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1、微生物的实验室培养降解尿素和微生物的实验室培养降解尿素和纤维素用纤维素用一、微生物概念及分一、微生物概念及分类 1、概念：是指自然界中那些形、概念：是指自然界中那些形态微小、微小、结构构简单，通常通常要用光学要用光学显微微镜或或电子子显微微镜才能看清楚的生物。才能看清楚的生物。第第1节微生物的微生物的实验培养培养微生微生物所物所需的需的营养营养要素要素碳源碳源氮源氮源水水无机盐无机盐无机碳源：无机碳源：CO2等等自养型自养型有机碳源：有机碳源：葡萄糖等葡萄糖等异养型异养型N2：固氮菌（根瘤菌等）：固氮菌（根瘤菌等）NH3：硝化细菌：硝化细菌其他：铵盐、硝酸盐、尿素、其他：铵盐、硝酸盐、尿素、蛋
2、白胨蛋白胨特殊营养物质（维生素、氨基酸和碱基等）、特殊营养物质（维生素、氨基酸和碱基等）、PHPH、温度、氧气等、温度、氧气等3）培养基的种类）培养基的种类物理性质物理性质培养基特点培养基特点作作 用用固体培养基固体培养基半固体培养半固体培养基基液体培养基液体培养基加大量加大量琼脂脂 加少量加少量琼脂脂 不加不加琼脂脂 用于微生物的分用于微生物的分离和离和计数数观察微生物的运察微生物的运动和和鉴定菌种定菌种用于工用于工业生生产3）培养基的种类）培养基的种类化学成分化学成分培养基特点培养基特点作作 用用合成培合成培养养 基基天然培天然培养养 基基化学成分、化学成分、含量已知含量已知含有天然物含有
3、天然物质，化学成分、含化学成分、含量未知量未知用于微生物的分用于微生物的分类和和鉴定定用于工用于工业生生产3）培养基的种类）培养基的种类用用 途途培养基成培养基成分分原理原理作用作用实例实例选择选择培养培养基基鉴别鉴别培养培养基基基本培养基本培养基基+ +某种物某种物质质基本培养基本培养基基+ +指示指示剂或化学剂或化学物质物质抑制不需要；抑制不需要；促进需要微促进需要微生物生长生物生长发生特定颜发生特定颜色反应等，色反应等，证明微生物证明微生物的存在的存在分离分离菌种菌种鉴别鉴别菌种菌种青霉素选青霉素选择出霉菌择出霉菌和酵母菌和酵母菌伊红伊红- -美蓝美蓝遇大肠杆菌遇大肠杆菌落呈深紫色落呈深
4、紫色带金属光泽带金属光泽选择培养基选择培养基1 1）不加碳源的培养基）不加碳源的培养基 分离自养型微生物分离自养型微生物2 2）不加氮源的培养基）不加氮源的培养基 分离固氮菌分离固氮菌3 3）加入青霉素的培养基）加入青霉素的培养基 分离酵母菌、霉菌等真菌分离酵母菌、霉菌等真菌4 4）加入高浓度食盐的培养基）加入高浓度食盐的培养基 分离金黄色葡萄球菌分离金黄色葡萄球菌练习：（10全国）全国）某某细菌固体培养基的菌固体培养基的组成成分是成成分是KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4、葡萄糖、尿素、葡萄糖、尿素、琼脂和蒸脂和蒸馏水，其中凝固水，其中凝固剂是是，碳源是，碳源是，氮源是。已知只有能合成
5、氮源是。已知只有能合成脲酶的的细菌才能在菌才能在该培养基上生培养基上生长，故，故该培养培养基属于培养基。按照化学成分分基属于培养基。按照化学成分分类，该培养基属于培养基。从同化培养基属于培养基。从同化作用作用类型上看，用型上看，用该培养基培养的培养基培养的细菌属菌属于于。葡萄糖葡萄糖尿素尿素琼脂琼脂选择选择合成合成异养型异养型思考：思考：自然界中微生物是混杂的生活在自然界中微生物是混杂的生活在一起的，如何分离出某种微生物（如纯一起的，如何分离出某种微生物（如纯化大肠杆菌）？化大肠杆菌）？2、实验操作操作大大肠杆菌的杆菌的纯化培养化培养 1）制）制备培养基：培养基：计算算称称量量溶溶化化调PH值
6、灭菌菌倒倒平平板板无菌技无菌技术1、获取纯化培养物的关键是、获取纯化培养物的关键是防止外来杂菌防止外来杂菌 的入侵。的入侵。2、无菌措施：、无菌措施：1)1)对实验操作空间、操作者衣着和手进对实验操作空间、操作者衣着和手进行清洁和行清洁和消毒消毒；对将培养用的器皿、；对将培养用的器皿、接种工具和培养基进行接种工具和培养基进行灭菌灭菌2)2)实验操作时已灭菌材料等应避免与周实验操作时已灭菌材料等应避免与周围物品接触；实验操作应在酒精灯火围物品接触；实验操作应在酒精灯火焰附近进行；接种工具等应在酒精等焰附近进行；接种工具等应在酒精等火焰上灼烧后使用火焰上灼烧后使用1)概念：用概念：用温和的温和的物
7、理方法和化学方法物理方法和化学方法杀死物体表面或内部死物体表面或内部一部分一部分对人体有人体有害的微生物（不包括芽害的微生物（不包括芽孢和和孢子）子）消毒与消毒与灭菌菌消毒：消毒：2)常用消毒方法：常用消毒方法： 煮沸消毒法煮沸消毒法:100:100煮沸煮沸5-6min5-6min； 巴氏消毒法巴氏消毒法:70-75 :70-75 下煮下煮30min30min或或 80 80 下煮下煮15min15min； 化学药剂消毒法化学药剂消毒法: :用用75%75%酒精等进行皮肤消酒精等进行皮肤消毒毒; ;氯气消毒水源；氯气消毒水源； 紫外线消毒等紫外线消毒等灭菌菌1)概念：用概念：用强烈的烈的物理方
8、法和化学方法物理方法和化学方法杀死死物体表面或内部物体表面或内部所有的所有的微生物（包微生物（包括芽括芽孢和和孢子）子）灼灼烧灭菌菌干干热灭菌：菌：160-170 下加下加热1-2h。高高压蒸蒸汽汽灭菌：菌：100kPa、121 下下维持持15-30min.2)灭菌方法：菌方法：无菌技无菌技术1、获得得纯净培养物的关培养物的关键是？是？防止外来防止外来杂菌的入侵菌的入侵2、消毒与、消毒与灭菌的区菌的区别？消毒是消毒是杀死部分死部分对人体有害的微生物；人体有害的微生物；灭菌菌是是杀死所有微生物。死所有微生物。3、对培养基培养基灭菌的方法是菌的方法是_，对接种接种针灭菌的方法是菌的方法是_，对玻璃
9、器玻璃器皿皿灭菌的方法是菌的方法是_，对实验操作者的操作者的手用酒精手用酒精_处理，理，实验操作操作结束需不需束需不需要要灭菌？菌？_高压蒸汽灭菌法高压蒸汽灭菌法灼烧灭菌灼烧灭菌干热灭菌干热灭菌消毒消毒需要需要 倒平板：倒平板：待培养基冷却到待培养基冷却到5050OC C左右时倒平板。左右时倒平板。平板倒置原因：防止培养基冷却平板倒置原因：防止培养基冷却产生水滴滴落培生水滴滴落培养基上，造成养基上，造成污染。染。2、实验操作操作大大肠杆菌的杆菌的纯化培养化培养 1）制）制备培养基：培养基：计算算称称量量溶溶化化调PH值灭菌菌倒倒平平板板原则：原则：目的明确、营养协调、目的明确、营养协调、PH值
10、适宜值适宜2）纯化大化大肠杆菌：杆菌：微生物接种方法微生物接种方法平板划线法平板划线法稀释涂布平板法稀释涂布平板法平板划线法平板划线法：通过接种环在琼脂通过接种环在琼脂固体固体培养基表面连续划线培养基表面连续划线的操作，的操作，将聚集的将聚集的菌种逐步稀释分散菌种逐步稀释分散到培养基的表面，在到培养基的表面，在数次划线后培养，可以数次划线后培养，可以分离到由一个细分离到由一个细胞胞繁殖而来的细胞群体，即得到繁殖而来的细胞群体，即得到单一菌单一菌落落。平板划线法平板划线法稀释涂布平板法：稀释涂布平板法： 将菌液将菌液进行行一系列的一系列的梯度稀梯度稀释，然后，然后将不同稀将不同稀释梯度菌液梯度菌
11、液分分别涂布在固体培涂布在固体培养基养基的表面，的表面，进行培养。在行培养。在稀稀释度足度足够高的菌液高的菌液里，聚集在一起的微生物将被里，聚集在一起的微生物将被分散成分散成单个个细胞胞，进而而形成形成单个菌落个菌落。系列稀释操作系列稀释操作123456 (1) (1)将分别盛有将分别盛有9mL9mL水的试管灭菌并编号。水的试管灭菌并编号。 (2) (2)用移液管吸取用移液管吸取1mL1mL培养的菌液，注入第二支试管中，培养的菌液，注入第二支试管中，轻压橡皮头，吹吸三次使之充分混匀。轻压橡皮头，吹吸三次使之充分混匀。 (3) (3)从从10101 1倍稀释的试管中吸取倍稀释的试管中吸取1mL1
12、mL稀释液，注入第三支试稀释液，注入第三支试管中，重复步骤管中，重复步骤2 2，直至到第六支试管。，直至到第六支试管。10-110-410-510-6平板划线法平板划线法稀释涂布平板法稀释涂布平板法相同点：分散出相同点：分散出单细菌形成单菌落单细菌形成单菌落来分离菌种来分离菌种不同点：分别通过不同点：分别通过划线划线和和稀释稀释分散出单细菌，分散出单细菌，稀释涂稀释涂布平板法布平板法除分离菌种外除分离菌种外还可以对微生物计数还可以对微生物计数三、微生物的分离和三、微生物的分离和计数数思考：如何思考：如何寻找和分离某种微生物？找和分离某种微生物？实例例1：启示：启示：寻找目的菌种找目的菌种时要根
13、据它要根据它对生存生存环境的境的要求，到相要求，到相应的的环境中去境中去寻找。找。多聚多聚酶链式反式反应是一种在是一种在体外将少量体外将少量DNA大量复制大量复制的技的技术，此，此项技技术要求使要求使用耐高温（用耐高温（930C）的）的DNA聚合聚合酶。如果如果让你你寻找找这种耐高温的种耐高温的酶，你会，你会去哪找？去哪找？启示：启示：分离菌种要人分离菌种要人为提供有利于目的菌株生提供有利于目的菌株生长的条件的条件(包括包括营养、温度、养、温度、pH等等)，同，同时抑制抑制或阻止其他微生物生或阻止其他微生物生长，即用，即用选择培养基培养基来分来分离菌种。离菌种。原因：原因：因因为热泉温度泉温度
14、70800C，淘汰了，淘汰了绝大多大多数微生物，只有耐数微生物，只有耐热菌被菌被筛选出来。出来。思考：思考：为什么耐什么耐热菌能从菌能从热泉中被泉中被筛选出出来？来？（一）分离微生物原理：（一）分离微生物原理：选择培养基分离培养基分离1 1、活菌计数法（通过统计菌落估算活菌数）、活菌计数法（通过统计菌落估算活菌数）原理：原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。常用方法：稀释涂布平板法。常用方法：稀释涂布平板
15、法。每克样品中的菌落数每克样品中的菌落数(CV)M(CV)M其中，其中，C C代表某一稀释度下平板上生长的平均代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，菌落数，V V代表涂布平板时所用的稀释液的体代表涂布平板时所用的稀释液的体积积(ml)(ml)，M M代表稀释倍数。代表稀释倍数。（二）微生物计数方法（二）微生物计数方法 ：注意事项注意事项统计的菌落往往比活菌的实际数目低。原因统计的菌落往往比活菌的实际数目低。原因是是_。为了保证结果准确，一般选择菌落数在为了保证结果准确，一般选择菌落数在3030300300的平板上进行计数。的平板上进行计数。( (细菌：稀释度细菌：稀释度10104 4- -1
16、0106 6；放线菌：稀释度；放线菌：稀释度10103 3-10-105 5；霉菌：稀释度；霉菌：稀释度10102 2-10-104 4) )为使结果接近真实值可将为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三同一稀释度加到三个或三个以上的平皿中个或三个以上的平皿中，经涂布，培养计算出，经涂布，培养计算出菌落平均数。菌落平均数。当两个或多个细胞连着一起时，平板上观当两个或多个细胞连着一起时，平板上观察到的菌落只有一个。察到的菌落只有一个。2、显微微镜直接直接计数法：数法：利用特定利用特定细菌菌计数板数板或或血血细胞胞计数板数板，在，在显微微镜下下计算一定容算一定容积里里样品中微生物的数量。品中微生物的
17、数量。不能区分死菌与活菌；不能区分死菌与活菌；不适于不适于对运运动细菌的菌的计数；数；需要相需要相对高的高的细菌菌浓度；度；个体小的个体小的细菌在菌在显微微镜下下难以以观察察缺点缺点1 1、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数（三）（三）实例：例：课题背景课题背景1 1）尿素的利用）尿素的利用尿素尿素是一种重要的是一种重要的农业氮肥。农业氮肥。尿素尿素不能直接不能直接被农作物被农作物吸收。吸收。土壤中的细菌将尿素土壤中的细菌将尿素分解成分解成氨氨之后才能被植物利用。之后才能被植物利用。2 2）细菌利用尿素的原因）细菌利用尿素的原因土壤中的细菌分解尿素是因为它们土壤
18、中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶能合成脲酶CO(NHCO(NH2 2) )脲酶脲酶+ H+ H2 2O O+ CO+ CO2 2NHNH3 33 3）常见的分解尿素的微生物）常见的分解尿素的微生物芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。真菌和放线菌也能分解尿素。4 4）课题目的）课题目的 从土壤中分离出能够分解尿素的细菌从土壤中分离出能够分解尿素的细菌 统计每克土壤样品中究竟含有多少统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌这样的细菌15.0g琼脂脂1.0g尿素尿素10.
19、0g葡萄糖葡萄糖0.2gMgSO47H2O2.1gNaH2PO41.4gKH2PO4土壤中分解尿素的土壤中分解尿素的细菌的分离与菌的分离与计数所需培养基：数所需培养基：从物理性从物理性质看此培养基属于哪看此培养基属于哪类？固体培养基固体培养基在此培养基中哪些作在此培养基中哪些作为碳源、氮源？碳源、氮源？碳源：碳源：葡萄糖葡萄糖氮源：氮源：尿素尿素培养基的培养基的唯一氮源唯一氮源为尿素尿素，只有能合成，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。氮源。缺乏缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生氮源而不能生长发育繁殖，
20、而受到抑制，所育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生出分解尿素的微生物。物。4) 培养基培养基选择分解尿素的微生物的原理分解尿素的微生物的原理实验的具体操作实验的具体操作 .土壤取样土壤取样 从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。封中。取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。前都要灭菌。.制备培养基：制备培养基：制备以尿素为唯一氮源的制备以尿素为唯一氮源的选择培养基选择培养基。应
21、在火焰旁称取土壤应在火焰旁称取土壤应在火焰旁称取土壤应在火焰旁称取土壤10g10g10g10g。在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行分离不同的微生物采用不同的稀释度分离不同的微生物采用不同的稀释度原因：不同微生物在土壤中含量不同原因：不同微生物在土壤中含量不同目的：保证获得菌落数在目的：保证获得菌落数在3030300300之间、适于计之间、适于计数的平板数的平板三三样品的稀释样品的稀释. .取样涂布取样涂布如果得到了如果得到了如果得到了如果得到了2
22、 2 2 2个或个或个或个或2 2 2 2个以上菌落数目在个以上菌落数目在个以上菌落数目在个以上菌落数目在30300303003030030300的平板，的平板，的平板，的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果果果果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确验不精确验不精确验不精确，需要
23、重新实验。，需要重新实验。，需要重新实验。，需要重新实验。实例例2：在做分解尿素的：在做分解尿素的细菌的菌的筛选与与统计菌落数目的菌落数目的实验时，A同学从同学从对应的的106倍稀倍稀释的培养基中的培养基中筛选出大出大约150个菌落，但是其他同学在同个菌落，但是其他同学在同样的稀的稀释度度下只下只选择出大出大约50个菌落。分析其原因。个菌落。分析其原因。原原因因：土土样样不不同同 培培养养基基污污染染或或操操作作失失误误(或者是混入了其他的含氮物质或者是混入了其他的含氮物质)小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。说服力，
24、对照的设置是必不可少的。方案一：方案一：由其他同学用与由其他同学用与A同学相同土样进行同学相同土样进行实验实验 方案二：方案二：将将A同学配制的培养基在不加土样同学配制的培养基在不加土样(或或加等量无菌水加等量无菌水)的情况下进行培养，作为空白的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。对照，以证明培养基是否受到污染。结果预测：结果预测：如果结果与如果结果与A同学一致，则证明同学一致，则证明A无无误；如果结果不同，则证明误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失同学存在操作失误或培养基的配制有问题。误或培养基的配制有问题。设置对照：设置对照：设置对照的主要目的设置对照的主要目的是排
25、除实验组中非测试因是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。 纤维素分解菌的素分解菌的筛选（教材（教材P28）选择_的的环境，采集土境，采集土样制成制成样品。将品。将样品接种在以品接种在以_为唯一碳源的唯一碳源的选择培养基上培养，目的是增加培养基上培养，目的是增加纤维素分解菌素分解菌的的浓度。采用度。采用_法法,将将样品接种到含有品接种到含有刚果果红的固体的培养基上，挑的固体的培养基上，挑选产生生_的菌落来的菌落来筛选纤维素分解菌。素分解菌。纤维素丰富素丰富纤维素素稀稀释涂布平板涂布平板透明圈透明圈2、分解、分解纤维素微生物的分离
26、：素微生物的分离：实验操作操作土壤取样土壤取样梯度稀释梯度稀释将样品涂布到鉴别将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培纤维素分解菌的培养基上（含刚果红）养基上（含刚果红）挑选产生透挑选产生透明圈的菌落明圈的菌落选择培养选择培养(液体培养基液体培养基)筛选并增大菌种并增大菌种浓度度稀稀释菌种菌种.微生物的培养与观察微生物的培养与观察在菌落计数时，每隔在菌落计数时，每隔24h24h统计一次菌落数目。统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。 培养不同微生物往往需要不同培养温度。培
27、养不同微生物往往需要不同培养温度。细菌：细菌：30303737培养培养1 12d2d放线菌：放线菌：25252828培养培养5 57d7d霉菌：霉菌：25252828的温度下培养的温度下培养3 34d4d。微生物的培养与观察微生物的培养与观察三三. .结果分析与评价结果分析与评价1.1.通过对照实验，若培养物有杂菌污染，通过对照实验，若培养物有杂菌污染，菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出分解尿素的微生物。分解尿素的微生物。2.2.提示：选择每个平板上长有提示：选择每个平板上长有3030
28、030300个个菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适。菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适。同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相差悬殊，如相差较大，表示实验不精确。差悬殊，如相差较大，表示实验不精确。2、微生物分离原理：、微生物分离原理：人为提供有利于人为提供有利于目的菌株目的菌株生长的条件生长的条件(包括营包括营养、温度、养、温度、pH等等)，同时抑制或阻止其他微，同时抑制或阻止其他微生物生长。生物生长。 （用选择培养基）（用选择培养基）（二）（二）纯化大化大肠杆菌杆菌1、将准、将准备培养的菌种放到培养基中的培养的菌种放到培养基中的过程叫做程叫做_。2、微
29、生物接种的最常用方法是、微生物接种的最常用方法是_和和_3、能、能够获得得单一菌落的接种方法有一菌落的接种方法有_和和_4、能、能够测定定样品中活菌数的接种方法是品中活菌数的接种方法是_平板划平板划线法法稀稀释涂布平板法涂布平板法接种接种平板划平板划线法法稀稀释涂布平板法涂布平板法稀稀释涂布平板法涂布平板法生生物物细细胞胞生生物物动物动物 植物植物 真菌真菌 原生生物原生生物非细胞非细胞生物生物真核生物真核生物原核生物原核生物细菌细菌 放线菌放线菌支原体支原体衣原体衣原体蓝藻蓝藻病毒病毒微微生生物物酵母菌、酵母菌、 霉霉 菌、蘑菇菌、蘑菇微生物的微生物的实验室培养室培养一、基一、基础知知识（一
30、）培养基（一）培养基1、配制培养基的基本原配制培养基的基本原则（确定培养基配（确定培养基配方的依据）方的依据）_2、多数培养基都含有、多数培养基都含有_等四等四类营养物养物质，少数微生物少数微生物还需要加入特殊的需要加入特殊的营养物养物质即即_.3、最常用的碳源是最常用的碳源是_；蛋白胨或牛；蛋白胨或牛肉膏可以为细菌提供肉膏可以为细菌提供_类营养物质类营养物质4、微生物的培养条件主要包括、微生物的培养条件主要包括_根据微生物的营养需要配制根据微生物的营养需要配制水、无机水、无机盐、碳源、氮源、碳源、氮源生生长因子因子葡萄糖葡萄糖氮源和碳源氮源和碳源温度、温度、PH、渗透、渗透压、O2等等笔记笔
31、记 例题：下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产例题：下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤风杆菌的实验方案破伤风杆菌的实验方案B体外培养体外培养骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞足够数量的细胞足够数量的细胞群群注射到注射到小鼠腹腔小鼠腹腔AC 1 1、该实验方案的目的是、该实验方案的目的是 _2 2、A A是从小鼠的脾脏中取得是从小鼠的脾脏中取得 _,_,该细胞能够产生该细胞能够产生_3 3、取、取A A细胞前，必须给小鼠细胞前，必须给小鼠 _4 4、图中、图中B B为为_过程，常用过程，常用_作为诱导剂，作为诱导剂，制备单克隆抗体制备单克隆抗体B细胞细胞 抗体抗体注射
32、抗原注射抗原 细胞融合细胞融合 灭活的病毒灭活的病毒 例题：下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产例题：下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤风杆菌的实验方案破伤风杆菌的实验方案B体外培养体外培养骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞足够数量的细胞足够数量的细胞群群注射到注射到小鼠腹腔小鼠腹腔AC 5 5、杂交瘤细胞继承、杂交瘤细胞继承_的的遗传特性，既能遗传特性，既能_,_,又能又能 _。6 6、C C过程指细胞培养，该过程包括过程指细胞培养，该过程包括_培养和培养和_培养两个阶段。培养两个阶段。7 7、单克隆抗体的特点是、单克隆抗体的特点是 _8 8、将单克隆抗体与抗癌药
33、物相结合，、将单克隆抗体与抗癌药物相结合，制成制成_ 双亲细胞双亲细胞 无限增殖无限增殖 分泌特异性抗体分泌特异性抗体原代原代 传代传代特异性强、灵敏度高，并可大量制备特异性强、灵敏度高，并可大量制备生物导弹生物导弹5、选择培养基（笔培养基（笔记）选择培养基选择培养基筛选、分离的细胞筛选、分离的细胞加入青霉素加入青霉素酵母菌、霉菌酵母菌、霉菌等真菌等真菌加入高浓度食盐加入高浓度食盐金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌无氮培养基无氮培养基固氮菌固氮菌无碳培养基无碳培养基自养型自养型细菌细菌依标记基因，加入某种等抗依标记基因，加入某种等抗生素生素导入了导入了重组重组DNADNA的受体细的受体细胞胞加入次黄
34、嘌呤、氨基嘌呤等加入次黄嘌呤、氨基嘌呤等杂交瘤细胞杂交瘤细胞培养基成分培养基成分含量含量NH4ClNH4Cl4.6g4.6gK2HPO4K2HPO42.0g2.0gMgSO4MgSO41.6g1.6g琼脂琼脂15g15g蒸馏水蒸馏水1000ml1000ml乳糖乳糖5.0g培养基成分培养基成分含量含量K2HPO4K2HPO42.0g2.0gMgSO4MgSO41.6g1.6g琼脂琼脂15g15g蒸馏水蒸馏水1000ml1000ml乳糖乳糖5.0gNH4ClNH4Cl4.6g4.6g蛋白胨蛋白胨10.0g10.0g培养基成分培养基成分含量含量K2HPO4K2HPO42.0g2.0gMgSO4MgS
35、O41.6g1.6g琼脂琼脂15g15g蒸馏水蒸馏水1000ml1000ml乳糖乳糖5.0gNH4ClNH4Cl4.6g4.6g培养基成分培养基成分含量含量K2HPO4K2HPO42.0g2.0gMgSO4MgSO41.6g1.6g琼脂琼脂15g15g蒸馏水蒸馏水1000ml1000ml乳糖乳糖5.0gNH4ClNH4Cl4.6g4.6g蛋白胨蛋白胨10.0g10.0g培养基成分培养基成分含量含量K2HPO4K2HPO42.0g2.0gMgSO4MgSO41.6g1.6g琼脂琼脂15g15g蒸馏水蒸馏水1000ml1000ml乳糖乳糖5.0gNH4ClNH4Cl4.6g4.6g微生物的分离：科
36、赫的平板划微生物的分离：科赫的平板划线法法自然界中的微生物都是混自然界中的微生物都是混杂生活在一起的，生活在一起的，给研究和研究和应用用带来了很大困来了很大困难。19世世纪后期，德国后期，德国细菌学家菌学家科赫科赫发明了明了固体培养基固体培养基，尤其是用，尤其是用琼脂做凝固脂做凝固剂的固的固体培养基，成功解决体培养基，成功解决这一一问题，科赫，科赫将微生物将微生物样品稀品稀释后，用后，用针尖沾取少量稀尖沾取少量稀释菌液在固体培养基上菌液在固体培养基上连续划划线，由于微生物在固体培养基上由于微生物在固体培养基上生生长部位固定部位固定，不，不久就会在培养基表面久就会在培养基表面长出出多种菌落多种菌
37、落，科赫推断相同的，科赫推断相同的菌落来自同一个种，于是挑菌落来自同一个种，于是挑选某一种菌落的微生物，某一种菌落的微生物，经过几次相同的培养几次相同的培养过程后，就得到了程后，就得到了纯种。种。应用固用固体培养基，科赫分离出了炭疽芽体培养基，科赫分离出了炭疽芽孢杆菌、霍乱弧菌、杆菌、霍乱弧菌、结核杆菌等。核杆菌等。1905年科赫因年科赫因结核杆菌的研究成果而核杆菌的研究成果而获诺贝尔生理学生理学奖。单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见、具有一定形态结构子细胞群体，形成一个肉眼可见、具有一定形态结构子细胞群体，叫做叫做菌落菌落
38、。菌落是鉴定菌种的重要依据。菌落是鉴定菌种的重要依据。摸底考摸底考试复复习安排安排阅读笔笔记复复习学案（重点是自己学案（重点是自己不会的、做不会的、做错的的习题）作作业2011高考高考总复复习-学生用学生用书-生物生物P151161 要求：填写基要求：填写基础知知识、例、例题、考点、考点训练2011高考高考总复复习-学生卷学生卷-生物生物P107112；P114116（去掉（去掉12、13、19、23、25、30）1）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基制备牛肉膏蛋白胨固体培养基物质物质牛肉膏牛肉膏蛋白胨蛋白胨NaClNaCl琼脂琼脂水水重量重量5g5g10g10g5g5g20g20g定溶至定溶至100
39、mL100mL 称量称量 按比例称取各种物质，注意事项：牛肉膏要按比例称取各种物质，注意事项：牛肉膏要放在称量纸上称量，牛肉膏、蛋白胨都易吸潮，放在称量纸上称量，牛肉膏、蛋白胨都易吸潮，称取时动作要迅速，称后及时盖上瓶盖称取时动作要迅速，称后及时盖上瓶盖。计算算溶化：溶化：先将牛肉膏连同称量纸一起放入烧杯，加少量先将牛肉膏连同称量纸一起放入烧杯，加少量水，加热至牛肉膏溶化并与称量纸分离后，用玻璃棒取水，加热至牛肉膏溶化并与称量纸分离后，用玻璃棒取出称量纸。加入蛋白胨和氯化钠，用玻璃棒搅拌使之溶出称量纸。加入蛋白胨和氯化钠，用玻璃棒搅拌使之溶解，再加入琼脂，搅拌，待溶解后，加自来水定溶至解，再加
40、入琼脂，搅拌，待溶解后，加自来水定溶至100mL100mL。灭菌：灭菌：将配制好的培养基放到锥形瓶中（瓶口加棉塞，将配制好的培养基放到锥形瓶中（瓶口加棉塞，包上牛皮纸），连同培养皿（包上牛皮纸），连同培养皿（3 35 5套，用几层报纸包好）套，用几层报纸包好）一起放到高压锅内灭菌。一起放到高压锅内灭菌。2、制、制备培养基的操作排序培养基的操作排序溶化（使各种原料、溶化（使各种原料、琼脂等加脂等加热溶化）溶化）灭菌菌调PH值计算（各成分用量）算（各成分用量）称量称量倒平板倒平板(培养基冷却至培养基冷却至50,倒入培养皿倒入培养皿) 正确的操作正确的操作顺序：序：_ 为为什什么么分分离离不不同同的
41、的微微生生物物要要采采用用不不同同的的稀稀释释度度？测测定定土土壤壤中中细细菌菌的的总总量量和和测测定定土土壤壤中中能能分分解解尿尿素素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？原原因因：土土壤壤中中各各类类微微生生物物的的数数量量（单单位位：株株/kg/kg）是是不不同同的的。例例如如在在干干旱旱土土壤壤中中的的上上层层样样本本中中：好好氧氧及及兼兼性性厌厌氧氧细细菌菌数数约约为为2 2 185185万万，放放线线菌数约为菌数约为477477万，霉菌数约为万，霉菌数约为23.123.1万。万。结结论论：为为获获得得不不同同类类型型的的微微生生物物，就就需需要要按
42、按不不同同的的稀稀释释度度进进行行分分离离，同同时时还还应应当当有有针针对对性性地地提提供选择培养的条件。供选择培养的条件。接种环接种环接种针接种针结果：结果：培养一定时间后，该菌数量上升，再通培养一定时间后，该菌数量上升，再通过平板稀释等方法对它进行纯化培养分离。过平板稀释等方法对它进行纯化培养分离。基因工程基因工程基本工具基本工具操作步操作步骤基本原理基本原理细胞胞工程工程植物植物细胞工程胞工程动物物细胞工程胞工程植物植物组织培养培养植物体植物体细胞胞杂交交动物物细胞培养胞培养动物物细胞融合胞融合单克隆抗体克隆抗体核移植核移植原理、过程、原理、过程、条件及应用条件及应用同化作用与异化作用同
43、化作用与异化作用新新陈陈代代谢谢同化同化作用作用异化异化作用作用概念：概念：摄取转变摄取转变自身物质，自身物质，储存能量储存能量外界环的外界环的营养物质营养物质概念：概念：部分自部分自身物质身物质分解分解终产物，终产物，释放能量释放能量排出排出体体外外类型：类型：自养型：自养型：异养型：异养型：无机无机物物有机有机物物光合作用光合作用 化能合成作用化能合成作用利用利用现成现成的的有机物有机物维持生命维持生命类型类型需氧型：需氧型：厌氧型：厌氧型：需要需要氧气氧气来分解体有机物来分解体有机物必须生活在必须生活在无氧无氧的环境中的环境中新陈代新类型：自养需氧型新陈代新类型：自养需氧型（如：蓝藻、硝
44、化细菌）；（如：蓝藻、硝化细菌）；异养异养需氧型需氧型（如：人）（如：人）；自养厌氧型；异养厌氧型；自养厌氧型；异养厌氧型（乳酸菌）（乳酸菌）（碳）（碳）专题5 微生物微生物专题微生物微生物概念及概念及种种类微生物微生物培养培养微生物微生物分离和分离和计数数微生物微生物应用用增殖方式：二分裂增殖方式：二分裂增殖方式：复制式增殖增殖方式：复制式增殖增殖方式：出芽生殖增殖方式：出芽生殖思考：思考：1 1、所有的培养基都必须含碳源、氮源、水、所有的培养基都必须含碳源、氮源、水、 无机盐吗？无机盐吗？2 2、培养基中的营养要素，除了水以外的无机、培养基中的营养要素，除了水以外的无机 物只能是无机盐？物
45、只能是无机盐？3 3、COCO2 2既自养型生物的碳源也是能源物质？既自养型生物的碳源也是能源物质？4 4、利用动物细胞培养液培养病毒，行吗？、利用动物细胞培养液培养病毒，行吗？否；可以无碳源，也可无氮源否；可以无碳源，也可无氮源否；碳源和氮源也可能是无机物否；碳源和氮源也可能是无机物否；光能或化学能否；光能或化学能病毒无细胞结构，只能寄生在活细胞中生存。病毒无细胞结构，只能寄生在活细胞中生存。所以，要利用所以，要利用活细胞活细胞培养病毒。培养病毒。一、微生物概念及种一、微生物概念及种类 1、概念：是指自然界中那些形、概念：是指自然界中那些形态微小、微小、结构构简单，通常通常要用光学要用光学显
46、微微镜或或电子子显微微镜才能看清楚的生物。才能看清楚的生物。 2、种、种类：无：无细胞胞结构构病毒病毒、原核生物原核生物界界（细线支支蓝衣）衣）、真菌界真菌界（酵母菌、（酵母菌、霉菌、蘑菇等）霉菌、蘑菇等）、原生生物界原生生物界（草履草履虫、虫、变形虫等）形虫等）3、代、代谢特点：异常旺盛特点：异常旺盛微生微生物所物所需的需的营养营养要素要素碳源碳源氮源氮源水水无机盐无机盐无机碳源：无机碳源：CO2等等自养型自养型有机碳源：有机碳源：葡萄糖等葡萄糖等异养型异养型N2：固氮菌（根瘤菌等）：固氮菌（根瘤菌等）NH3：硝化细菌：硝化细菌其他：铵盐、硝酸盐、尿素、其他：铵盐、硝酸盐、尿素、蛋白胨蛋白胨特殊营养物质（维生素、氨基酸和碱基等）、特殊营养物质（维生素、氨基酸和碱基等）、PHPH、温度、氧气等、温度、氧气等
