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1、Page 0微生物限度检验及控制微生物限度检验及控制2009Page 1教程目的教程目的1.GMP检查中常见的缺陷2.微生物限度检查的定义3.微生物限度检查的样品处理4.微生物限度检查用培养基及其灵敏度检查5.微生物限度检查方法和验证Page 21 GMP检查中常见的缺陷检查中常见的缺陷XXX止咳糖浆中含有防腐剂，但成品的微生物限度检验操作规程未严格按照2000年版中国药典的要求制定，未考虑到防腐剂对试验的影响，检验方法不合理。纯化水微生物限度检测方法未验证，实际检测方法不合理，样品被稀释了1660倍后再用直接接种法进行检测。微生物限度检查的原始记录缺少所用培养基的名称、配制批号。注射用水、纯
2、化水检测中，未按2005版药典要求进行霉菌和酵母菌数的检验。Page 32. 定义定义 测定所有药用材料（从原料到成品）中需氧微生物的数量的方法。证明所有药用材料（从原料到成品）中无特定微生物的方法。Page 43. 取样及样品处理取样及样品处理我们期望什么我们期望什么?在整批产品中特定微生物的数量。我们做的是什么测试我们做的是什么测试?限度是一个破坏性的实验 我们不能对整批进行100%检验。如何通过检验来证明整批产品的微生物数量？如何通过检验来证明整批产品的微生物数量？要求有一个取样计划来涵盖整个批号。有足够的取样量和检验量无抑菌因素Page 5如何对批进行取样？如何对批进行取样？样品必须具
3、有批代表性：最易污染的位置取样：批开始、结束及重大故障和调整后连续性随机性上述取样过程要有文件规定和记录3.1 取样及样品处理取样及样品处理_ 取样计划取样计划Page 6取多少样取多少样 （检验数量）（检验数量）?药典规定检定量是：药典规定检定量是：10克或克或10毫升毫升同时要考虑检验损耗和复试同时要考虑检验损耗和复试3.2 取样及样品处理取样及样品处理_ 取样量取样量Page 7目的目的溶解：避免读数时的干扰溶解：避免读数时的干扰匀质：保证检验量匀质：保证检验量消除抑菌因素：提高检验灵敏度消除抑菌因素：提高检验灵敏度3.3 取样及样品处理取样及样品处理_ 供试液的制备供试液的制备Page
4、 8方法方法:10ml/g样品，加无菌氯化钠蛋白胨至样品，加无菌氯化钠蛋白胨至100ml, 1小时内小时内使用使用3.3 取样及样品处理取样及样品处理_ 供试液的制备供试液的制备无抑菌性水溶性液体样品：无抑菌性水溶性液体样品：无需处理无需处理无抑菌性油性液体样品：无抑菌性油性液体样品：加聚山梨酯加聚山梨酯20、80; 乳浊液（乳浊液（45,30min,70%。药典无要求药典无要求检查频率：每次灭菌批（至少灭菌参数变更后检查频率：每次灭菌批（至少灭菌参数变更后Page 134.3 微生物限度检查用培养基微生物限度检查用培养基_ 保存保存应规定保存有效期应规定保存有效期: 在密闭容器中一年，非密闭
5、容器中一月在密闭容器中一年，非密闭容器中一月2-25保存保存确保确保pH在密闭容器中保存在密闭容器中保存Page 14使用三种微生物培养基有效控制微生物培养基的保存和效期4.4 微生物限度检查用培养基微生物限度检查用培养基_结论结论Page 155. 微生物限度检查微生物限度检查方法方法药典规定两种方法药典规定两种方法:平皿法平皿法: 加1ml样品制备液至无菌平皿中，倒15-20ml, 45培养基混匀倒置培养 。至少制备2个平板。控制菌落数在30-100CFU（细菌），30-80CFU（真菌）薄膜过滤法薄膜过滤法 ：制备液用0.45m膜过滤并用3x100ml无菌蛋白胨水淋洗后，菌面朝上贴与培养
6、基上。每种培养基制备一张膜控制菌落数100CFU /膜Page 16若样品本身的混浊，会干扰计数结果若样品本身的混浊，会干扰计数结果要考虑对样品中抑菌因素进行中和要考虑对样品中抑菌因素进行中和0.5大豆磷脂大豆磷脂4聚山梨醇酯聚山梨醇酯由于接种量限制，试验灵敏度受局限由于接种量限制，试验灵敏度受局限操作简便，设备要求低操作简便，设备要求低5.1 微生物限度检查微生物限度检查方法方法_平皿法平皿法Page 17操作复杂，设备要求高操作复杂，设备要求高不适用于无法溶解的样品不适用于无法溶解的样品大体积检验量，检验灵敏度不受局限大体积检验量，检验灵敏度不受局限样品中的抑菌因素可被滤除样品中的抑菌因素
7、可被滤除中和试剂可应用在淋洗液中，如：中和试剂可应用在淋洗液中，如：-内酰胺酶内酰胺酶分散剂可作为溶剂，如十四烷酸异丙酯分散剂可作为溶剂，如十四烷酸异丙酯5.2 微生物限度检查微生物限度检查方法方法_薄膜过滤法薄膜过滤法Page 18 两种方法的共同点两种方法的共同点: - 培养基和培养温度 - 培养时间 - 工作环境：100级区域进行（一般是要求与生产的洁净条件一致）5.3 微生物限度检查微生物限度检查方法方法Page 19TSB培养基中增菌培养培养基中增菌培养2天天金葡菌：金葡菌：划线甘露醇氯化钠琼脂划线甘露醇氯化钠琼脂3035，培养，培养1 1天。革兰氏染色天。革兰氏染色显微观察。显微观
8、察。 无阳性球菌无阳性球菌大肠、沙门和绿脓：大肠、沙门和绿脓：划线麦康凯琼脂划线麦康凯琼脂3035，培养，培养1 1天，革兰氏染色显微观天，革兰氏染色显微观察。察。 无阴性杆菌无阴性杆菌 控制菌检查控制菌检查:5.4 微生物限度检查微生物限度检查方法方法Page 20方法验证试验方法验证试验 _ 证明在试验条件下没有抑菌作用，如：证明在试验条件下没有抑菌作用，如：防腐剂，抗生素，中和剂，表面活性剂，防腐剂，抗生素，中和剂，表面活性剂， 下列情况应进行重新验证：下列情况应进行重新验证：检验方法变更培养基变更（包括，灭菌参数变更）产品处方变更菌种菌种：大肠、金葡、枯草、白念、黑曲霉、控制菌5.5
9、微生物限度检查微生物限度检查方法方法_ 方法验证方法验证Page 21方法验证试验方法验证试验 _ 证明在试验条件下没有抑菌作用，如：证明在试验条件下没有抑菌作用，如：防腐剂，抗生素，中和剂，表面活性剂，防腐剂，抗生素，中和剂，表面活性剂， 下列情况应进行重新验证：下列情况应进行重新验证：检验方法变更培养基变更（包括，灭菌参数变更）产品处方变更挑战菌液挑战菌液：大肠、金葡、枯草，稀释至50-100cfu/ml待用白念、黑曲霉，稀释至30-80cfu/ml待用5.5 微生物限度检查微生物限度检查方法方法_ 方法验证方法验证Page 22验证方法：验证方法：试验组：挑战菌液样品制备后进行试验供试品
10、对照组：样品制备后进行试验菌液组：挑战菌液进行试验空白对照组：直接用稀释液进行试验5.5 微生物限度检查微生物限度检查方法方法_ 方法验证方法验证Page 23验证合格标准验证合格标准细菌、霉菌及酵母菌计数试验细菌、霉菌及酵母菌计数试验空白对照组无菌生长空白对照组无菌生长菌液组无杂菌生长菌液组无杂菌生长（试验组供试品对照组）（试验组供试品对照组）菌液组菌液组 70控制菌检查试验控制菌检查试验空白对照组无菌生长空白对照组无菌生长菌液组无杂菌生长菌液组无杂菌生长对试验组的菌落鉴定，确认是所接种挑战菌株对试验组的菌落鉴定，确认是所接种挑战菌株5.5 微生物限度检查微生物限度检查方法方法_ 方法验证方
11、法验证Page 24报告：（平均计数报告：（平均计数稀释倍数）稀释倍数）若在若在1:10稀释样品中没有检出，报告稀释样品中没有检出，报告10cfu/g(ml)若平均值有小数，应取整数后乘稀释倍若平均值有小数，应取整数后乘稀释倍数，例如：数，例如：1:10稀释样品：平板1: 1cfu; 平板2：0cfu; 平均为0.5报告结果是10cfu/ml, 而不是5cfu/ml5.6 微生物限度检查微生物限度检查方法方法_ 结果判断结果判断Page 25结论结论:有三种检验方法，但所用培养基、培养温度、时间相同检验方法应验证证明，在试验条件下没有抑菌效应5.7 微生物限度检查微生物限度检查方法方法_ 结论
12、结论Page 26培养基培养基:细菌细菌: 大豆胰蛋白琼脂，大豆胰蛋白琼脂， 30-35 ，培养，培养48小时小时霉菌酵母：沙氏葡萄糖，霉菌酵母：沙氏葡萄糖， 20-25 ，培养，培养5天天6. 微生物限度检查微生物限度检查_USP 介绍介绍 Page 27美国药典：美国药典：多管法多管法6. 微生物限度检查微生物限度检查_USP 介绍介绍 Page 28中国药典中对控制菌检查有类似方法中国药典中对控制菌检查有类似方法要考虑对样品中抑菌因素进行中和要考虑对样品中抑菌因素进行中和0.5大豆磷脂大豆磷脂4聚山梨醇酯聚山梨醇酯由于接种量限制，试验灵敏度受局限由于接种量限制，试验灵敏度受局限操作复杂，设备要求高操作复杂，设备要求高适用于无法溶解的样品适用于无法溶解的样品6. 微生物限度检查微生物限度检查_USP 介绍介绍 美国药典：美国药典：多管法多管法Page 296. 无菌检验无菌检验USP 29 Ph.eur supplement 6th 2.6.13中国药典中国药典 附录附录 XI J JP XV SECTION 35BP 2002 Appendix XVI BTGA guidelines 2004 App17ISO 14730.2 参考资料参考资料Page 30谢谢谢谢您您的的出出席席王旭电话：50801010-5941
