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1、麻风病复发的微生物学和免疫学检测（诊断）中国医学科学院皮肤病研究所吴勤学2008.9写在前面麻风病命名与麻风杆菌麻风病复发定义及原因麻风复发的监测和检测展望与推荐写在前面说癞麻风病是由麻风杆菌引起的慢性传染病，是皮肤麻风病是由麻风杆菌引起的慢性传染病，是皮肤病的一种，亦称癞。由于本病严重者可致面部毁病的一种，亦称癞。由于本病严重者可致面部毁容和四肢畸残，给人以丑陋的外貌，人皆惧之。容和四肢畸残，给人以丑陋的外貌，人皆惧之。古时由于不能解其病因而讹传为道德败坏，祖上古时由于不能解其病因而讹传为道德败坏，祖上缺德，视为缺德，视为“ “天谴天谴” ”，人皆唾之。终遭致麻风患，人皆唾之。终遭致麻风患者
2、被歧视、迫害，甚至火烧、活埋乃至枪杀，其者被歧视、迫害，甚至火烧、活埋乃至枪杀，其惨无比，人皆恐之。惨无比，人皆恐之。即使不如此，由于怕传染，也要隔离，麻风村即使不如此，由于怕传染，也要隔离，麻风村（院）不是建在深山，就是孤岛，抑或江滨，基（院）不是建在深山，就是孤岛，抑或江滨，基本上与世隔绝，生活上苦不堪言，人皆畏之。本上与世隔绝，生活上苦不堪言，人皆畏之。 麻风病控制已经取得了令人瞩目的成绩，尤其麻风病控制已经取得了令人瞩目的成绩，尤其在采用标准联合化疗（在采用标准联合化疗（MDTMDT）方案后。但在看到成绩）方案后。但在看到成绩的同时必须正确地对待和科学地加以分析：的同时必须正确地对待和
3、科学地加以分析：pp就就全全球球而而言言，计计算算麻麻风风达达标标是是以以全全球球人人口口作作为为分分母母，而而实实际际上上麻麻风风病病在在许许多多发发达达国国家家已已几几乎乎不不存存在在。在在我我国国达达标标亦亦是是以以全全国国人人口口作作分分母母的的。所所以以是是人人为为的的统计学的指标，未能完全反映问题的实质；统计学的指标，未能完全反映问题的实质；pp某些国家某些国家20002000年底并没达到消灭的目标（我国有的年底并没达到消灭的目标（我国有的省、地区亦然），在省、地区亦然），在20052005年年( (即使即使2008)2008)这一目标仍这一目标仍然难以达到；然难以达到；历史的回顾
4、：成就现状未来写在前面pp所所谓谓的的消消灭灭，只只是是表表明明登登记记病病例例的的患患病病率率的的降降低低，它它不不等等于于实实际际患患病病率率的的降降低低。因因为为某某些些国国家家卫卫生生服服务务人人群群覆覆盖盖率率远远远远低低于于100%100%，导导致致某某些些地地区区大大量量病病人人未未被被发发现现，即即使使卫卫生生服服务务覆覆盖盖较较好好，亦亦仍仍存存在在发发现现不不足足和和延延迟迟发发现的情况；现的情况；pp即即使使在在登登记记患患病病率率低低于于1/1/万万的的某某些些国国家家，麻麻风风仍仍然然是是重重要要的的公公共共卫卫生生问问题题。因因为为不不论论从从国国家家水水平平、还还
5、是是从从省省、州州、县县级级水水平平上上看看，都都存存在在着着大大量量病病人人尚尚未未发发现现和和患患病病率率仍仍然然保保持持在在高高水水平平，发发病病地地区区不不平平衡衡，我我国国目目前前云云、贵贵、川川、藏藏就就是是这这样样情情况况。国国外外主主要要集集中中在在印印度度、巴巴西西、缅缅甸甸、印印度度尼尼西西亚亚、马马达达加加斯斯加和尼泊尔；加和尼泊尔；pp过过去去的的1515年年中中每每年年新新发发病病人人数数已已趋趋稳稳定定，19981998年年后后稳稳中中有有降降；但但某某些些国国家家和和地地区区新新发病人数仍呈上升之势。发病人数仍呈上升之势。 这这些些告告诉诉我我们们：实实际际患患病
6、病率率与与登登记记的的患患病病率率可可能能有有很很大大的的不不同同；虽虽然然登登记记患患者者数数已已明明显显下下降降，但但全全球球新新病病人人发发现现率率并并未未减减少少。此此外外，尚尚无无有有证证据据表表明明，一一旦旦患患病病率率降降到到预预先先规规定定的的水水平平，麻麻风风病病将将会会自然消灭。自然消灭。结论结论 很可能会有显著数量的新病人在今后很可能会有显著数量的新病人在今后很多年内继续出现，即使在那些已达到规很多年内继续出现，即使在那些已达到规定消除目标的国家和定消除目标的国家和/ /或地区麻风控制活动或地区麻风控制活动亦必须确保继续进行。亦必须确保继续进行。 麻风病麻风病的命名麻风病
7、病原体麻风杆菌麻风病的病名麻风病是一古老的慢性传染病，其病名多种多样Set Set （埃及）（埃及） Zaraath Zaraath （西伯来文圣经）（西伯来文圣经）Leprosy Leprosy （英、美）（英、美） Aussatz Aussatz （德国）（德国）Judham Judham （阿拉伯语）（阿拉伯语） Kushtha Kushtha （印度）（印度）癞病癞病 业病业病 例外例外 傍居傍居 （日本）（日本）疠疠 疠风疠风 厉厉 大风大风 癞疾癞疾 癞病癞病 癞癞 恶疾恶疾 天刑天刑 麻疯麻疯 癞风癞风 大麻疯大麻疯 麻风麻风 （我国（我国 ）现统称：leprosy（麻风） 或H
8、ansen disease（汉森病）麻风病病原体麻风杆菌（1）Mycobaterium leprae，ML，麻风菌 Hansen 1873年发现，1974年公开发表 放线菌目，分枝杆菌科，分枝杆菌属，唯 侵人、动物N 比Mtb发现早9年 体外尚不能人工培养，有动物模型麻风病病原体麻风杆菌（2）ML一般特征ZN染色（+）、G+ZN染色光镜下：长长1 18m 8m ，宽，宽0.3 0.3 0.4m 0.4m ，短，短小直棒状或略弯曲，无鞭毛、芽孢小直棒状或略弯曲，无鞭毛、芽孢1条菌重：3.91.0（SD）10-14克基因组：2.8Mb，能编码1600种蛋白，比Mtb低，有假基因麻风病病原体麻风杆菌
9、（3）染色特点：Z-N粉红色，抗酸性，吡啶可提取，过碘酸染色可恢复形态特点： 多形性杆 断裂 串珠 颗粒 簇集性形成球团（束） 菌球 形态与活力相关（图）麻风病病原体麻风杆菌（4）ML的生物学特征世代时间：长，平均世代时间：长，平均11-1311-13天天( (鼠足垫鼠足垫) Mtb 20h) Mtb 20h最适生长温度：最适生长温度：3030 36 36最小感染量：最小感染量：3 3 4040条活菌条活菌活力与致病性：活力与致病性：4 4保存组织匀浆保存组织匀浆7-107-10天活力不变；天活力不变； 致病力与种族、地理环境无关；致病力与种族、地理环境无关； 高平顶株与低平顶株比免疫原性强高
10、平顶株与低平顶株比免疫原性强麻风病病原体麻风杆菌（5）ML对物理因素的抵抗力平皿中平皿中 32.5 32.5 湿度湿度78% 78% 活活2828天天 32.0 32.0 湿度湿度32% 32% 活活1414天天土壤中（室温）土壤中（室温） 活活4343天天0.5N NaOH0.5N NaOH (20) (20) 活力不变活力不变10%10%二甲基亚砜二甲基亚砜(DMSO) (DMSO) (4 4) ) 保护剂作用保护剂作用紫外线照射紫外线照射(2M(22+ +新神经功能损伤新神经功能损伤皮肤或神经活检中出现复发证据皮肤或神经活检中出现复发证据眼出现（瘤型）麻风活跃眼出现（瘤型）麻风活跃后来亦
11、有把定义简化为： 皮肤切刮液涂片出现皮肤切刮液涂片出现MLML或一个新皮损涂片有含或一个新皮损涂片有含完整菌的高完整菌的高BIBI，有组织学上证据，新损害中，有组织学上证据，新损害中MLML可在鼠足垫生长可在鼠足垫生长复发的定义及其演变Boerrigter等：一个新皮损出现或原皮损增大，有临床和组织学证据Paudian等：（7个标准）皮损扩大，浸润，红斑，产生新皮损，神经痛和肿大，新的肌肉麻痹，BI阳性第6届WHO专家组会议同意上述标准(1988)，提出：MB复发临床上容易识别，但在完成治疗后产生的PB复发与逆向反应很难鉴别麻风复发复发的定义及其演变近来复发的定义DDS单疗复发定义 病人疾病在
12、痊愈后疾病再现MDT复发定义（WHO，1988） 病人在完成MDT规定疗程，在监测或监测时段后又发生新麻风症候和症状者谓MDT复发。麻风复发复发的定义及其演变复发原因耐药 DDS单疗即使很好完成，复发者达50%(MB)持久菌 即使MDT，亦有10%的MB存在持久菌。其它原因 麻风复发复发原因耐药耐药菌株的定义 在抗感染的化学治疗过程中，由于致病微生在抗感染的化学治疗过程中，由于致病微生物对药物产生耐受性，敏感性减弱以至丧失，造物对药物产生耐受性，敏感性减弱以至丧失，造成疗效降低或丧失，甚至病情恶化，这种现象谓成疗效降低或丧失，甚至病情恶化，这种现象谓之耐药性（或称抗药性）。这种具有耐药性的细之
13、耐药性（或称抗药性）。这种具有耐药性的细菌则称为耐药菌株。菌则称为耐药菌株。耐药菌株的实验室检查uuMIMI 接受有效抗麻风药物治疗的瘤型麻风病人接受有效抗麻风药物治疗的瘤型麻风病人6-96-9个月期间个月期间MIMI不下降到不下降到5%5%以下，或开始下降后又上以下，或开始下降后又上升者，疑为可能耐药。升者，疑为可能耐药。uuBIBI 经经3-53-5年有效年有效( (规律地规律地)DDS)DDS治疗的治疗的LLLL和和BLBL病人病人BIBI下降不明显或有上升趋势，或开始下降后又上下降不明显或有上升趋势，或开始下降后又上升者，疑为可能耐药。升者，疑为可能耐药。uu病理变化病理变化 若经一定
14、期间的若经一定期间的DDSDDS治疗病理上浸润未治疗病理上浸润未见好转，甚或出现组织样麻风瘤图像者，应考虑见好转，甚或出现组织样麻风瘤图像者，应考虑耐药的可能耐药的可能复发原因耐药复发原因耐药耐药菌株的实验室检查结合临床证实n n长期正规足量长期正规足量DDSDDS治疗，病情持续恶化者治疗，病情持续恶化者n n长期正规足量长期正规足量DDSDDS治疗，病情好转但以后停顿不前，有的治疗，病情好转但以后停顿不前，有的还出现恶化，但改用其它抗麻风药物治疗后临床改善，还出现恶化，但改用其它抗麻风药物治疗后临床改善，BIBI又重新下降者又重新下降者n n不规则小剂量治疗或开始用小剂量治疗后用小剂量维持，
15、不规则小剂量治疗或开始用小剂量治疗后用小剂量维持，临床无改善或恶化临床无改善或恶化n n已达临床标准，复发后用已达临床标准，复发后用DDSDDS再治无效再治无效n n有组织样麻风瘤损害（有组织样麻风瘤损害（histoid lepromahistoid leproma）对上述病例可进行对上述病例可进行“ “核实治疗核实治疗” ”：在严密管理与观察下，每：在严密管理与观察下，每日口服日口服100mg DDS100mg DDS或肌射二乙酰氨苯砜（或肌射二乙酰氨苯砜（DADDSDADDS），每周），每周注射注射300-400mg300-400mg，正规治疗，正规治疗6 6个月，个月，MIMI、BIBI
16、、病理均不见、病理均不见效，临床亦无进步或恶化者，可定为临床耐药。效，临床亦无进步或恶化者，可定为临床耐药。复发原因耐药耐药菌株的实验室证实 鼠足垫接种证实是较可靠办法，一般观察鼠足垫接种证实是较可靠办法，一般观察6-126-12个个月，连续给药月，连续给药 敏感敏感低度耐药低度耐药中度耐药中度耐药高度耐药高度耐药对照组对照组细菌生长细菌生长+ +细菌生长细菌生长+ +细菌生长细菌生长+ +细菌生长细菌生长+ +试试验验组组0.0001%0.0001%细菌不生长细菌不生长细菌生长细菌生长+ +细菌生长细菌生长+ +细菌生长细菌生长+ +0.001%0.001%细菌不生长细菌不生长细菌不生长细菌
17、不生长细菌生长细菌生长+ +细菌生长细菌生长+ +0.01%0.01%细菌不生长细菌不生长细菌不生长细菌不生长细菌不生长细菌不生长细菌生长细菌生长+ +复发原因耐药耐药的原因 小剂量和不规则治疗小剂量和不规则治疗 病人吸收药物不佳病人吸收药物不佳 交叉耐药交叉耐药( (与长效磺胺与长效磺胺) )耐药的危害 治疗困难；耐药菌株流行治疗困难；耐药菌株流行耐药药物 DDS DDS治疗治疗6 6年后年后 DPT DPT治疗后治疗后2-32-3年年 D D6363、RFRF都发现了耐药菌株都发现了耐药菌株复发原因耐药耐药的防止方法 规则足量治疗 联合化疗复发原因持久菌持久菌 即使MDT，亦有10%的MB
18、存在持久菌 持久菌存在的地方： 皮肤神经（Dharmendra,1973） 平滑肌（Harman,1965） 淋巴结（Kauretal,1975） 虹膜（Hashizuma et al,1965） 骨髓和肝脏（Karal et al,1972）治疗不足治疗依从性差仅DDS单疗治MBPB单用RF治疗PB有多个皮损和N受累免疫力下降再感染麻风复发复发原因其它原因麻风复发耐药菌与持久菌的区别耐药菌与持久菌的区别复发原因耐药菌耐药菌持久菌（残留活菌）持久菌（残留活菌）是一种选择过程，即有效药物杀是一种选择过程，即有效药物杀灭了敏感菌株，事先存在不敏感灭了敏感菌株，事先存在不敏感株被留下来，取代了药敏株
19、株被留下来，取代了药敏株是一种适应过程，即在不利环境是一种适应过程，即在不利环境下，细胞代谢减缓到最低程度，下，细胞代谢减缓到最低程度，使对药物不敏感的一种休眠状态使对药物不敏感的一种休眠状态细胞一般发生了改变（基因突变）细胞一般发生了改变（基因突变），耐药性因之遗传，耐药性因之遗传细胞本身未有改变，仅代谢上改细胞本身未有改变，仅代谢上改变。能恢复正常菌的习性，不遗变。能恢复正常菌的习性，不遗传。传。治疗失败常见于不适当的抗菌治治疗失败常见于不适当的抗菌治疗，耐药后同样药治疗无论持续疗，耐药后同样药治疗无论持续多久通常无效多久通常无效治疗失败，在停止治疗后重复用治疗失败，在停止治疗后重复用同药
20、恢复治疗几乎总是奏效同药恢复治疗几乎总是奏效1995年WHO报告DDS DDS 1940s1940s发现，单疗发现，单疗1010年后复发率年后复发率30%30%，3030年累积年累积复发危险达复发危险达40%40%，3%/3%/人人年年MDT MDT 1010年后，观察年后，观察20 000 MB20 000 MB（复发率（复发率0.77%),0.77%), 50 000 PB 50 000 PB（复发率（复发率1.07%1.07%） 危险率比危险率比DDSDDS单疗低单疗低1010倍倍麻风复发复发的危险性复发潜伏期DDS单疗 55%57% PB 3年 BB 5年内 MB 6年内MDT 55%
21、57% PB 3年 MB 平均9年麻风复发亦有报告1.1.复发复发50%50%产生在产生在MDTMDT停后头三年停后头三年,75%,75%在在6 6年内。年内。 PB50%PB50%产生在产生在MDTMDT后后2 2年半内，年半内，75%75%在在5 5年内。年内。且复发危险不是与时俱进的，即若一个病人在且复发危险不是与时俱进的，即若一个病人在5-65-6年内不复发，以后复发可能性很小。年内不复发，以后复发可能性很小。2.2.MDTMDT后复发危险性低，且大多产生在后复发危险性低，且大多产生在5-65-6年内，年内，故监测意义不大，可以宣布病人故监测意义不大，可以宣布病人“ “治愈治愈” ”了
22、。了。3.3.MDTMDT预防复发效果比预防复发效果比DDSDDS高高90%90%，可以说，可以说，1010年年可以减少复发达可以减少复发达1/21/2百万。百万。（以上是（以上是WHO1995WHO1995年结论）年结论）麻风复发复发潜伏期联合化疗复发的诊断标准少菌型麻风 在完成在完成WHOWHO少菌型联合化疗方案治疗少菌型联合化疗方案治疗6 6个个月后，在监测期或其后原损害再活动或加剧，月后，在监测期或其后原损害再活动或加剧，或又发生新的麻风症状和体征。或又发生新的麻风症状和体征。n n已达临床治疗标准后又发生新的活动性皮损，或虽未达临已达临床治疗标准后又发生新的活动性皮损，或虽未达临床治
23、愈标准，但损害加剧或其病情趋向静止后原有皮损再床治愈标准，但损害加剧或其病情趋向静止后原有皮损再活动，如浸润加剧和皮损扩大活动，如浸润加剧和皮损扩大n n皮肤涂片查菌持续阴转后，在监测期或其后又重现抗酸杆皮肤涂片查菌持续阴转后，在监测期或其后又重现抗酸杆菌，且任何部位细菌密度菌，且任何部位细菌密度2+2+者；或在监测期或其后皮肤者；或在监测期或其后皮肤查菌虽未阴转，但连贯次皮肤涂片检查，任何部位细菌密查菌虽未阴转，但连贯次皮肤涂片检查，任何部位细菌密度较前增加度较前增加2+2+或或2+2+以上，或有完整染色菌者以上，或有完整染色菌者n n皮肤活检的组织病理学检查抗酸染色阴转和肉芽肿完全消皮肤活
24、检的组织病理学检查抗酸染色阴转和肉芽肿完全消退后，又重现活动性麻风特异性病理改变退后，又重现活动性麻风特异性病理改变 ，抗酸染色细，抗酸染色细菌密度在菌密度在2+2+或或2+2+以上，且有完整染色菌者以上，且有完整染色菌者n n鼠足垫接种证实有活菌者鼠足垫接种证实有活菌者多菌型麻风 在完成在完成WHOWHO多菌型联合化疗方案治疗多菌型联合化疗方案治疗2 2年后，又出现下列年后，又出现下列情况之一者情况之一者联合化疗复发的诊断标准麻风复发的监测与检测监视新合成蛋白的免疫反应 氨基酸序列不同氨基酸序列不同监视血清抗体水平 现有方法：现有方法：PGL1-ELISAPGL1-ELISA或或35KD-E
25、LISA35KD-ELISA 我们用我们用ND-ELISAND-ELISA监视白细胞介素水平 麻风患者的细胞因子模式麻风患者的细胞因子模式麻风复发的免疫学诊断方面ML计数法评估菌的荷量：BIML活力的测定：活菌引起复发，死菌抗原成分引起免疫活菌引起复发，死菌抗原成分引起免疫体内法体内法： 鼠足垫接种（正常鼠、免疫抑制鼠）鼠足垫接种（正常鼠、免疫抑制鼠）体外法体外法：1 1）细菌指数（）细菌指数（MIMI） 2 2）荧光二乙酸溴乙锭染色法（）荧光二乙酸溴乙锭染色法（FDAFDA） 3 3）激光微探针质量分析（）激光微探针质量分析（LAMMALAMMA） 4 4） ATP ATP测定测定 5 5）
26、 M M试验试验 6 6）其它体外试验）其它体外试验麻风复发的监测与检测麻风复发的微生物学诊断()传统法DNA靶探针 敏感度为敏感度为10104 410105 5RNA靶探针 比比DNADNA稳定性差稳定性差PCR 敏感性达敏感性达1-101-10条菌，在条菌，在PBPB，606075%75%阳性阳性 但死菌也可阳性但死菌也可阳性RT-PCR 80%PB80%PB复发和复发和25%RR25%RR试验阳性试验阳性麻风复发的监测与检测麻风复发的微生物学诊断()分子生物学法小 结问题的提出治愈后复发的疑问（三个“R”）是菌没有真正杀死，抑或是什么药物浓度达不到的地方，停药后再燃(reactiviti
27、on)?是菌已被杀死，疾病痊愈，但死菌中的抗原惹起迟发超敏反应，抑或逆向反应(reversal reaction)?是病人又获同一菌株，抑或不同菌株的再感染(re-infection)?炎症和迟发超敏反应（DHR）炎症（inflammation） 表现为疾病活动性，系疾病的天然（自然）过程。表现为疾病活动性，系疾病的天然（自然）过程。在此过程免疫（宿主与寄生物相互关系）未发生变在此过程免疫（宿主与寄生物相互关系）未发生变动。动。变态反应（DHR） 表现为逆向反应，系疾病一种恶化，过程加速，病表现为逆向反应，系疾病一种恶化，过程加速，病情加重。免疫在反应时发生变化或病情迅速恶化或情加重。免疫在反
28、应时发生变化或病情迅速恶化或发生病型的改变。发生病型的改变。再燃（复发）与反应 已愈疾病（治愈、静止状态）尔后再燃，病理学表现为正常的活动性炎症过程。虽然反应与复发发病机制完全不同，但在BT、TT很难区别。解决问题的草案联用BI(MI)、ND-ELISA、PCR麻风（含复发）的监测、预测： ND-ELISABI(MI) PCRND-ELISABI(MI) PCR+ +RT-PCRRT-PCR+ +麻风确诊：临床症状出现临床症状出现 BI(MI) PCR BI(MI) PCR+ +按规定方案治疗按规定方案治疗麻风鉴别： 反应？反应？BI(MI)BI(MI)- - PCR PCR- - 反应反应(
29、RR) (RR) 按反应治疗按反应治疗 反应？反应？BI(MI)BI(MI)+ + PCR PCR+ + 反应反应(RR)+(RR)+复发复发 按反应及复发同时治疗按反应及复发同时治疗 治愈后临床症状出现治愈后临床症状出现 BI(MI) BI(MI)+ + PCR PCR+ + 已诊断为麻风复发已诊断为麻风复发PCRPCR耐药耐药+ + 耐药耐药MLML致复发致复发 已诊断为麻风复发已诊断为麻风复发PCRPCR不耐药不耐药 持久菌致复发持久菌致复发 不明病例不明病例BI(MI)BI(MI)+ +PCRPCR+ +RT-PCRRT-PCR+ +药敏试验药敏试验(+)(-)(+)(-)同基因型(复
30、发)不同基因(再感染)*敏感:按规定方案治疗不敏感:个体化方案治疗展望与推荐正确理解麻风基本控制和消灭基本控制 在现阶段将患病率、发病率控制在较低的水平消灭 微生物完全消灭，传播完全中止微生物完全消灭，传播完全中止 达标后达标后,ML,ML依然存在依然存在, ,新病人仍出现新病人仍出现, ,传播未中止传播未中止, ,据据现有技术不能预见麻风消灭现有技术不能预见麻风消灭. . (32 (32个国家个国家,20052005年不能达标年不能达标,2008,2008？）？）展望与推荐加强研究，特别是与控制和消灭有关的研究加强研究，特别是与控制和消灭有关的研究 保留必要的麻风防治机构，加强宣传，培训人才
31、保留必要的麻风防治机构，加强宣传，培训人才 早期麻风诊断方法早期麻风诊断方法 麻风反应的预防、治疗，麻风反应的预防、治疗，N N损伤机理损伤机理 亚临床感染亚临床感染 复发预测、流行学，与反应、再感染的鉴别复发预测、流行学，与反应、再感染的鉴别 耐药的监测（特别是利福平的耐药）耐药的监测（特别是利福平的耐药） MB MB与与PBPB的共同疗法的共同疗法 有效疫苗有效疫苗 化学疫苗的应用化学疫苗的应用 病例的定义（服药后者、畸残者算不算病人？）病例的定义（服药后者、畸残者算不算病人？） 人以外人以外MLML库、疫源学、基因分型库、疫源学、基因分型 走向没有麻风世界的战略走向没有麻风世界的战略 结 束 语攻城不怕艰，读书不畏难。科学有险阻，苦战能过关。叶剑英三十六字格言聪明在于学习天才源于积累创造始于思索真知出于实践成功在于坚持丰收寓于实干吴勤学吴勤学
