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1、尼古丁抗雌激素作用研究尼古丁抗雌激素作用研究医学检验医学检验10021002班班设计参与者:张志慧 魏冬梅 齐天琪 谷怡珊 冯智才一一. . 【研究背景及立论依据】【研究背景及立论依据】 雌激素雌激素是一类有广泛生物活性的甾体化甾体化合物合物,它有促进和维持生殖器官和副性征的生理作用,可应用临床治疗疾病应用临床治疗疾病。雌激素对不仅细胞增殖起促进作用，还能诱导乳腺癌和子宫诱导乳腺癌和子宫内膜癌的发生及发展内膜癌的发生及发展。 因此如何拮抗或减弱雌激素的作用以治疗雌激素依赖性疾病成为研究热点，并具有重要的临床意义。 尼古丁尼古丁又叫烟碱，是一种吡啶族生物碱，它可以通过呼吸道、鼻粘膜、皮肤迅通过呼
2、吸道、鼻粘膜、皮肤迅速吸收入人体速吸收入人体，并通过尿液、胆汁、唾液、胃液、汗液和乳汁排泄。 尼古丁作为烟中碱类的主要成分，具有拮抗雌激素作用。拮抗雌激素作用。二二. .【设计思路】【设计思路】 本实验通过对家兔行双侧去卵巢手术双侧去卵巢手术后阴性对照组阴性对照组、尼古丁组尼古丁组和阳性对照组，阳性对照组，采用放射性配基结合分析法放射性配基结合分析法测定各组放射性，放射性，通过各浓度组放射活性与阴性对照组比较各浓度组放射活性与阴性对照组比较探讨尼古丁是否通过竞争结合ER途径显示抗雌激素样作用,为进一步研究作用机制提供理论依据。技术路线三三. .【实验内容实验内容】实验步骤实验步骤观察指标观察指
3、标预期结果预期结果 卵巢切除术卵巢切除术 子宫雌激素受体子宫雌激素受体( ER)抽提液的制备抽提液的制备测定子宫雌激素受体测定子宫雌激素受体( ER)抽提液蛋白含量抽提液蛋白含量 尼古丁与受体结合亲和力竞争性取代试验尼古丁与受体结合亲和力竞争性取代试验 统计学处理统计学处理1 1 实验步骤实验步骤1 1）卵巢切除术）卵巢切除术 实验动物适应性饲养1w 双侧卵巢摘除术 处死阴道脱落细胞学检查取出子宫剥离脂肪,冻存于液氮1w 2)子宫雌激素受体子宫雌激素受体( ER)( ER)抽提液的制备抽提液的制备冻存子宫快速剪碎加入抽提缓冲液匀浆差速离心，去沉淀上清液即为ER胞浆液每管按编号加入试剂(见表一）
4、静置3分钟混匀以第1管为空白，于波长595nm处比色，读取吸光度，作图另取试管另取试管样品液考马斯亮蓝染液静置3分钟，595nm比色分析3)3)测定子宫雌激素受体（测定子宫雌激素受体（ERER）抽提液的制备）抽提液的制备组别组别1（空白）（空白）234567标准蛋白液标准蛋白液/ml 0.9%NaCl/ml 考马斯亮蓝染考马斯亮蓝染液液/ml 蛋白质浓度蛋白质浓度（g/ml） A595nm 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度标准曲线测定表标准曲线测定表尼古丁反应体系阳性对照体系阴性对照体系加胞浆液及3H-E216小时加DCC，混匀冰浴、离心FJ-2101G计数放射活性4)4)
5、尼古丁与受体结合亲和力竞争性取代试验尼古丁与受体结合亲和力竞争性取代试验5)5) 统计学处理统计学处理SAS12. 0软件单因素方差分析及Speaman相关分析Origin软件3H - E2特异性结合指数浓度图受试物受试物 浓度浓度(mol/ L) 3H - E2 特异结合指数特异结合指数( %)E2 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 10-10 10-11 10-12尼古丁尼古丁 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 10-10 10-11 10-12蒸馏水蒸馏水2 2观观察察指指标标3 3 预期结果预期结果(1)(1)随着尼古丁浓度的升高随着
6、尼古丁浓度的升高, ,其与家兔子宫胞浆其与家兔子宫胞浆ERER结结合的合的3H- E2有明显降低有明显降低。且尼古丁反应体系的3H - E2特异结合指数(%)与阳性对照E2反应体系中的变化趋势趋于一致。说明，尼古丁可以竞争性结合尼古丁可以竞争性结合激素受体激素受体。尼古丁各浓度组放射活性与阴性对照组比较, 差异无统计学意义。(2)(2)随着尼古丁浓度的升高随着尼古丁浓度的升高, ,其与家兔子宫胞浆其与家兔子宫胞浆ERER结结合的合的3H-E2没有明显降低没有明显降低。即尼古丁反应体系的3H - E2特异结合指数(%)几乎不随尼古丁浓度的改变而变化，而阳性对照E2反应体系中的特异性结合指数(%)
7、随E2浓度升高，明显降低。 说明，尼古丁可能与雌激素受体结合与雌激素受体结合，但其其作用的配体位点与雌激素明显不同作用的配体位点与雌激素明显不同。两者之间不不存在竞争结合存在竞争结合；尼古丁可能不与雌激素受体结合不与雌激素受体结合，而是通过其他未知途径干扰雌激素和雌激素受体通过其他未知途径干扰雌激素和雌激素受体的结合过程的结合过程。尼古丁各浓度组放射活性与阴性对照组比较, 差异无统计学意义。四四. .【实验材料】【实验材料】1 受试物与主要试剂受试物与主要试剂: : 95纯净的烟碱（尼古丁）; 6 ,7 - 3H 雌二醇(3H - E2 ) ,48 Ci/ mmol; 17 -雌二醇(estr
8、adiol ,E2 ); 2 ,5-二甲基恶唑(PPO); 1 ,4-双-2- 15-苯基恶唑-苯(POPOP);（1 1）受试物配制受试物配制: : 尼古丁溶于无水乙醇,配制成310 - 3mol/L 母液,置-20保存。（2 2） 实验溶液的配制实验溶液的配制: : 雌激素受体抽提缓冲液雌激素受体抽提缓冲液: : Tris 10mmol/ L ,EDTA 1 mmol/ L ,用1 mol/ L HCl调pH至7.4 ,体积分数为10 %的甘油,4 保存,临用前每100 ml 缓冲液加43ml巯基乙醇。 活性炭活性炭- -葡聚糖葡聚糖(DCC)(DCC)悬液悬液: : Tris 10 mm
9、ol/ L ,DextronT - 70 0.025 g/ L ,用1 moL/ L HCl 调pH 至8.0 ,4保存。临用时每100 ml 加入0.25 g 活性炭,充分搅拌。 闪烁液闪烁液:PPO 5.5g,POPOP 0.07g,溶于1L二甲苯。 2 2 实验动物实验动物: :采用体重3.0-3.5公斤的新西兰种雌兔新西兰种雌兔（家兔）（家兔）,去卵巢一周后取子宫,-80 保存,一周内测定。整个实验过程中,动物自由摄食和饮水,室温2023,相对湿度65%-75% ,12h/12h 明暗周期。五五. . 【创新性与可行性】【创新性与可行性】1 1 创新性创新性（1 1）立题创新）立题创新
10、 以根据现实生活中普遍存在的二手烟为立足点，联想二手烟中的主要成分尼古丁对于人联想二手烟中的主要成分尼古丁对于人体的影响体的影响。本组成员通过查找各类相关文献，发现与我们惯性思维所认为的致癌有毒的尼古丁有差异，研究表明尼古丁不一定是可怕的致癌凶手，其本身不引起肿瘤，相反，尼古丁在人体尼古丁在人体中存在抗雌激素的作用中存在抗雌激素的作用。尼古丁对于由雌激素诱导的疾病如子宫内膜异位症、子宫肌瘤及乳腺纤维腺瘤等具有临床治疗意义。（2 2） 方法创新方法创新 本实验采用相对简单、易于理解的放射放射性配基结合分析法性配基结合分析法作为实验骨架技术。通过控制单因素变量，绘制竞争性结合曲线绘制竞争性结合曲线
11、对比实验组和对照组数据结果对比实验组和对照组数据结果，直观判断实验结果。避免过于复杂误差较大的实验设计方法。（3 3） 实验结果临床意义的创新实验结果临床意义的创新 进一步探究尼古丁对雌激素竞争性抑制机制，加深人们尼古丁的认识，通过研究尼古丁及其类似物对靶组织局部抗雌激素作用的机制，为雌激素依赖性疾病提供新为雌激素依赖性疾病提供新的治疗策略的治疗策略。2 2 可行性可行性 实验选用以往常规的家兔作为实验对象，实验对象实验对象熟悉易得，既增加了同学们的动手操作能力，又可探究本设计所要研究的问题； 实验设计思路和方案简单实验设计思路和方案简单，容易理解； 实验项目操作简单操作简单，可行性强； 实验结果通过SAS12.0软件对数据进行单因素方差分析及Speaman相关分析，分析结分析结果可靠果可靠； 本实验研究结果稳定、可靠，重复性好研究结果稳定、可靠，重复性好，为今后科研工作可打下一定的基础。谢谢！
