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1、常用生物化学检验技术常用生物化学检验技术第五章第五章1第一节第一节 光谱分析技术光谱分析技术第二节第二节 电化学分析电化学分析第三节第三节 电泳技术电泳技术第四节第四节 层析技术层析技术第五节第五节 离心技术离心技术第六节第六节 自动生化分析技术自动生化分析技术 只讲第一节，其它内容在临床检验只讲第一节，其它内容在临床检验仪器学中讲授。仪器学中讲授。n本章内容概要本章内容概要2n教学目标和要求教学目标和要求1 1、掌握掌握分光光度技术的基本原理及定性和定量方法。分光光度技术的基本原理及定性和定量方法。2 2、熟悉熟悉分光光度计的的基本结构和操作方法光源检查分光光度计的的基本结构和操作方法光源检
2、查和波长校正、原子分光光度计的类型和影响荧光分析的和波长校正、原子分光光度计的类型和影响荧光分析的因素因素3 3、了解了解其他光谱分析技术的基本原理及在生化检验中其他光谱分析技术的基本原理及在生化检验中的应用。的应用。3第一节第一节 光谱分析技术光谱分析技术n分光光度技术的基本原理分光光度技术的基本原理n分光光度计的基本结构分光光度计的基本结构n分光光度计的操作方法分光光度计的操作方法 n分光光度技术的定性和定量方法分光光度技术的定性和定量方法 4n光谱分析技术原理：光谱分析技术原理： 利用各种化学物质都具有发射、吸收或散射光谱谱系的特利用各种化学物质都具有发射、吸收或散射光谱谱系的特征，以此
3、来确定物质性质、结构或含量。征，以此来确定物质性质、结构或含量。n光谱分析技术分类：光谱分析技术分类：发射光谱分析技术：发射光谱分析技术：火焰光度法、原子发射光谱法和荧光光谱法火焰光度法、原子发射光谱法和荧光光谱法 吸收光谱分析技术：吸收光谱分析技术：紫外、可见光分光光度法，原子吸收分光光紫外、可见光分光光度法，原子吸收分光光 度法和红外光谱法度法和红外光谱法 散射光谱分析技术：散射光谱分析技术：比浊法比浊法 5一、分光光度技术的基本原理一、分光光度技术的基本原理（一）吸光度与透光度（一）吸光度与透光度 A = -lgT = -lgI/IA = -lgT = -lgI/I0 0 = lgI=
4、lgI0 0/I/I 当光线通过均匀、透明的溶液时可出现三种情况：一部分当光线通过均匀、透明的溶液时可出现三种情况：一部分光被散射，一部份光被吸收，另有一部分光透过溶液。设入射光被散射，一部份光被吸收，另有一部分光透过溶液。设入射光强度为光强度为I0I0，透射光强度为，透射光强度为I I，I I和和I I0 0之比称为透光度之比称为透光度，即：即：T = I/IT = I/I0 0 T100 T100为为T%T%称为百分透光度。透光度的负对数称为吸光度称为百分透光度。透光度的负对数称为吸光度即：即：6（二）（二）Lambert-BeerLambert-Beer定律定律 Lambert-Beer
5、 Lambert-Beer定律是讨论溶液吸光度同溶液浓度和溶液层定律是讨论溶液吸光度同溶液浓度和溶液层厚度之间关系的基本定律，该定律是分光分析的理论基础。其厚度之间关系的基本定律，该定律是分光分析的理论基础。其表达式为：表达式为： A = KLC 式中式中A A为吸光度；为吸光度；K K为比例常数，称为吸光系数；为比例常数，称为吸光系数；L L为溶液为溶液层厚度，称为光径；层厚度，称为光径；C C为溶液浓度为溶液浓度 （Lambert-BeerLambert-Beer定律适用于可见光、紫外光、红外光和均匀非散射的液体。）定律适用于可见光、紫外光、红外光和均匀非散射的液体。）7 据据Lamber
6、t-BeerLambert-Beer定律，当液层厚度为定律，当液层厚度为cmcm，浓度单位为，浓度单位为mol/Lmol/L时，吸光系数时，吸光系数K K称为摩尔称为摩尔吸光系数吸光系数()()。的意义是：当液层厚度为的意义是：当液层厚度为1cm1cm，物质浓度为，物质浓度为1mol/L1mol/L时在特定波长下的时在特定波长下的吸光度值。吸光度值。是物质的特征性常数。是物质的特征性常数。 8（三）偏离（三）偏离Lambert-BeerLambert-Beer定律的因素定律的因素 应用应用Lambert-BeerLambert-Beer定律产生误差主要来源于光学定律产生误差主要来源于光学和化学
7、两方面的因素。和化学两方面的因素。1 1光学因素：光学因素： 要求入射光是单色光。入射光的谱带越宽，其误差越大。要求入射光是单色光。入射光的谱带越宽，其误差越大。 2 2化学因素：化学因素： 浓度、浓度、pHpH、溶剂和温度等因素可影响化学平衡。、溶剂和温度等因素可影响化学平衡。 9二、分光光度计的基本结构二、分光光度计的基本结构最常用的是最常用的是可见分光光度计可见分光光度计和和紫外紫外- -可见光分光光度计可见光分光光度计 光源光源单色器单色器比色杯比色杯检测器检测器显示器显示器五大部份五大部份n结构：结构：10（一）光源（一）光源u光源定义：光源定义： 指一种可以发射出供溶液或吸收物质选
8、择性吸收的光。光指一种可以发射出供溶液或吸收物质选择性吸收的光。光源应在一定光谱区域内发射出连续光谱，并有足够的强度和良源应在一定光谱区域内发射出连续光谱，并有足够的强度和良好的稳定性，在整个光谱区域内光的强度不应随波长有明显的好的稳定性，在整个光谱区域内光的强度不应随波长有明显的变化。变化。 u光源种类：光源种类： 可见光分光光度计常用光源是可见光分光光度计常用光源是钨灯或卤钨灯。钨灯或卤钨灯。 紫外光光度计常用紫外光光度计常用氢灯氢灯作为光源。作为光源。 11（二）单色器（二）单色器u定义：定义： 将来自光源的复合光分散为单色光的装置称为分将来自光源的复合光分散为单色光的装置称为分光系统或
9、单色器。光系统或单色器。 u种类：种类： 滤光片滤光片棱镜棱镜光栅光栅12（三）比色杯（三）比色杯又称为吸收池或比色皿又称为吸收池或比色皿 u材料：材料：常用无色透明、耐腐蚀和耐酸碱的玻璃或石英材料做成常用无色透明、耐腐蚀和耐酸碱的玻璃或石英材料做成 （五）显示器（五）显示器（四）检测器（四）检测器 检测器是将透过溶液的光信号转换为电信号，并将电信号检测器是将透过溶液的光信号转换为电信号，并将电信号放大的装置。常用的检测器为光电管和光电倍增管。放大的装置。常用的检测器为光电管和光电倍增管。 是将光电管或光电倍增管放大的电流通过仪表显示出来的是将光电管或光电倍增管放大的电流通过仪表显示出来的装置
10、。装置。 13三、分光光度计的操作方法三、分光光度计的操作方法（一）分光光度计的基本操作（一）分光光度计的基本操作以以721-A721-A型分光光度计为例，其基本的操作步骤为：型分光光度计为例，其基本的操作步骤为：1.1.开开721-A721-A分光光度计的开关，将比色池的盖子打开，通电分光光度计的开关，将比色池的盖子打开，通电2020分钟使仪器预热。分钟使仪器预热。2.2.将波长旋至测定的波长。将波长旋至测定的波长。3.3.将空白液、校准液或待测液放入比色池，将空白液置于光路中。将空白液、校准液或待测液放入比色池，将空白液置于光路中。4.4.将开关置于将开关置于T T位，打开比色池盖子，用光
11、量粗调和光量细调调节位，打开比色池盖子，用光量粗调和光量细调调节T T为为0.0,0.0,关上关上比色池盖子，调节比色池盖子，调节T T为为100.0100.0。5.5.将开关置于将开关置于A A，用消光调零调节，用消光调零调节A A为为0.00.06.6.重复步骤重复步骤4 4和和5 57.7.将校准液或待测液推入光路，测量溶液的吸光度（将校准液或待测液推入光路，测量溶液的吸光度（A A）14（二）吸光度的校正（二）吸光度的校正 铬酸钾的标准液可用于校正分光光度计的吸铬酸钾的标准液可用于校正分光光度计的吸光度。在光度。在25，将，将4mg铬酸钾溶于铬酸钾溶于100ml的的0.05mol/L
12、KOH中，放入比色池中，在不同波长中，放入比色池中，在不同波长下测定吸光度值，与己知的标准吸光度校正表进下测定吸光度值，与己知的标准吸光度校正表进行比较，可检测仪器吸光度的准确度行比较，可检测仪器吸光度的准确度。 15四、分光光度技术的定性和定量方法四、分光光度技术的定性和定量方法（一）分光光度技术的定性方法（一）分光光度技术的定性方法u定性依据：定性依据：最大吸收波长最大吸收波长maxmax和摩尔吸光系数和摩尔吸光系数 2.2.摩尔消光系数摩尔消光系数方法方法1.1.最大吸收波长最大吸收波长maxmax方法方法16（二）分光光度技术的定量方法（二）分光光度技术的定量方法1.1.标准曲线法标准
13、曲线法 根据根据Lambert-BeerLambert-Beer定律，液体的浓度在一定范定律，液体的浓度在一定范围内与吸光度成正比关系。配制一系列浓度的标准围内与吸光度成正比关系。配制一系列浓度的标准品溶液（浓度应包含高、中、低浓度范围），按标品溶液（浓度应包含高、中、低浓度范围），按标本处理方法作相同处理，在特定波长下测定吸光度，本处理方法作相同处理，在特定波长下测定吸光度，以标准液浓度为横座标，以吸光度为纵座标以标准液浓度为横座标，以吸光度为纵座标，按最，按最小二乘法的原理，将对应各点连成一条通过原点的小二乘法的原理，将对应各点连成一条通过原点的直线，这条直线称为标准曲线。待测溶液测定吸光
14、直线，这条直线称为标准曲线。待测溶液测定吸光度后，从标准曲线上可查出其相应的浓度。度后，从标准曲线上可查出其相应的浓度。u方法：方法：17u制作和应用标准曲线时应注意下面几点：制作和应用标准曲线时应注意下面几点：（1 1）测定条件发生变化时（如更换标准品和试剂等），应重新）测定条件发生变化时（如更换标准品和试剂等），应重新绘制。绘制。（2 2）标准品应有高的纯度，标准液的配制应准确。）标准品应有高的纯度，标准液的配制应准确。（3 3）当待测液吸光度超过线性范围时，应将标本稀释后再测定。）当待测液吸光度超过线性范围时，应将标本稀释后再测定。（4 4）标本测定的条件应和标准曲线制作时的条件完全一致
15、。）标本测定的条件应和标准曲线制作时的条件完全一致。182 2比较法比较法 C Cu u=(A=(Au uCCs s)/A)/As s 己知浓度的标准品和标本作同样处理，使用相同的空白，己知浓度的标准品和标本作同样处理，使用相同的空白，同时测定标准管和标本的吸光度，根据测定的吸光度及标准同时测定标准管和标本的吸光度，根据测定的吸光度及标准品浓度，可直接计算出标本的浓度，计算公式为：品浓度，可直接计算出标本的浓度，计算公式为： 其中其中CuCu和和AuAu为标本管浓度和吸光度，为标本管浓度和吸光度，CsCs和和AsAs分别为标准分别为标准管浓度和吸光度。用标准品法定量时，标准品的浓度应尽量管浓度
16、和吸光度。用标准品法定量时，标准品的浓度应尽量和标本管浓度相近。和标本管浓度相近。 193 3其它分析方法其它分析方法 包括差示法、多组份混合物分析和利用包括差示法、多组份混合物分析和利用摩尔吸光系数分析等方法。摩尔吸光系数分析等方法。20五、其它光谱分析技术五、其它光谱分析技术（一）火焰光度法（一）火焰光度法（二）原子吸收分光光度法（二）原子吸收分光光度法 （三）荧光光度分析法（三）荧光光度分析法1 1基本原理基本原理 2 2组成组成1 1基本原理基本原理 2 2组成组成 3 3原子吸收分光光度法的特点原子吸收分光光度法的特点 3 3荧光光度定量分析法荧光光度定量分析法 4 4 荧光光度分析技术的应用荧光光度分析技术的应用 1 1基本原理基本原理 2 2影响荧光强度的因素影响荧光强度的因素21
