浙江大学细胞培养基本技术

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1、细胞培养基本技术细胞培养基本技术培养技术培养技术细胞系的建立和鉴定细胞系的建立和鉴定培养物的固定、染色培养物的固定、染色显微镜观察显微镜观察1、细胞培养技术、细胞培养技术细胞原代培养细胞原代培养细胞传代培养细胞传代培养细胞冻存和复苏细胞冻存和复苏细胞的运输细胞的运输1.1.1 1 细胞的原代培养细胞的原代培养是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人工条件下培养使其生存并不断生长繁殖的方法。借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制、细胞的衰老、死亡等生命现象。幼稚状态的组织和细胞，如动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养意义原代培养的最大优点是细胞刚刚离体，生物性状尚未发生很大变

2、化，具有二倍体的遗传性，而且大多数细胞表现出原来组织的特性。利用原代培养做各种实验（药物测试、细胞分化及病毒学方面）效果很好。原代培养也是建立各种细胞系（株）必须经过的阶段。掌握无菌操作技术掌握无菌操作技术了解小鼠解剖操作技术了解小鼠解剖操作技术了解原代细胞培养的一般方法与步骤了解原代细胞培养的一般方法与步骤了解培养细胞的消化分散了解培养细胞的消化分散了解倒置显微镜的使用了解倒置显微镜的使用原代细胞培养的原代细胞培养的实验目的和要求实验目的和要求实验材料实验材料实验动物：孕鼠或新生小鼠液体：细胞生长液（内含20%小牛血清）0.25%胰蛋白酶平衡盐溶液70%乙醇器材：灭菌镊子、剪刀、灭菌培养皿、

3、细胞培养瓶、小瓶、烧杯、吸管、酒精灯原代细胞培养方法原代细胞培养方法胰酶消化法组织块直接培养法冷消化冷消化温消化温消化一次性消化一次性消化分次消化分次消化 消化法：消化法：采用无菌操作的方法，把组织（或器官）采用无菌操作的方法，把组织（或器官）从动物体内取出，经从动物体内取出，经酶消化酶消化处理，使分散成单个细胞，处理，使分散成单个细胞，然后在人工条件下培养，使其不断地生长和繁殖。然后在人工条件下培养，使其不断地生长和繁殖。贴块法法消化法消化法原原代代培培养养方方法法分分类类分次消化分次消化 消化法的分类消化法的分类外植外植块培养步培养步骤图解解操作步骤操作步骤1 1 - - 取材取材用颈椎脱

4、位法使孕鼠迅速死亡。把整个孕鼠浸入盛有75乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，置于无菌的培养皿上。剔除胚胎周围的包膜（若胚胎较大，应剪去头、爪），将胚胎放于无菌的含有平衡盐溶液的培养皿中。漂洗胚胎，去掉平衡盐溶液。继续用平衡盐溶液漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。操作步骤操作步骤2 2 - -切割切割将部分胚胎转移至一个无菌小瓶中，用平衡盐溶液漂洗。然后用眼科手术剪刀小心地绞碎胚胎，直到成1mm3左右的小块，再用平衡盐溶液清洗，洗到组织块发白为止。静置，使组织块

5、自然沉淀到管底，弃上清。胰酶消化法操作步骤胰酶消化法操作步骤 - - 消化、接种培养消化、接种培养视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37中消化20-40min，每隔5min振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。加入3-5ml细胞生长液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。静置5-10min，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。1000rpm，离心5-10min，弃上清液。加入平衡盐溶液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。加入细胞生长液l-2ml（视细胞量），血球计数板计数。将细胞调整到5105/ml左右，转移至25ml细胞培养瓶中，37下培养。胰酶消化法操作步骤胰酶消化

6、法操作步骤 - - 消化、接种培养消化、接种培养也可将此步骤简化为：视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37中消化20-40min，每隔5min振荡一次。静置，吸去上清，用细胞生长液漂洗消化后的组织块，用吸管反复吹打组织块，使细胞分离，静置，使未分散的组织块下沉。取细胞悬液接种至加了细胞生长液的培养瓶中（调整细胞浓度到5105/ml左右），37下培养。（注意：省略了离心、计数等步骤）组织块直接培养法组织块直接培养法操作步骤操作步骤 组织块接种：将组织块转移到培养瓶，贴附于瓶底面。翻转瓶底朝上，将细胞生长液加至瓶中，培养液勿接触组织块。37静置3-5h，轻轻翻转培养瓶，使组织浸入细胞生长液

7、中（勿使组织漂起），37继续培养。原代细胞培养结果原代细胞培养结果细胞接种后一般几小时内就能贴壁，并开始生长细胞接种后一般几小时内就能贴壁，并开始生长如接种的细胞密度适宜，如接种的细胞密度适宜，5-7 d5-7 d即可形成单层即可形成单层1.1.2 2 传代细胞培养传代细胞培养细胞“一代”指从细胞接种到分离再培养的一段期间，与细胞世代或倍增不同。在一代中，细胞培增3-6次培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取出，以1:2或1:3以上的比率转移到新的容器中进行培养，即为传代培养。也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种

8、实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。细胞传代方法细胞传代方法根据细胞生长的恃点，传代方法有3种。1. 悬浮生浮生长细胞胞传代代离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。直接传代法：悬浮细胞慢慢沉淀在瓶壁后，将上清培养液去除1/2-2/3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。2. 半半悬浮生浮生长细胞胞传代代（HeLa细胞）此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。3. 贴壁生壁生长细胞胞传代代采用酶消化法传代。常用消化液是0.25胰蛋白酶液。消化法传代培养步骤消化法传代培养步骤选取

9、生长良好的细胞，在超净工作台的酒精灯旁，倒去瓶中的旧培养液，加入2-3ml的D-Hanks液，轻轻振荡漂洗细胞，以除去悬浮在细胞表面的碎片(思考：还有什么作用？）加入适量0.1-0.25胰蛋白酶消化液，室温消化，倒置显微镜下观察，待细胞单层收缩突起出现空隙时，倒去酶液用Hanks液洗涤1次，加入适量培养液，反复吹打细胞，使其成细胞悬液。以1:2或1:3进行分装，并在培养瓶上做好标记，注明代号、日期，轻轻摇匀，37CO2培养箱培养。观察：细胞培养24h后，即可观察培养液的颜色及细胞的生长情况。贴壁生长细胞传代方法贴壁生长细胞传代方法传代细胞培养结果传代细胞培养结果一般情况，传代后的细胞在2h时左

10、右就能附着在培养瓶壁上，2-4d就可在瓶内形成单层，需要再次进行传代取生长良好的细胞，在超净工作台用无菌吸管把培养瓶中的细胞吹打均匀。转移到无菌的离心管中，盖紧胶盖，平衡后离心（1000rpm/min）5min。(区别贴壁传代)在超净工作台中吸去上清液，加入适量新培养液，用吸管吹打细胞，制成悬液。以1:2或1:3进行分装，并在培养瓶上做好标记，注明代号、日期，轻轻摇匀，37CO2培养箱培养。观察：细胞培养24h后，即可进行观察。悬液细胞的传代培养悬液细胞的传代培养要预先与临床外科医生和护士商量，并做好一切必要的准备工作。争取拿到的标本新鲜、无菌、少坏死等。联系好手术时间后，立即做好如下准备工作

11、：准备1-2个贮有培养液和抗生素的标本收集瓶，将盖盖紧，保持无菌，瓶外贴上标签，写上工作人员名字、地点和电话号码；将收集瓶送往医院，并与医生和护士讲清取手术标本的部位及注意事项。1.3 1.3 人体活检人体活检( (或手术或手术) )材料材料标本放入收集瓶后，送出手术间，立即送往组织培养实验室。工作人员最好是等在手术间外。但有时手术时间难以掌握。则请护士将收集材料的瓶子盖好后，放入4冰箱，尽快打电话通知工作人员。取临床标本时，虽然尽可能做到无菌操作，但仍有污染可能性的存在。可选用抗生素类控制污染。如手术标本比较大（约200mg以上），可将其浸于70%酒精中约30-60秒，这样会减少表面污染而不

12、损坏内部组织的结构和存活。不要用纱布包裹标本，纱布纤维易粘附在组织上。人体活检人体活检( (或手术或手术) )材料材料整个取材过程中，都要注意保持组织的湿润，随时给组织块滴加一些培养液或平衡盐溶液。一般情况下，最好是使用冰冷的液体。在剪碎或切割组织块时，尽量使用锋利的刀剪，防止以钝器对组织揉、捻、撕拉等而造成细胞损伤。整个取材过程耗时越短越好。在万不得已的情况下，取材后也可将组织贮存在冷的(4)含平衡盐溶液(或其它缓冲盐溶液)的营养液中，最好不超过24-48h(视不同组织类型而定)。需要注意的事需要注意的事项1.4 1.4 培养细胞生长测定培养细胞生长测定是肿瘤体外研究中应用最广的技术手段之一

13、。任何培养瓶内生长的细胞都由死细胞和活细胞组成，从形态上区别死、活细胞是困难的。方法：细胞计数法台盼蓝染色法生长曲线法四唑盐（MTT）比色法细胞计数细胞计数用细胞计数法测定细胞生长动力学是目前采用的最普遍的方法。血细胞计数板人工计数 细胞计数器 血细胞计数板：常用的是改良的纽巴氏(Neubauer)血细胞计数板。细胞计数细胞计数实验原理原理：血球计数盘一般有二个chambers，每个chamber中细刻9个1mm2大正方形，其中4个角落之正方形再细刻16个小格，深度均为0.1mm。当chamber上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1mm20.1mm=1.010-4ml。使用时，计数每个大正

14、方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以104，即为每ml中之细胞数目。存活测试为利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。细胞计数细胞计数具体操作具体操作：1.将计数板及盖片用75%酒精擦拭干净，并将盖片盖在计数板。2.吸取少许混合均匀的细胞悬液，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间，静置3min，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。3.计算板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按公式计算：细胞数/mL=四大格细胞总数/4104稀释倍数注意：镜下偶见有两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团10%以上，说明分散不好，需重

15、新制备细胞悬液由于由于死细胞死细胞的的细胞膜通透性细胞膜通透性发生改变，某些染料可发生改变，某些染料可大量进入却不被排出，因而细胞大量进入却不被排出，因而细胞呈色呈色。而。而活细胞活细胞反反之，能排出进入细胞内的染料，因而之，能排出进入细胞内的染料，因而不易着色不易着色。此。此法的原理即是法的原理即是利用死、活细胞对染料的不同反应利用死、活细胞对染料的不同反应而而区分开两种细胞。区分开两种细胞。台盼蓝染细胞时，时间不宜过长（约台盼蓝染细胞时，时间不宜过长（约2 min2 min）。）。台盼蓝排除检测法台盼蓝排除检测法将将1 1滴细胞悬液滴细胞悬液( (贴壁细胞可经贴壁细胞可经0.250.25胰

16、蛋白酶溶胰蛋白酶溶液消化后，吹打制成细胞悬液液消化后，吹打制成细胞悬液) )与与2 2滴台盼蓝液滴台盼蓝液混混合后，合后，滴入细胞计数板滴入细胞计数板。2min2min后，在显微镜下计数至少后，在显微镜下计数至少200200个细胞。未着色个细胞。未着色的为活细胞，呈蓝色的为死细胞。计算活细胞百的为活细胞，呈蓝色的为死细胞。计算活细胞百分比。分比。活体染色与细胞计数活体染色与细胞计数细胞生长曲线的绘制细胞生长曲线的绘制 细胞生长曲线细胞生长曲线(cell growth curve)(cell growth curve)是观测细胞在是观测细胞在一代生存期一代生存期内的内的增生过程增生过程的重要指标

17、，可根据细胞的重要指标，可根据细胞生长曲线分析生长曲线分析细胞增殖速度细胞增殖速度，确定，确定细胞传代细胞传代、细胞细胞冻存冻存或或具体实验具体实验的最佳时间。的最佳时间。它以培养它以培养时间时间为为横坐标横坐标、细胞密度细胞密度为为纵坐标纵坐标作坐标作坐标图。图。 1)1)培养细胞培养细胞 首先首先在在2 2孔培养板内分别接种孔培养板内分别接种相同数量的相同数量的细胞。计数并记录接种的细细胞。计数并记录接种的细胞悬液之密度。接种时间记为胞悬液之密度。接种时间记为0 h0 h。2)2)计数细胞密度计数细胞密度 从接种时间算起，每从接种时间算起，每隔隔2424 h h计数孔内的细胞密度，算出平均

18、值。为提计数孔内的细胞密度，算出平均值。为提高准确率，对每孔细胞可计数高准确率，对每孔细胞可计数2 2- -3 3次。如此操作至第七天结束次。如此操作至第七天结束。l 3) 3)绘制曲线绘制曲线 以培养时间为横坐标、细胞密度以培养时间为横坐标、细胞密度 为纵坐标，将全部结为纵坐标，将全部结果在坐标纸果在坐标纸 上绘图，即得所培养细胞的生长上绘图，即得所培养细胞的生长 曲线。曲线。四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝四唑盐比色法的原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶于水的蓝紫色产物（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜

19、色深浅与所含的formazan量成正比，用酶标仪测定OD570nm值。MTT法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒性试验、肿瘤放射敏感性实验等。四唑盐（四唑盐（MTTMTT）比色法）比色法操作步骤操作步骤四唑盐（四唑盐（MTTMTT）比色法）比色法100L单细胞悬液接种于96孔板(5104)。37、5CO2培养箱中培养一段时间加入2mg/ml的MTT液（50L/孔）；继续培养3h。吸出孔内培养液后，加入DMSO液（150L/孔），将培养板置于微孔板扳荡器上振荡10min，使结晶物溶解。酶标仪检测各孔OD值（检测波长570nm）。记录结果。高浓度血清可影响光吸收值，在加入异丙醇溶液或DMS

20、O前尽量吸净培养液。吸去培养液时动作要慢,以免吸去形成的结晶。1.1.5 5 细胞冻存和复苏细胞冻存和复苏Spallanzani(1776)最早发表了“冷”处理对“细胞”生命活动影响的报道。1900年前后，科学家基本上肯定了生物成分(如精子)能够在零下温度贮存的事实。Polge等人(1949)发现了甘油对低温下贮存细胞的保护作用。Luyet(1951)与Lovelock(1953)等多位学者发现电解质浓度增大是造成冷冻贮存细胞损伤的主要原因。Lovelock等人(1959)发现了一种新的化学保护剂，这就是现在人们熟知的二甲基亚砜(DMSO)。当前低温液氮冻存贮存细胞已是细胞培养室常规性通用技术

21、，贮存时间几乎是无限的。细胞胞冻存存(cryopreservation)(cryopreservation)：将体外培养物悬浮在冷冻保护剂的溶液中，以一定的降温速率降至零下某一温度(-70 )，并在此温度下对其长期保存的过程。复复苏(thawing)(thawing)：以一定的复温速率将冻存的培养物恢复到常温的过程。影响冷冻效果的因素影响冷冻效果的因素1.冷冻速率细胞冷至-5-15之间时，细胞外溶液先出现结冰而细胞内仍保持未结冰状态，细胞内未结冰的水分子会向细胞外流动-冷冻速度慢，细胞内水分外渗多，细胞内溶质浓度增高，细胞内不发生结冰，但脱水严重，细胞体积严重收缩，甚至使细胞失去活性；-冷冻速

22、度快，细胞内水分没有足够的时间外渗，随着温度的下降会发生细胞内结冰，造成细胞膜及细胞器的破坏。影响冷冻效果的因素影响冷冻效果的因素2.冷冻保存温度液氮温度（-196）是目前最佳冷冻保存温度。-70-80条件冷冻保存细胞，短期内对细胞活性无明显影响，时间延长，细胞存活率下降。3.复温速率是在细胞复苏时温度升高的速度一般复温速度越快越好1-2min内从-196升温至37（水浴锅）。4.冷冻保护剂可以保护细胞免受冷冻损伤的物质。渗透性：甘油、DMSO非渗透性：聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、蔗糖、聚乙二醇影响冷冻效果的因素影响冷冻效果的因素甘油或DMSO分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可使冰点下降，提高细

23、胞膜对水的通透性，且对细胞无明显毒性。甘油和DMSO并不能防止细胞内结冰。在使用该类冷冻保护剂时，需要一定的时间进行预冷。慢冻程序慢冻程序标准程序准程序：采用细胞冻存器当温度在-25以上时，12/min当温度达-25以下时，510/min当温度达-100时，可迅速放入液氮(-196C)中简易程序易程序：将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降1-2的速度，在40min内降至液氮表面过夜，次晨投人液氮中。传统程序程序：冷冻管置于41h-201h-8016-18h(或隔夜)液氮槽长期储存低温保护剂的应用低温保护剂的应用在细胞冻存时加入低

24、温保护剂，能大大提高冻存效果。常用的低温保护剂是二甲基亚枫（DMSO），它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。常温下DMSO对细胞的毒副作用较大，在4时，其毒副作用大为减弱，冻存时DMSO平衡应在4下进行。细胞冻存方法细胞冻存方法预先配制冻存液-10DMSO细胞生长液（20血清基础培养液）取对数生数生长期期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液,用吸管吹打制成细胞悬液（1-5106cell/ml)加1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名胞名称和冷称和冷冻日期日

25、期。液氮长期保存注意事项注意事项1.控制冻存细胞的质量2.不宜将冻存的细胞放置在-20过长时间，易引起低温损伤3.冻存小管宜用塑料冻存管保存细胞的复苏方法保存细胞的复苏方法快速解快速解冻冻存细胞从液氮中取出后，立即放入37水浴中，轻轻摇动冷冻管，使其在1min内（不要超过3min）全部融化解冻后的细胞可直接接种到含完全生长培养液的细胞培养瓶进行培养，24h后再用新鲜完全培养液替换旧培养液，以去除DMSO如果细胞对冷冻保护剂特别敏感解冻后的细胞应先通过离心去除冷冻保护剂，然后再接种到含完全生长培养液的培养瓶中1.准备水浴2.取冻存管，入水浴快速晃动至完全融化3.去除DMSO4.加入培养基制成细胞

26、悬液，移入培养瓶培养注意事项注意事项1.尽快使细胞恢复到常温2.尽快离心弃去冷冻保护液，防止对细胞的毒害冻存和复苏的原则：冻存和复苏的原则：慢冻快慢冻快融融冷到零度以下，细胞可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反，结晶就大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。1.1.6 6 细胞的运输细胞的运输由于培养细胞株(系)的商品化，细胞培养室之间的交流、交换和购买已成为生命科学研究中的一个重要组成部分，培养细胞的运输成为研究工作的一个重要环节

27、。如果不了解所要细胞的性状、培养液特点及培养注意事项，运输时不注意使用特殊容器或温度等，就可能影响细胞的生长，或出现差错，或导致培养失败等。装运细胞的主要方法如下：冷冻储存运输充液法细胞的运输细胞的运输- - 冷冻储存运输冷冻储存运输利用特殊容器内盛液氮或干冰的运输方法。保存效果较好，但缺点是比较麻烦，不宜长时间运输，多需空运，代价较大。细胞的运输细胞的运输-充液法充液法一般选择生长良好的细胞，以生长1/31/2瓶底壁为宜，去掉旧培养液，补充新的培养液至瓶颈部，保留微量空气，拧紧瓶盖，并用胶带密封，放在一运送盒内，用棉花等做防震防压处理。运输时间需4-5d，一般放在贴身口袋即可，到达目的地后倒

28、出多余的培养液，只需保留维持生长所需的培养液置37培养，次日传代。如果在市内运输或仅需数小时运输路程，也可将细胞附着面朝上，或把培养液全部倒掉放在胸部口袋运送。靠附着于细胞表面的培养液，可使细胞短时间不受损。2、细胞系的建立胞系的建立正常细胞系正常细胞系癌细胞系癌细胞系转化细胞系转化细胞系细胞克隆细胞克隆正常细胞系建立的程序：正常细胞系建立的程序：原代培养原代培养第一次传代第一次传代常规传代常规传代冻存和复苏冻存和复苏癌细胞系建立的程序：癌细胞系建立的程序：步骤类似正常细胞系建立步骤类似正常细胞系建立注意：注意：取转移灶组织癌细胞、癌最外层组织取转移灶组织癌细胞、癌最外层组织去除癌组织中的间质

29、细胞去除癌组织中的间质细胞-胶原酶法胶原酶法细胞系的维持细胞系的维持细胞系档案要记录好：细胞系档案要记录好：组织来源、培养基要求、传代时间等；组织来源、培养基要求、传代时间等；传代换液有规律，否则会引起生物学特性改变；传代换液有规律，否则会引起生物学特性改变；多种细胞维持传代，要防止交叉污染；多种细胞维持传代，要防止交叉污染；要有充足的冻存储备，防止因污染造成绝种；要有充足的冻存储备，防止因污染造成绝种；细胞暂时不用，最好冻存，以免老化或性状改变。细胞暂时不用，最好冻存，以免老化或性状改变。证明细胞系的种系证明细胞系的种系：人源、鼠源或其他，染色体分析、人源、鼠源或其他，染色体分析、同工酶分析

30、、同工酶分析、DNADNA指纹技术指纹技术明确细胞系的组织来源明确细胞系的组织来源：检测细胞抗原标记的方法检测细胞抗原标记的方法细胞是否是正常细胞，有无发生恶性转化：细胞是否是正常细胞，有无发生恶性转化：正常细正常细胞二倍体特征，恶性转化细胞为异倍体胞二倍体特征，恶性转化细胞为异倍体细胞有无交叉污染：细胞有无交叉污染：同工酶方法，同工酶方法，DNADNA指纹技术也可以鉴指纹技术也可以鉴定定鉴定细胞系的内容鉴定细胞系的内容3 3、细胞培养物的固定、染胞培养物的固定、染色色培养物的常用固定方法染色方法2.1常用固定方法常用固定方法 固定细胞的目的： 把组织和细胞的原有结构尽可能完整地保存下来，避免

31、组织和细胞发生降解、自溶、腐败和变形等，使细胞的化学物质和酶能准确定位，使细胞的各部分易于着色、适于观察、长期保存和分析。2.1常用固定方法常用固定方法 固定细胞的原则： 尽可能选用新鲜培养物，根据检测工具、对象、目的和要求选择固定剂和固定方法。 培养物的准备和固定前处理 各种细胞培养物。双盖片悬滴和悬液培养物：离心-PBS漂洗2-3次，固定制片；盖片单层培养物：盖片从培养器中取出-PBS漂洗2-3次，固定常用固定液常用固定液简单固定液：固定液：甲醇、乙醇、醋酸、甲醛、戊二醛、丙酮、苦味酸、铬酸、重铬酸钾、氯化汞、氯化镉、锇酸混合固定液：混合固定液：Mueller固定液、Flernming固定

32、液、FAA固定液、Carnoy固定液、Rossman固定液、Altmann固定液、Bouing固定液常用固定液常用固定液固定液用途固定液用途4%甲醛-PBS (1:9)大标本、染色体、线粒体、高尔基体戊二醛蛋白质、微管和膜性结构丙酮纯冷丙酮固定细胞内酶甲醇/醋酸(3:1)培养细胞、染色体，现用现配乙醇 (70-100%)血纤维蛋白、色素、弹性纤维、细菌和白细胞FAA固定液盖片单层培养的细胞醋酸(0.3-5%)减少其它固定剂引起的细胞收缩Carnoy固定液单层细胞1%苦味酸白蛋白、核蛋白、球蛋白、组蛋白和核酸Bouing固定液双盖片培养细胞的糖原锇酸(1-2%)结膜、细胞结构4%多聚甲醛-PBS

33、肾纤维蛋白、细胞骨架蛋白FAA固定液固定液：90ml80%的酒精中加入冰乙酸和40%甲醛各5mlCarnoy固定液：固定液：60ml纯乙醇中加入氯仿30ml及冰乙酸10mlBouing固定液：固定液：75ml饱和苦味酸（100ml水中加入1.2-1.4g）过滤，加入25ml福尔马林（40%甲醛，有沉淀时禁用），再加入5ml冰醋酸（最好用前加）4%多聚甲多聚甲醛-PBS：50ml蒸馏水中加入4g多聚甲醛，加热至60-70oC，边搅拌边逐滴加入2M的NaOH至液体清澈透明；用1M的HCl调pH至7.4，冷却后加入10mM的PBS至100ml锇酸：酸：在棕色试剂瓶中加入50-100ml的0.1MPB

34、S（pH7.0-7.4），再将装有1g锇酸的安培瓶放入，击碎安培瓶，摇晃使锇酸溶解2.2 染色方法染色方法染色是利用化学染料与细胞及各种细胞器发生化学作用和/或吸附作用，使各种细胞结构能够通过染色而改变其折射率，从而清晰的显现出来。影响因素：影响因素：所用的固定液染液的pH值：组织的酸性成分用pH偏高的染液，碱性成分用偏酸染液1）Giemsa染色染色简便、快速，适用于多种细胞和染色体染色染色液现用现配，保存时间最好不超过48h；Giemsa液对pH敏感。母液制母液制备：Giemsa粉0.5g，甘油22ml，在研钵内将少量甘油和Giemsa粉混合研磨至无颗粒，加入剩余甘油，56oC保温2h，加入

35、33ml甲醇，棕色瓶保存。1）Giemsa染色染色染色步染色步骤 （盖片培养或涂片法）：（盖片培养或涂片法）：1）Sorensenbuf和Giemsa染液9:1体积比混合即得到染色液2）用甲醇固定细胞标本10min，或醋酸/甲醇(1:3)固定30min3）用滴管将染色液布满材料面（不要有气泡）4）染色10-15min，用自来水将玻片冲洗干净，空气干燥，二甲苯透明5）光学树脂胶封片后观察结果：果：细胞核染成紫红色或蓝紫色，胞浆染成粉红色2）苏木精）苏木精-伊红染色伊红染色染液制染液制备：1）苏木精染液(20):苏木精0.5g，铵矾(NH4)2SO4Al2(SO4)324g，H2O50ml，NaI

36、O30.5g，甘油30ml，冰醋酸2ml。2）1%伊红染液：1g伊红溶于100ml蒸馏水。2）苏木精）苏木精-伊红染色伊红染色染色步染色步骤 （盖片培养法）：（盖片培养法）：1）37oC温PBS中漂洗3次，每次20-60sec，中性福尔马林固定30min2）蒸馏水漂洗1次，用蒸馏水稀释的1苏木精染液染色10min，自来水洗后置入1%NaHCO3中漂洗至蓝紫色3）伊红水溶液中染0.5-1min，蒸馏水洗后迅速通过丙酮2次，每次3-5min4）通过2:1和1:2丙酮/二甲苯各3次，每次1-2min；纯二甲苯5-10min5）用光学树胶封片（注意勿将盖片的细胞面放反）后观察结果：果：细胞核染成红色，

37、胞质染成蓝紫色3）吖啶橙染色）吖啶橙染色吖啶橙橙(acridine roange, AO)：常用荧光染料，可用于活细胞、固定细胞染色，可与细胞中DNA和RNA结合而发出不同颜色的荧光，DNA亮绿色，RNA橘红色至火红色。快速、简便、并有一定特异性。染液配制：染液配制：用生理盐水将AO配成1%的母液，冰箱保存，用时则0.1M的PBS（pH4.8）稀释成0.01%工作液。3）吖啶橙染色）吖啶橙染色染色步染色步骤 （盖片培养）：（盖片培养）：1）Hanks液洗盖玻片上的贴壁细胞3次2）用95%乙醇固定细胞标本15-30min，滤纸吸干3）1%醋酸作用30sec，PBS清洗1min4）用0.01%的A

38、O染液染色1-5min，PBS清洗1min5）0.1MCaCl2分色0.5-2min，PBS清洗3次，每次数秒6）1:1的甘油:PBS封片，立刻观察(用激发波405的滤光片)4）免疫荧光染色）免疫荧光染色原理：原理：用荧光素标记已知抗体或抗原，检查细胞或组织标本中相应的抗原或抗体。在荧光显微镜下，抗原抗体特异性结合部位的荧光素受激发光照射而发出明亮的荧光。荧光素：光素：异硫氰酸荧光素（FITC）：发射荧光波长为490-619nm（黄绿色荧光）四乙基罗丹明（RB200）：发射荧光波长为540-660nm（橙红色荧光）4）免疫荧光染色）免疫荧光染色染色步染色步骤 （间接接荧光染色法）：光染色法）：

39、1）用95%乙醇固定单层细胞标本10-30min，或冷丙酮固定5-10min， PBS洗3次，每次5min，边洗边震荡2）滴加未标记的一抗液，37oC湿盒中30min， PBS洗3次，每次5min，边洗边震荡3）滴加荧光标记二抗， 37oC湿盒中30min，PBS洗3次，每次5min，边洗边震荡4）去除玻片周围及材料上的水分5）荧光显微镜下观察5）细胞活体染色）细胞活体染色台盼蓝台盼蓝用Hanks液配制0.1%台盼蓝溶液用等比的0.5%胰酶和0.2%EDTA混合液消化贴壁细胞加入适量Hanks液制成细胞悬液，每ml悬液中加入0.1%的台盼蓝溶液10ul并混匀细胞计数板计数1000个细胞中的活细

40、胞（折光性强且不着色）和死细胞（染为蓝色）数目6）细胞骨架染色）细胞骨架染色微微丝：PBS洗盖片培养的细胞3次，每次0.5min2%的甲醛/PBS液固定3min0.5%的三硝基甲苯/PBS处理3次，每次10min，PBS漂洗3次用罗丹明（rhodamine）标记的鬼笔环肽（phalloidin）（1:10）室温中反应15min，PBS漂洗3次60%甘油+荧光防淬剂封片后荧光显微镜观察6）细胞骨架染色）细胞骨架染色微管：微管：PBS洗盖片培养的细胞3次，每次0.5min3%的甲醛/PBS液室温固定20min0.5%的三硝基甲苯/PBS处理3次，每次10min，PBS漂洗3次，最后用滤纸吸干多余的

41、PBS投入冷丙酮中（-1020oC）7min，PBS漂洗3次，最后用滤纸吸干多余的PBS6）细胞骨架染色）细胞骨架染色微管：微管：向一干净平皿中央滴一滴浓度为0.1-0.2mg/ml的一级抗微管蛋白抗体，令小盖片细胞面向下扣在抗体液上，将平皿置37oC温箱中45-60min（加水盒）向平皿中缓缓加入PBS，浮起盖片并用镊子夹出，PBS漂洗3次，最后用滤纸吸干多余的PBS向另一干净平皿中央滴一滴荧光标记的二抗（0.1-0.2mg/ml），然后同操作和滴甘油/PBS（1:9，pH8.5）少许于载物片上，把小盖片的细胞面覆以大盖片上，并荧光显微镜观察4 4、显微微镜观察察3.1 光学显微镜光学显微镜

42、成像原理：成像原理：光线自反射镜折射入聚光器F1增强后照射在标本上；标本的像经物镜放大成倒像F2；目镜将此物象进一步放大在人眼视网膜上成正像F3。构造：构造：机械部分/照明部分/光学部分光学显微镜的种类光学显微镜的种类反差方式反差方式反差方式反差方式机制机制机制机制说明说明说明说明亮视野亮视野反差取决于光吸收常结合组织染色技术来提高反差相差相差将相位差转变为振幅差反差与局部的相密度成正比，包括线粒体、染色体、溶酶体等分光干涉分光干涉相差相差转换通过样品的光程相位差的变化率光经过细胞和细胞器边缘时光程突然变化形成强烈反差暗视野暗视野散射光观察产生细胞和细胞器边缘的轮廓图像干涉反射干涉反射反差取决

43、于相互靠近的空间表面之间发生的衍射用于观察细胞培养中细胞与基底间的接触带偏振光偏振光在低于光学分辨率的情况下检测具有双折射性的超分子组织结构用于定性排列结构的研究，如细胞骨架、有丝分裂的微管以及强韧纤维、膜的观察荧光荧光反差取决于荧光基团的光吸收及光衍射仅限于适当的自发荧光和荧光标记光学显微镜观察的一般过程光学显微镜观察的一般过程普通光学显微镜相差显微镜荧光显微镜暗视野显微镜偏振光显微镜干涉显微镜扫描隧道显微镜原子力显微镜视频显微镜共聚焦显微镜1）相差显微镜）相差显微镜调节：1）将显微镜合轴，并把视野圈开大至与聚光器光阑边缘一致2）将与物镜放大倍数一致的相板放入聚光器中3）把调中目镜换到目镜筒

44、中，旋动调中目镜上的调焦环至相板相环的图像清晰（分别是两个明暗不同的圆形图像）4）调节聚光器上的相环调中旋钮（注意不要旋动聚光器的调中纽），使两个圆环图像重叠成同心圆5）用普通目镜换下调中目镜并观察1）相差显微镜）相差显微镜注意事注意事项：1）换不同倍率的物镜时，要选用一致的相板和相环，并重新调中2）载物片或培养瓶的表面要平整、均匀、干净，标本不能太厚，以免影响观察效果3）标本要在有水的环境中（如培养瓶的培养液、水封片等）成像效果才明显4）光路上最好加单色（如黄绿色）滤光片，使其分辨率达到最高2）荧光显微镜）荧光显微镜调节：1）打开电源开关，当电压表的指针稳定在220V时，打开高压汞灯开关，预

45、热10min，移开光帘，光线进入光路2）将灯前镜摆出光路，插入合适滤光片；把标本放在载物台上，选25物镜，调焦到成像；调节聚光器调中钮使光圈图像居中，然后恢复光圈到与视野等大3）将灯前镜摆入光路，拨动灯前镜调焦杆，使灯影光斑清晰；调节灯泡调中钮使灯影光斑居中，然后调节反射镜调中钮，使反射影光斑居中；最后将灯前镜摆出光路，即可观察样品2）荧光显微镜）荧光显微镜注意事注意事项：1）观察对象必须是自发荧光或已被荧光染料染色的标本2）载物片、盖玻片及镜油应不含自发荧光杂质3）选用效果好的滤光片4）荧光标本很易褪色，操作、观察要迅速5）启动高压汞灯后，不得在15min内将其关闭；关闭后，必须待汞灯冷却后

46、方可再次打开6）若暂不观察标本，可用阻光光帘阻挡光线，以保护标本7）若常时间观察荧光标本最好戴护目镜3）暗视野显微镜）暗视野显微镜调节：1）按调节普通显微镜方法调节好后，换上暗视野聚光器和被检标本片2）调节聚光器和物镜的上下工作距离，看到标本的图像3）调节聚光器的上下轴和中轴，在视野清晰的前提下，背景越暗越好4）把灯泡亮度、视野光圈和聚光器的孔径光圈开到最大，此时暗视野效果最佳3）暗视野显微镜）暗视野显微镜注意事注意事项：1）聚光器与物镜的数值孔径应合理匹配，物镜的数值孔径必须小于聚光器的数值孔径2）盖玻片和载物片应清洁无痕，否则，会出现明亮的散射光影响观察3）必须在聚光镜和载片之间加香柏油，

47、以维持暗视野和保证观察效果4）激光共聚焦扫描显微镜）激光共聚焦扫描显微镜激光共聚焦扫描显微系统由一个激光扫描显微镜在物镜的成像面上加一个针孔组成。只有被照亮点发出的光才能通过共焦孔，偏离的无用荧光被挡去，极大的增加了对比度，可看到样品的细微结构。输出信息通常是一叠光学切片，通过定量调焦获得每一个图像。3.2 电子显微镜电子显微镜透射电子显微镜(transmissionelectronmicroscope,TEM)扫描电子显微镜(scanningelectronmicroscope,SEM)超高压电子显微镜(ultra-high-voltageelectronmicroscope,UHVEM)扫描式透射电子显微镜(scanningtransmissionelectronmicroscope,STEM)