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1、药品微生物检验特点药品微生物检验特点及过程控制及过程控制中国药品生物制品检定所中国药品生物制品检定所马仕洪马仕洪2010年年5月月26日日 上海上海web site: e-mail: tel:010-67095509 地址：北京市天坛西里地址：北京市天坛西里2 2号号 邮编：邮编：100050100050 1药品微生物检验特点及过程控制药品微生物检验特点及过程控制l药品因素l环境影响l培养观察l抽样检查l破坏试验方法验证过程控制2 2无菌无菌/ /微生物限度检查理念微生物限度检查理念环境保证环境保证培养基保证培养基保证无菌性检查无菌性检查灵敏度检查灵敏度检查有效的方法有效的方法方法验证方法验证
2、SOP操作操作有效的结果有效的结果可靠的结论可靠的结论结果判断结果判断3 3微生物检查的过程控制微生物检查的过程控制l一、实验设施（硬件物质保障）l二、检验程序（软件有效的结果）l三、结果判断（调查可靠的结论）4 4一、实验设施l实验室系统l操作环境l关键设备l对照培养基物 质 保 障5 5（一）、实验室系统（一）、实验室系统洁净实验条件洁净实验条件l有效性：有效性：整体10000级、局部100级。l安全性：安全性：保护样品、人员和环境。l可操作性：可操作性：方便、快捷、顺畅。洁净实验条件的维护、验证洁净实验条件的维护、验证阳性菌实验室达到阳性菌实验室达到P2P2生物安全标准生物安全标准6 6
3、实验室改造示例：原布局图 拟定布局图 建议布局图1 建议布局图2实验室系统中检所微生物实验室7 7（一）、实验室系统实验室系统的管理与维护：1、屏障系统的有效性 压差、风速、微粒、照度 （外包服务合同）2、清洁、静态与动态监控、熏蒸3、环境菌库 酒精棉球分离微生物 新洁尔灭分离微生物8 8环境菌库洁净环境常见菌（浮游菌）：l头状葡萄球菌（Staphylococcuscapitis）l溶血葡萄球菌（Staphylococcushaemolyticus）l缓症链球菌（Streptococcusmitis）l科氏葡萄球菌（Staphylococcuscohnii）l藤黄微球菌（Micrococcus
4、luteus）9 9（二）、操作环境l1、隔离器l2、生物安全柜l3、超净工作台1010（二）、操作环境分类样品安全人员安全环境要求点评隔离器？验证困难，灭菌不彻底：假阳性 灭菌剂残留：假阴性生物安全柜？动态验证困难，不适合多任务的检验活动超净工作台经典、廉价、适合多任务的检验活动。提高实验室新风供给、加强实验室监控可以扬长避短1111搽拭实验菌株菌液计数回收计数回收率大肠埃希菌191894.7%金黄色葡萄球菌646093.8%菌液稀释、分液的误差为：5.5%表面搽拭操作的回收率大于 99%1212（三）、关键设备 微生物检查薄膜过滤仪微生物检查薄膜过滤仪 一次性薄膜过滤培养器一次性薄膜过滤培
5、养器应急检验用一次性薄膜过滤培养器应急检验用一次性薄膜过滤培养器1313（四）、对照培养基 培养基适用性（灵敏度）； 培养基性能稳定性（标准化）。对照培养基理化评价（可控性）生物学评价（有效性）回收率比较MPN比较生长曲线比较生态评价某些CRS原则固态培养基液态培养基琼脂加减法1414二、检验程序环境保证环境保证培养基保证培养基保证无菌性检查无菌性检查灵敏度检查灵敏度检查有效的方法有效的方法方法验证方法验证SOP操作操作有效的结果有效的结果可靠的结论可靠的结论结果判断结果判断1515二、检验程序l接受任务l实验方案l实验准备l样品核对l实验操作l过程监控l培养观察有效的结果物 质 保 障161
6、6实验室管理规范（软件）实验室管理规范（软件）中检所抗生素室微生物实验室质量管理体系中检所抗生素室微生物实验室质量管理体系l编写说明及批准页l1 实验室概况l1.1 实验室简介 l1.2 实验室通讯资料 l1.3 实验室认可项目/参数表l1.4 实验室平面图及功能区域 l1.5 仪器设备总览l1.6 常备试剂耗材一览表l1.7 实验室发展目标l2 管理规范l2.1 安全管理l2.2 业务流程l2.3 人员管理（6个SOP）l2.4 样品管理（3个SOP）l3 标准操作规程l3.1 检验工作SOP（13个）l3.2 仪器操作SOP（30个）l3.3 实验记录SOP（9个）l4 实验室保障l4.1
7、 实验室设施、设备及消耗品供应商确定原则l4.2 实验室设施服务商l4.3 实验设备供应商l4.4 实验室消耗品供应商1717（一）、实验准备l实验准备应坚持“平战结合”，物质准备有备无患，应随时保证“来之能战” 。l尤其注意常备有效期要求的物品：培养基、冲洗液、滤器、小型实验器材等。1818实验准备无菌室专用酒精棉球制备实验准备场地清洁实验准备台面清洁1919（二）、样品核对l尽快取得样品，确保样品传递过程中的完整性、安全性、有效性；l仔细核对样品及样品资料，高度关注媒体公布样品（问题样品），同时尽量获取非问题样品及同类样品，进行比较实验、比较分析；l样品外观检查、完整性检查。2020样品外
8、观检查欣弗样品外观检查刺五加样品外观检查双黄连样品完整性真空检漏2121（三）、实验操作l不断完善标准化操作规程（SOP），严格避免实验室污染。实验人员实验人员 培养基培养基实验器材实验器材实验环境实验环境检验结果检验结果待检样品待检样品原料原料 辅料辅料 设备设备环境环境药品（食品）药品（食品）人员人员 药品食品生产过程中可能污染微生物的主要环节药品食品微生物检查过程中可能污染微生物的主要环节2222实验操作物料进场消毒液搽拭物品外表面洁净传递（风淋、紫外照射）双层无菌包装核心区外围实验操作人员进场一更二更核心操作区实验操作无菌操作技术2323（四）、实验过程监控样品监控手指监控沉降菌监控无
9、菌检验框架示意图无菌检验框架示意图2424三、结果判断l长菌与否l分离鉴定l溯源调查l结果报告可靠的结论有效的结果物 质 保 障2525三、结果判断 是不是微生物？ 是什么微生物？ 微生物来自哪里？ 几点思考 参见：FTIR法用于药品检出菌与药品微生物检验洁净室环境菌的相似性考 察药学学报，2007，42（11）：11891194 判断无菌检查阳性结果有效性的实验探讨药物分析杂志， 2008， 28（05）：6671 26261、长菌与否？l浑不浑浊?l物理变化、化学变化还是生物变化？一靠经验二靠实验三靠严格程序控制避免干扰2727是不是微生物？（1）、液体培养基浑浊 物理变化？化学变化？生物
10、学变化？（2）、平板上的菌落 琼脂表面、琼脂中、琼脂和平皿夹层 菌落or药渣？2828菌落or药渣？l经经6060CoCo射线大剂量照射再检验射线大剂量照射再检验l延长培养时间到延长培养时间到7 7天天l重新划线培养重新划线培养l镜检镜检29292、分离鉴定l（1）立即转接2ml该培养物至相同的培养基中继续培养；l（2）取5支冻存管，每管分装1ml浑浊培养物，-80保存；l（3）取浑浊培养物在TSA平板/血琼脂上划线，分离污染微生物；l（4）如果发现硫乙醇酸盐流体培养管变浑浊，还应增加血平板划线，并在厌氧条件下培养分离厌氧菌。由平板分离到的菌落应进一步鉴定，并逐一保藏。3030是什么微生物？宏
11、观：生长形态微观：镜检鉴定：生化鉴定（API、BD） 核酸鉴定（16sRNA、DNA） 31313、溯源调查l样品阳性培养物分离菌株l检验过程监控菌株l环境菌（近期、远期）l现场调查收集菌株鉴定与相似性分析相结合传统方法与新技术相结合不同方法的交叉验证3232微生物来自哪里？ 相似性分析 同源性分析 脉冲场电泳（PFGE）、傅立叶红外（FTIR） 3333Sample Preparation Automated measurement after drying of the samples!2. Suspending1. Harvesting3. LoadingFT-IR Spektrum o
12、f microorganisms图图 不同来源的阴沟肠杆菌红外图谱聚类关系不同来源的阴沟肠杆菌红外图谱聚类关系3434The Infrared Spectrumlipidsproteinscarbohydratessaltswatercell wallcapsulesDNA, RNAflagellates, piliribosomevacuoles .FT-IR spectrum is a fingerprint of the cellsBiochemical Structure of Cells35353636溯源性分析例溯源性分析例11欣弗事件欣弗事件 图图29 欣弗培养物欣弗培养物图30
13、 欣弗培养物分离菌株镜检3737编号滤筒中形态革兰染色BD鉴定0206L浑浊，产气1、G-球杆菌2、G-短杆菌1、肺炎克雷伯肺炎亚种（Klebsiella pneumoniae ssp pneumoniae）；2、粘质沙雷菌（Serratia marcescens）0206G浑浊，剧烈产气1、G-球杆菌2、G-短杆菌1、肺炎克雷伯肺炎亚种（Klebsiella pneumoniae ssp pneumoniae）；2、粘质沙雷菌（Serratia marcescens）0112G致密片状、絮状物，振摇不散G+长链杆菌（液体培养物直接涂片）0104L颗粒状悬浮物，振摇能散G+长链杆菌（液体培养物
14、直接涂片）298L；298G浑浊，产气1、G-球杆菌2、G-短杆菌1、肺炎克雷伯肺炎亚种（Klebsiella pneumoniae ssp pneumoniae）；2、粘质沙雷菌（Serratia marcescens）303L；303G浑浊，产气1、G-球杆菌2、G-短杆菌1、肺炎克雷伯肺炎亚种（Klebsiella pneumoniae ssp pneumoniae）；2、阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）305L；305G浑浊，产气1、G-球杆菌2、G-短杆菌1、肺炎克雷伯肺炎亚种（Klebsiella pneumoniae ssp pneumoniae）；2、粘质
15、沙雷菌（Serratia marcescens）306L；306G浑浊，产气G-球杆菌肺炎克雷伯肺炎亚种（Klebsiella pneumoniae ssp pneumoniae）307G浑浊，产气G-球杆菌肺炎克雷伯肺炎亚种（Klebsiella pneumoniae ssp pneumoniae）308L浑浊（Alcaligenes faecalis）308G致密片状、絮状物，振摇不散G+长链杆菌（液体培养物直接涂片）309L浑浊（Alcaligenes faecalis）309G致密片状、絮状物，振摇不散G+长链杆菌（液体培养物直接涂片）304G浑浊G-杆菌嗜麦芽寡养单胞菌（Stenot
16、rophomonas maltophilia）3838溯源性分析例溯源性分析例11欣弗事件欣弗事件 头状葡萄球菌头状亚种头状葡萄球菌头状亚种（Staphylococcuscapitissspcapitis）溶血葡萄球菌溶血葡萄球菌（Staphylococcushaemolyticus）缓症链球菌缓症链球菌（Streptococcusmitis）科氏葡萄球菌科氏亚种科氏葡萄球菌科氏亚种（Staphylococcuscohniisspcohnii）藤黄微球菌藤黄微球菌（Micrococcusluteus）溶血葡萄球菌溶血葡萄球菌（Staphylococcushaemolyticus）。监测到的环境
17、菌株监测到的环境菌株3939溯源性分析例溯源性分析例2 2编号BD鉴定鉴定走廊1B.pumilus 走廊2M.luteus 走廊3/无菌室4C.urealyticum 无菌室5K.kristinae 无菌室6C.urealyticumC1524-FS.caprae C1524-BS.caprae C1525-B1-1S.warneri C1525-B1-2S.epidermidisC1525-B2S.warneriC1525-F1S.warneriC1525-F2-1S.capitisC1525-F2-2S.epidermidisC1526-B1C.urealyticumC1526-B2S.w
18、arneriC1526-F1S.epidermidis C1526-F2S.haemolyticus菌株16sRNA鉴定鉴定可信度C1524-FS. haemolyticus99%C1524-BS. haemolyticus98%C1526-F2S. haemolyticus100% 双黄连注射液双黄连注射液 利巴韦林注射液利巴韦林注射液 FTIR FTIR相似性分析相似性分析 DuPont RiboPrinter DuPont RiboPrinter基因指纹分析基因指纹分析4040几点思考（1）、怎样才算是同一株菌？ 需要深入认识微生物本身 微生物变异与保守的相对性； 分析方法的可变性与微生
19、物本身的可变性；生物学先锋琳恩马古利斯(Lynn Margulis)曾表示：“如果将一个特殊的质粒植入大肠杆菌，大肠杆菌便会突然间变成克雷伯氏杆菌”。 4141几点思考（2）、什么是最适宜的技术？ 需要深入认识分析微生物的技术和手段 形态学分析与相似性分析（生化反应谱、片段相似性、FTIR光谱相似性等），在权衡方法本身的边界和微生物变异性边界的基础上，似乎更适合对亲缘关系下一个否定的结论，即排除法，在这个意义上是否可以引入化学分析的3概念、精密度概念？ 42424、几点思考（2）、什么是最适宜的技术？ 16sRNA cDNA序列，需要研究，太保守不利于区分；变异率太高（高到普通传代、培养难以控
20、制）则没有意义。但一般来说16sRNA cDNA序列水平具有确定意义，困难在于确定足够长。 溯源分析不仅仅是鉴定到种，而是到株，对菌株的稳定性认识？与之相关的技术粗放性问题。 43434、几点思考（3）、怎样下结论？ 分析的根本目的是要下一个结论 以检验活动为中心、以检验过程为线索、以实 验事实为依据，根据所有信息的综合分析能力。 对阳性检出菌的技术分析最终要回到检验活动本身，技术分析结论 44444、结果报告l综合分析l慎下不合格结论l不放过任何一个阳性信息4545无菌无菌/ /微生物限度检查理念微生物限度检查理念环境保证环境保证培养基保证培养基保证无菌性检查无菌性检查灵敏度检查灵敏度检查有效的方法有效的方法方法验证方法验证SOPSOP操作操作有效的结果有效的结果可靠的结论可靠的结论结果判断结果判断4646l实验操作的标准化l验证试验的系统化l制定标准的严谨化l完备的实验室保障系统l最终目标：一次检验即可得到准确结果。4747l谢谢大家！4848
