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1、口服葡萄糖耐量实验口服葡萄糖耐量实验(OGTT)(OGTT)主讲：向梦甜PPT制作 ：向梦甜其他：汪琪、楚兵兵、杜龙杜龙付云 实验目的与要求实验目的与要求目的要求掌握掌握酶法酶法测定血清葡萄糖浓度的原理测定血清葡萄糖浓度的原理掌握血糖变化的临床生理意义掌握血糖变化的临床生理意义掌握口服葡萄糖耐量试验的原理，适用人群和临掌握口服葡萄糖耐量试验的原理，适用人群和临床意义。床意义。口服口服葡萄糖耐量试验（葡萄糖耐量试验（OGTTOGTT）是一种葡萄糖负荷试验，用于）是一种葡萄糖负荷试验，用于检查人体胰岛素检查人体胰岛素B B细胞功能和机体对糖的调节能力。正常人细胞功能和机体对糖的调节能力。正常人进食
2、后血糖都会暂时性升高，进食后血糖都会暂时性升高，3030- -6060分钟后可升到最高峰，分钟后可升到最高峰，但一般不超过但一般不超过8.9mmol/L8.9mmol/L，2 2小时左右又会回到空腹水平。这小时左右又会回到空腹水平。这种现象称为种现象称为耐糖现象耐糖现象。若内分泌失调或神经系统功能紊乱，。若内分泌失调或神经系统功能紊乱，则调节功能失常，食入大量糖后血糖浓度可急剧上升，短时则调节功能失常，食入大量糖后血糖浓度可急剧上升，短时间不能恢复到原值，称为耐糖失常现象。所以观察耐糖现象间不能恢复到原值，称为耐糖失常现象。所以观察耐糖现象可以了解调节血糖的各种机能是否健全。可以了解调节血糖的
3、各种机能是否健全。实验原理实验原理血糖的测定方法血糖的测定方法测定方法测定方法 无机化学法无机化学法有机化学法有机化学法酶法酶法无机化学法：无机化学法：Folin-Wu法，基于葡萄糖醛基的还原性法，基于葡萄糖醛基的还原性Cu2+OH-Cu+ Glu磷钼酸磷钼酸显色显色特异性差特异性差有机化学法：邻甲苯胺法、联苯胺法、氨基联苯法等有机化学法：邻甲苯胺法、联苯胺法、氨基联苯法等邻甲苯胺邻甲苯胺 + Glu 葡萄糖基胺葡萄糖基胺 希夫氏碱希夫氏碱 蓝绿色化合物蓝绿色化合物缩合缩合脱水脱水分子重排分子重排干扰因素多干扰因素多酶法：酶法：1、己糖激酶法（己糖激酶法（HK） 2、葡萄糖氧化酶法（葡萄糖氧化
4、酶法（GOD法）法）血糖的测定方法血糖的测定方法、己糖激酶法（法）、己糖激酶法（法）原理：原理： 葡萄糖葡萄糖ATPATP葡萄糖葡萄糖- - -磷酸磷酸ADPADP 葡萄糖葡萄糖-6-6-磷酸磷酸NADPNADP G-6-PD G-6-PD - -磷酸葡萄糖内酯磷酸葡萄糖内酯+NADPH+NADPH NADPHNADPH在在340nm340nm有吸收峰，其吸光度增加与标本中的葡萄糖浓度成正有吸收峰，其吸光度增加与标本中的葡萄糖浓度成正比比评价：评价：本法本法特异性高，灵敏度高，干扰因素少特异性高，灵敏度高，干扰因素少，适用于自动化，适用于自动化分析，为葡萄糖测定的分析，为葡萄糖测定的参考方法参
5、考方法，但是试剂较贵。，但是试剂较贵。 血糖的测定方法血糖的测定方法血糖的测定方法血糖的测定方法 评价 ：操作简单，操作简单，特异性较高特异性较高，是血糖测定的，是血糖测定的首选首选方法但方法但溶血（血红蛋白）、四环素、尿酸、溶血（血红蛋白）、四环素、尿酸、VcVc、胆红素、胆红素、 GSHGSH可引起可引起测定结果测定结果负偏差负偏差。2 2、葡萄糖氧化酶法、葡萄糖氧化酶法(GOD)(GOD)葡萄糖葡萄糖O O2 2+H+H2 2O O GODGOD 葡萄糖酸内酯葡萄糖酸内酯2 22 2O O2 22 22 2O O2 2 + 4-+ 4-氨基安替比林氨基安替比林+ +酚酚 PODPOD 红
6、色醌类化合物红色醌类化合物 + + 2 2O +OO +O2 2血糖的测定方法总结血糖的测定方法总结血糖的测定方法按测定原理可分为无机化学方法、有血糖的测定方法按测定原理可分为无机化学方法、有机化学方法和生物化学方法三类。此外，还有固相酶机化学方法和生物化学方法三类。此外，还有固相酶法、电化学法及质谱法等。常用的是分光光度法和酶法、电化学法及质谱法等。常用的是分光光度法和酶学方法。分光光度法中常见的是邻甲苯胺法，是利用学方法。分光光度法中常见的是邻甲苯胺法，是利用葡萄糖在加热的有机酸溶液中与某些芳香族胺类，可葡萄糖在加热的有机酸溶液中与某些芳香族胺类，可生成有色衍生物这一原理建立的。酶学方法有
7、葡萄糖生成有色衍生物这一原理建立的。酶学方法有葡萄糖氧化酶法、己糖激酶法和葡萄糖脱氢酶法等。氧化酶法、己糖激酶法和葡萄糖脱氢酶法等。临床上临床上OGTT主要适用情况主要适用情况（1 1）无糖尿病症状，空腹血糖异常，或偶尔出现糖尿，或）无糖尿病症状，空腹血糖异常，或偶尔出现糖尿，或有明显糖尿病家族史者有明显糖尿病家族史者（2 2）有糖尿病症状，血糖水平不够糖尿病诊断标准者）有糖尿病症状，血糖水平不够糖尿病诊断标准者（3 3）妊娠期或甲状腺功能亢进出现糖尿者）妊娠期或甲状腺功能亢进出现糖尿者（4 4）不明原因肾病与视网膜病者。）不明原因肾病与视网膜病者。实验器材实验器材：5m5mL L移液管移液管
8、、5050或或100u100uL L微量可调式微量可调式移液器移液器、721E721E分光光度计分光光度计、1cm1cm比色皿比色皿、3737恒温水浴恒温水浴锅锅应用应用GOD-PODGOD-POD法测定血糖浓度来检测葡萄糖耐量法测定血糖浓度来检测葡萄糖耐量应用应用GOD-PODGOD-POD法测定血糖浓度来检测葡萄糖耐量法测定血糖浓度来检测葡萄糖耐量实验试剂：实验试剂：1 1、0.1mol/L0.1mol/L磷酸盐缓冲液（磷酸盐缓冲液（pHpH= =7.07.0）: :称取无水磷酸氢二钠称取无水磷酸氢二钠8.67g8.67g及无水磷酸二氢钾及无水磷酸二氢钾5.3g5.3g溶于蒸馏水溶于蒸馏水
9、800ml800ml中，调中，调pH7.0pH7.0，定容至定容至1L1L。2 2、酶试剂、酶试剂: :取过氧化物酶取过氧化物酶12000U12000U，葡萄糖氧化酶，葡萄糖氧化酶1200U1200U，4-4-氨氨基安替比林基安替比林10mg10mg，置，置44保存，可稳定存放保存，可稳定存放3 3个月。个月。3 3、酚溶液、酚溶液: :称取重蒸馏酚称取重蒸馏酚100mg100mg溶于蒸馏水溶于蒸馏水100ml100ml中，用棕色中，用棕色瓶贮存。瓶贮存。4 4、酶酚混合试剂、酶酚混合试剂: :将酶试剂及酚溶液等量混合，将酶试剂及酚溶液等量混合，44可以存放可以存放1 1个月。个月。应用应用G
10、OD-PODGOD-POD法测定血糖浓度来检测葡萄糖耐量法测定血糖浓度来检测葡萄糖耐量5 5、12mmol/L12mmol/L苯甲酸溶液苯甲酸溶液：取苯甲酸取苯甲酸1.4g1.4g，于，于800ml800ml蒸馏水中蒸馏水中加温助溶，冷却后加蒸馏水定容至加温助溶，冷却后加蒸馏水定容至1L1L。6 6、葡萄糖标准贮存液（、葡萄糖标准贮存液（100mmol/L100mmol/L）：称取已干燥恒重的无称取已干燥恒重的无水葡萄糖水葡萄糖1.802g1.802g，溶于约，溶于约70ml 12mmol/L70ml 12mmol/L苯甲苯甲酸酸溶液中，以溶液中，以12mmol/L12mmol/L苯甲酸苯甲酸
11、溶液定容至溶液定容至100ml100ml。2h2h后方可使用。（防止氧后方可使用。（防止氧化的作用化的作用 ，葡萄糖为单糖，含醛基，易氧化成羧基，加入苯，葡萄糖为单糖，含醛基，易氧化成羧基，加入苯甲酸，平衡向左移动甲酸，平衡向左移动 ）7 7、葡萄糖标准工作液（、葡萄糖标准工作液（5mmol/L5mmol/L）：吸取葡萄糖标准贮存液吸取葡萄糖标准贮存液5.00ml5.00ml放于放于100ml100ml容量瓶中，用容量瓶中，用12mmol/L12mmol/L苯甲酸溶液稀释至刻苯甲酸溶液稀释至刻度，混匀。度，混匀。实验步骤实验步骤受试者前三天正常饮食，停用影响血糖的各种药物，如胰岛受试者前三天正
12、常饮食，停用影响血糖的各种药物，如胰岛素、肾上腺皮质素、儿茶酚胺等。试验前素、肾上腺皮质素、儿茶酚胺等。试验前1 1天晚餐后即不再天晚餐后即不再进食（即空腹进食（即空腹10141014小时）。小时）。次日清晨空腹抽静脉血次日清晨空腹抽静脉血2ml2ml（称为空腹血浆血糖，即（称为空腹血浆血糖，即FPGFPG），），然后将然后将75g75g葡萄糖溶于葡萄糖溶于200 300ml200 300ml温开水中（儿童按每千温开水中（儿童按每千克体重克体重1. 75g1. 75g），令受试者），令受试者5min5min内服内服 下。服后半小时、下。服后半小时、1 1小时、小时、2 2小时、小时、3 3小时
13、各抽一次血，取七支试管按下表操作：小时各抽一次血，取七支试管按下表操作：试管试管试剂试剂实验步骤实验步骤空白管（B）标准管（S）测定管（T0）测定管（T1）测定管（T2）测定管（T3）测定管（T4）血清（ml）0.0200.0200.0200.0200.020葡萄糖标准液（ml）0.020蒸馏水（ml）0.020酶酚混合试剂（ml）3.003.003.003.003.003.003.00实验步骤实验步骤混匀，置混匀，置3737水浴中，保温水浴中，保温15min15min，在波长，在波长510nm510nm处比色，以处比色，以空白管调零，读取标准管及测定管吸光度。然后分别计算出调零，读取标准管及
14、测定管吸光度。然后分别计算出葡萄糖浓度葡萄糖浓度C0C0、C1C1、C2C2、C3C3、C4C4。计算公式计算公式: : 血清葡萄糖（血清葡萄糖（mmol/Lmmol/L）= =（A A测定测定/A/A标准）标准）*5*5将各次血糖测定结果，与相应的时间绘制成糖耐量曲线图，将各次血糖测定结果，与相应的时间绘制成糖耐量曲线图，以便进行分析。以便进行分析。 16 14mmol/L 12糖耐量正常 10糖耐量减退 8空腹血糖损害 6糖尿病性他糖量 4 2 0 30 60 90 120 测定时间（min）葡萄糖耐量曲线葡萄糖耐量曲线注意事项注意事项实验前受试者应充分休息，避免体力活动，试验中亦不能吸实
15、验前受试者应充分休息，避免体力活动，试验中亦不能吸烟、喝咖啡，以免影响实验结果。烟、喝咖啡，以免影响实验结果。实验前受试者应充分休息，避免体力活动，试验中亦不能吸实验前受试者应充分休息，避免体力活动，试验中亦不能吸烟、喝咖啡，以免影响实验结果。烟、喝咖啡，以免影响实验结果。葡萄糖氧化酶对葡萄糖氧化酶对-D-D葡萄糖高度特异，溶液中葡萄糖约葡萄糖高度特异，溶液中葡萄糖约36%36%为为型，型，64%64%为为型。葡萄糖的完全氧化需要型。葡萄糖的完全氧化需要型到型到型的型的变旋反应。新配制的葡萄糖标准液主要是变旋反应。新配制的葡萄糖标准液主要是型，故需放置型，故需放置2h2h以上（最好过夜），待变
16、旋平衡后方可应用。以上（最好过夜），待变旋平衡后方可应用。注意事项注意事项实验前受试者应充分休息，避免体力活动，试验中亦不能吸实验前受试者应充分休息，避免体力活动，试验中亦不能吸烟、喝咖啡，以免影响实验结果。烟、喝咖啡，以免影响实验结果。葡萄糖氧化酶法可以直接测定脑脊液葡萄糖含量，但不能直葡萄糖氧化酶法可以直接测定脑脊液葡萄糖含量，但不能直接测定尿液葡萄糖含量。因为尿液中尿酸等干扰性物质浓度接测定尿液葡萄糖含量。因为尿液中尿酸等干扰性物质浓度过高，可干扰过氧化物酶反应，造成结果假性偏低。过高，可干扰过氧化物酶反应，造成结果假性偏低。因红细胞的酵解将导致测定结果偏低，建议测定样品以草酸因红细胞的酵解将导致测定结果偏低，建议测定样品以草酸钾钾- -氟化钠做抗凝剂以抑制糖酵解。氟化钠做抗凝剂以抑制糖酵解。严重黄疸、溶血及乳糜样血清应先制备无蛋白血滤液，然后严重黄疸、溶血及乳糜样血清应先制备无蛋白血滤液，然后再进行测定再进行测定注意事项注意事项谢谢观赏
