二十六页，共169页。（4）冠瘿碱合成(hchng)对于植物无意义。应剔除掉。（5）加入大肠杆菌(d chn n jn)的ori和选择标记。（6）加上真核生物的转录(zhun l)信号和结束信号以 及添加polyA的信号序列。（1）保留T-DNA的转移功能部分（vir基因， 左右

53、边界）。（2）减少限制性酶切位点，引入单一插入位 点。（3）取消T-DNA的致瘤基因，使被转化的植 物细胞不再成为肿瘤，能正常分化。7. Ti质粒的改造第127页/共168页第一百二十七页，共169页。改造(gizo)后的Ti质粒载体模式leftrightMCSAMProriVirselect第128页/共168页第一百二十八页，共169页。8. Ti8. Ti载体(zit)(zit)的类型（1）共整合）共整合(zhn h)载体（载体（cointegrate vectors）最早获得(hud)广泛应用的Ti质粒是比利时科学家等1983年改造的pGV3850需要同源重组才能插入外源基因。 pGV

54、3850的特点：的特点：是一种受体质粒，外源基因不能直接插入，而是需要借助于pBR322质粒作为中间载体。第129页/共168页第一百二十九页，共169页。第130页/共168页第一百三十页，共169页。宿主土壤农杆菌的选择标记是位于中间载体(zit)pBR322上的卡那霉素抗性（Kanr）基因。1）脓杆菌选择(xunz)标记2）最终(zu zhn)受体植物的选择标记 选择标记卡那霉素抗性（ Kanr ）基因（卡那霉素对植物有剧毒！）第131页/共168页第一百三十一页，共169页。 外源基因插入(ch (ch r)pGV3850r)pGV3850的过程第132页/共168页第一百三十二页，共

55、169页。转化(zhunhu)后可诱导愈伤组织分化成转基因植物第133页/共168页第一百三十三页，共169页。（2）双元载体(zit)（binary vectors）既有大肠杆菌复制起点也有农杆菌复制起点，是个穿梭(chun su)载体。Ti质粒被剔除(tch)了T-DNA、冠瘿碱代谢基因、vir基因。大幅度减小质粒的体积。（10kb）双元载体的结构Ti的精髓：Vir基因（转移）和左右界（整合）第134页/共168页第一百三十四页，共169页。第135页/共168页第一百三十五页，共169页。双元载体(zit)(zit)的转化转化农杆菌之前，所有(suyu)的克隆步骤都在大肠杆菌里操作。受体

56、农杆菌内要求带有整套vir基因(jyn)（但缺失T-DNA及左右边界）的“帮助质粒”提供vir产物。1）基因插入2）帮助质粒（ helper plasmid）Vir产物使双元载体上的T-DNA左右边界及其外源基因转入到植物细胞，并整合到植物染色体上。第136页/共168页第一百三十六页，共169页。左右外源基因(jyn)双元载体(zit)Vir帮助(bngzh)质粒农杆菌Vir农杆菌左右外源基因感染植物转化左右外源基因进入植物细胞核，整合，表达第137页/共168页第一百三十七页，共169页。（3）三亲融合(rngh)法(triparental matig)含双元载体(zit)的大肠杆菌：含有

57、(hn yu)外源基因和左右边界。含有帮助质粒的辅助细菌：含vir基因。受体农杆菌（空）：三种菌混合培养，然后通过各自的抗菌素抗性标记选择吸收了外源基因、左右界、和Vir的农杆菌。三亲三亲第138页/共168页第一百三十八页，共169页。四、在哺乳动物细胞(xbo)中表达1.动物细胞基因(jyn)克隆和表达载体-SV40病毒常用(chn yn)的SV40载体，是从猿猴空泡病毒SV40（simian vacuolating virus40）改造而来的。第139页/共168页第一百三十九页，共169页。 20面体外壳(wi k)：由VP1、VP2和VP3三种病毒外壳蛋白(dnbi)构成。5243b

58、p的环状双链。 DNA：（1） SV40病毒(bngd)的结构第140页/共168页第一百四十页，共169页。SV40猿猴(yunhu)细胞细胞(xbo)裂解释放(shfng)SV40啮齿类细胞细胞癌变SV40DNA整合到寄主染色体上permissivenonpermissive（2）SV40感染和生存方式第141页/共168页第一百四十一页，共169页。T-抗原(kngyun)（tumor antigen）:两个6聚体的T抗原结合在SV40 DNA的复制起始点上，分别向相反方向移动，将双链DNA解螺旋(luxun)。随后单链DNA结合蛋白（ssB）与解开的单链DNA结合维持解旋状态。(3)

59、SV40 DNA的复制(fzh)解链SV40编码的蛋白。功能是在SV40 DNA复制的时候解开DNA双链。第142页/共168页第一百四十二页，共169页。第143页/共168页第一百四十三页，共169页。第144页/共168页第一百四十四页，共169页。T抗原(kngyun)SV40 DNA双链第145页/共168页第一百四十五页，共169页。 SV40 SV40 复制(fzh)(fzh)起始位点5-CTCACTACTTCTGGAATAGC3-GAGTGATGAAGACCTTATCG120早期(zoq)回文序列TCAGAGGCCGAGGCGGCCTCGGCCTCTAGTCTCCGGCTCCG

60、CCGGAGCCGGAGA2147T抗原(kngyun)结合位点GCATAAATAAAAAAAATTAGTCCGTATT TATTTT TTTTAATCAG富含AT区4869第146页/共168页第一百四十六页，共169页。早期(zoq)表达区：(4) SV40病毒的转录(zhun l)和翻译编码(bin m)大T抗原（控制DNA复制）和小t抗原。晚期表达区：在DNA复制一段时间后表达，产物是VP1、VP2和VP3三种外壳蛋白。第147页/共168页第一百四十七页，共169页。对非受纳细胞（non permissive cells），只有T 抗原表达(biod)，随后病毒基因组随机整合到宿主染

61、色体上。SV40整合(zhn h)(5) SV40病毒(bngd)的整合有严格的包装限制。如果插入的外源基因过大，就无法包装。(6) SV40病毒的包装病毒的包装第148页/共168页第一百四十八页，共169页。去掉一部分DNA(T抗原(kngyun)或者VP基因）。助手(zhshu)型SV40去掉(q dio)T抗原基因的病毒，保留晚期复制启动子。提供外壳蛋白。(7) SV40基因组的改造不能复制，但能包装。第149页/共168页第一百四十九页，共169页。需要这两种缺陷型病毒混合感染，才能互补。既能使插入SV40的外源基因(jyn)复制，又能使外源基因(jyn)被包装进病毒颗粒，得以扩增。

62、去掉(q dio)VP基因，插入外源基因的病毒，保留早期表达启动子。不能包装，但能复制。重组(zhn z)型SV40包装重组型SV40提供重组DNA和T抗原。第150页/共168页第一百五十页，共169页。助手型SV40: 提供VP外壳(wi k)蛋白。重组型SV40： 提供(tgng)T抗原。包装成的病毒(bngd)颗粒中，既有含外源基因的重组型，又有助手型DNA。(8) SV40混合传染过程感染细胞，整合第151页/共168页第一百五十一页，共169页。用复制起点(qdin)有缺陷的SV40病毒侵染的猴细胞株CV-1得到的。所以称COS（CV-1，Origin, SV40）病毒不能复制，但

63、能产生T抗源（类似重组型SV40）。DNA整合到猴染色体上。所以(suy)COS细胞中只有T抗原，无游离的SV40DNA。(9) COS细胞(xbo) COS细胞的特点：有SV40的T抗原。有利于SV40来源的载体复制第152页/共168页第一百五十二页，共169页。第153页/共168页第一百五十三页，共169页。利用(lyng)COS细胞扩增外源基因第154页/共168页第一百五十四页，共169页。只保留SV40的复制起始(q sh)区（ori）、早期区域（T抗原）的启动子、Poly A化位置以及t抗原的内含子。如pSV2:a区: 1-323bp，SV40的复制(fzh)起始区、T抗原启

64、动子、转录起始区。b区：324-3369bp，pBR322的复制(fzh)起始区、 氨苄青霉素抗性基因。c区：3370-4217bp，t抗原内含子（拼接信 号）、 Poly A化位置。d区：外源基因插入位置。(10) SV40 DNA载体(zit)第155页/共168页第一百五十五页，共169页。电刺激(cj)或脂质体转化法送入动物细胞。第156页/共168页第一百五十六页，共169页。不需要包装，可插入10kb以上的外源基因。既能在大肠杆菌中增殖，又能转染哺乳动物细胞。受感染(gnrn)的动物细胞不会裂解，能建立稳定的细胞株。pSV2的特点(tdin)：不能在猴细胞中复制（没有(mi yu)

65、T抗原）。在哺乳动物中存在的途径是整合到染色体上。第157页/共168页第一百五十七页，共169页。GPT：Glutamic-Pyruvic Transferase（谷氨酸-丙酮酸转氨酶，谷丙转氨酶）第158页/共168页第一百五十八页，共169页。pcDNA3Invitrogen Corporation 第159页/共168页第一百五十九页，共169页。CAT：chloramphenicol acetyl transferase（氯霉素乙酰转移酶）（用于分析(fnx)表达量）第160页/共168页第一百六十页，共169页。第161页/共168页第一百六十一页，共169页。第162页/共168

66、页第一百六十二页，共169页。2. 人乳多空BK病毒(bngd)载体人乳多空BK病毒（human papova BK virus）能以多拷贝(kobi)（多于500拷贝(kobi)）的染色体外双链DNA形式在培养的哺乳动物细胞中持续存在多代。（1）构建穿梭(chun su)载体删除编码病毒核心蛋白和外壳蛋白的基因。把病毒复制功能的基因插入到大肠杆菌 质粒中。加入SV40的新霉素抗性基因Neor。第163页/共168页第一百六十三页，共169页。加入一个(y )受细胞色素P450 dioxin诱导的增强子（doxin-responsive enhancer，DRE）。加入一个(y )DRE调控的

67、小鼠乳腺癌启动子（MMTP）。TCDD（2，3，7，8-tetrachlorodibenzo-p-doxin）诱导(yudo)表达。第164页/共168页第一百六十四页，共169页。基因工程(jyngngchng)总结目的基因(jyn)的获得载体(zit)的提纯重组载体的构建(酶切/连接）转化/转染细胞的筛选宿主细胞的转化/转染宿主细胞的培养目的基因的诱导表达第165页/共168页第一百六十五页，共169页。1.下列哪一种酶作用时需要引物？（）A限制酶B末端转移酶C反转录酶DDNA连接酶2.逆转录酶也称为反转录酶，是一种（）A依赖于DNA的DNA聚合酶B依赖于RNA的DNA聚合酶C依赖于DNA

68、的RNA聚合酶DDNA聚合酶或RNA聚合酶3.下列哪些属于(shy)重组DNA分子？（）APCR扩增的DNA片段B单链RNA与单链DNA杂交得到的产物C人基因组片段与质粒载体连接的产物D存在于细菌细胞内的噬菌体染色体第166页/共168页第一百六十六页，共169页。1.已知某一内切核酸酶在一线状DNA 上有3 个切点，用此酶切割该线状DNA,可得到3 个片段。2.迄今发现的质粒DNA都是环状的。3所谓穿梭质粒载体是能够在两种以上的不同宿主细胞中复制的质粒，所用的复制起点不同。4取代型载体(replacement vector)是指同一种限制性内切核酸酶在DNA 中具有两个切点，外源DNA 通过

69、取代这两个切点间的片段被克隆。5PCR既能用于扩增任何天然存在的核苷酸序列，又能重新设计任何天然核苷酸序列的两个末端。因此，任意两个天然存在的DNA序列都能快速有效的扩增，并拼接在一起。6不匹配的粘性末端是不能通过粘性末端连接的。7同聚物接尾法构建重组体，不仅(bjn)效率高，而且也很容易回收插入的片段。印迹和 Southern印迹的基本原理是一样的，都是用于检测结构基因的表达。第167页/共168页第一百六十七页，共169页。感谢您的观看(gunkn)！第168页/共168页第一百六十八页，共169页。内容(nirng)总结第八章 克隆基因的表达。S-D序列距离AUG的距离也影响翻译。ori：pBR322 ori。在外源多肽的N端或C端接上6个组氨酸（His）。信号肽酶I、信号肽酶II等近20多种蛋白质的参与。正常的高甘露糖寡糖链上仅有8-13个甘露糖。His4：组氨酸合成所需的组氨酸脱氢酶基因。环状双链DNA，105105bp（185kb）。（6）加上真核生物的转录信号和结束信号以。编码(bin m)大T抗原（控制DNA复制）和小t抗原第一百六十九页，共169页。