《生物化学实验：凝胶等电聚焦法测定蛋白质等电点》由会员分享，可在线阅读，更多相关《生物化学实验：凝胶等电聚焦法测定蛋白质等电点（6页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、凝胶等电聚焦法测定蛋白质等电点凝胶等电聚焦法测定蛋白质等电点n一、原理一、原理: :nIEF 1966IEF 1966年由瑞典科学家发明。年由瑞典科学家发明。n 蛋白质分子由不同数量和比例的各种氨基酸组成，氨基酸侧蛋白质分子由不同数量和比例的各种氨基酸组成，氨基酸侧链在不同的链在不同的pHpH值环境中所带的电荷不同，当蛋白质处于等电点时，值环境中所带的电荷不同，当蛋白质处于等电点时，它的净电荷为零，因此可利用等电点差异分离。它的净电荷为零，因此可利用等电点差异分离。n 凝胶等电聚焦法的关键是建立稳定的连续的凝胶等电聚焦法的关键是建立稳定的连续的pHpH梯度。用于建梯度。用于建立立pHpH梯度的
2、物质是梯度的物质是两性电解质载体两性电解质载体，它是一种多羧基多氨基的脂，它是一种多羧基多氨基的脂肪族化合物，分子量在肪族化合物，分子量在300-1000300-1000之间。国产和进口的两性电解质之间。国产和进口的两性电解质载体均有各种规格。可以根据需要选择使用。良好的两性电解质载体均有各种规格。可以根据需要选择使用。良好的两性电解质混合物，它的各种成分在等电点时有相当的缓冲能力。混合物，它的各种成分在等电点时有相当的缓冲能力。二、具体实施方法二、具体实施方法n 在凝胶中加入一种名为两性电解质载体在凝胶中加入一种名为两性电解质载体(ampholyte(ampholyte ）的混合）的混合物，
3、在外加电场作用下，凝胶内就会形成一个从正极向负极依次物，在外加电场作用下，凝胶内就会形成一个从正极向负极依次增加的增加的pHpH梯度。在梯度。在pHpH梯度环境中，加入含有不同等电点的蛋白质梯度环境中，加入含有不同等电点的蛋白质混合样品进行电泳，无论它们的原始分布如何，（或在正极端；混合样品进行电泳，无论它们的原始分布如何，（或在正极端；或在负极端；或分布在整个凝胶中或在负极端；或分布在整个凝胶中) )，经过一定时间后，样品中各，经过一定时间后，样品中各组分都将分别聚焦在组分都将分别聚焦在pHpH等于各自等电点的区域，形成分散的蛋白等于各自等电点的区域，形成分散的蛋白质区带，使样品各组分得到分
4、离。分别测定样品各组分聚焦部位质区带，使样品各组分得到分离。分别测定样品各组分聚焦部位凝胶的凝胶的pHpH值，就可以得到它们各自的等电点。由此可知，运用凝值，就可以得到它们各自的等电点。由此可知，运用凝胶等电聚焦法，不仅可以测定蛋白质的等电点，而且还可以将不胶等电聚焦法，不仅可以测定蛋白质的等电点，而且还可以将不同等电点的蛋白质分离。同等电点的蛋白质分离。 蛋白质的分离模式图蛋白质的分离模式图 箭头代表移动方向，箭头长短代表移动速度，箭头代表移动方向，箭头长短代表移动速度，右图为平衡时蛋白质的分离状态。右图为平衡时蛋白质的分离状态。三、实验方法及流程三、实验方法及流程n电聚焦流程：电聚焦流程：
5、n制备载体（加样）制备载体（加样）电泳电泳4h4h剥胶剥胶 固定（固定（本次省略本次省略）测定距离测定距离n 制作制作pHpH梯度梯度测定（电脑作图）测定（电脑作图）实验方法：实验方法： 预先准备洁净玻璃管（预先准备洁净玻璃管（0.59cm0.59cm）两根，下端封闭垂直插在管架上。）两根，下端封闭垂直插在管架上。按下列配方在小烧杯内配制凝胶溶液（按下列配方在小烧杯内配制凝胶溶液（5mL5mL）1 1、凝胶贮备液、凝胶贮备液 2.5mL2.5mL2 2、两性电解质载体、两性电解质载体 0.25mL0.25mL（老师处老师处）3 3、2%TEMED 0.25mL2%TEMED 0.25mL4 4
6、、蛋白质样品、蛋白质样品 （经计算有（经计算有1mg1mg左右）左右）5 5、蒸馏水、蒸馏水( (超纯水）超纯水） （适量）（适量）6 6、10%10%过硫酸铵过硫酸铵 0.05mL0.05mL（最后加）（最后加） 轻轻混匀，立即用滴管装管至离上端轻轻混匀，立即用滴管装管至离上端0.5cm0.5cm处，再缓慢加蒸馏水处，再缓慢加蒸馏水3-3-5mm5mm高，静止聚合高，静止聚合3030分钟。待凝胶与水之间有明显界面时，即聚合完分钟。待凝胶与水之间有明显界面时，即聚合完毕。毕。n聚合后，在电泳槽中电泳聚合后，在电泳槽中电泳2-42-4小时。小时。n剥胶（用长针头注射器）剥胶（用长针头注射器）n量
7、距离（整条胶长，条带至正极长度）量距离（整条胶长，条带至正极长度）n制作制作pHpH梯度，梯度，0.5cm0.5cm从正极端切，放在细胞盘里，加从正极端切，放在细胞盘里，加1mL1mL蒸蒸馏水，摇床馏水，摇床0.5-10.5-1小时，用精密小时，用精密pHpH试纸测定。试纸测定。n电脑作图（找出等电点）。电脑作图（找出等电点）。SDS-PAGESDS-PAGE和和IEFIEF的异同的异同n相同：相同：n1 1、都是蛋白质电泳、都是蛋白质电泳n2 2、都用聚丙烯酰胺做载体、都用聚丙烯酰胺做载体n不同：不同：n1 1、分离原理不同，、分离原理不同，IEFIEF按按pI, pI, SDS-PAGESDS-PAGE按分子量按分子量分离。分离。n2 2、载体形状不同，、载体形状不同， IEF-IEF-柱状，柱状， SDS-PAGE-SDS-PAGE-平板。平板。n3 3、IEFIEF中聚丙烯酰胺为抗对流介质，中聚丙烯酰胺为抗对流介质，SDS-PAGESDS-PAGE中中聚丙烯酰胺为分子筛。聚丙烯酰胺为分子筛。
