《高速逆流色谱分离纯化抗生素ppt课件》由会员分享，可在线阅读，更多相关《高速逆流色谱分离纯化抗生素ppt课件（44页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、 高速逆流色谱分别纯化抗生素 郑 卫 福建省微生物研讨所 福州 350007 内 容 提 要一 高速逆流色谱技术简介 二 溶剂选择 在逆流色谱中的重要性三 高速逆流色谱技术分别纯化抗生素实例一一 高速逆流色谱技术简介高速逆流色谱技术简介高速逆流色谱高速逆流色谱(High Speed Counter Current (High Speed Counter Current Chromatography, HSCCC)Chromatography, HSCCC)a a 多层环绕管；多层环绕管；b b 平衡物平衡物优缺陷与优缺陷与HPLCHPLC等液等液- -固色谱技术比较固色谱技术比较) )优点优点
2、分别原理不同：互补性强分别原理不同：互补性强无需固体作固定相无需固体作固定相 ：不存在固体对样品组分的吸附、：不存在固体对样品组分的吸附、玷污、变性、失活、拖尾等景象，能实现很高的玷污、变性、失活、拖尾等景象，能实现很高的回收率，节省昂贵的资料耗费和溶剂耗费回收率，节省昂贵的资料耗费和溶剂耗费HPLCHPLC的的1/101/10以下，运转运用的后续投入较低以下，运转运用的后续投入较低 溶剂极性可调：无需改换不同极性的色谱柱即可实溶剂极性可调：无需改换不同极性的色谱柱即可实现流动相从弱极性到强极性或相反的转化现流动相从弱极性到强极性或相反的转化 色谱柱无填料，柱内空间全部是有效空间，容积大：色谱
3、柱无填料，柱内空间全部是有效空间，容积大：样品负载才干强，制备量大，重现性好样品负载才干强，制备量大，重现性好盘管总体积盘管总体积100mL100mL， 一次分别量：一次分别量：0.5-20.5-2克克盘管总体积盘管总体积3000mL3000mL，一次分别量：，一次分别量：15-6015-60克克 缺陷缺陷 分别效率实际塔板数还不高分别效率实际塔板数还不高1000) N=5.54(tR/W1/2)2一次分别所需时间还较长以小时计一次分别所需时间还较长以小时计 根本原理以及溶剂系统选择等还不完善根本原理以及溶剂系统选择等还不完善相应的配套检测器还不够完善溶剂干扰相应的配套检测器还不够完善溶剂干扰
4、分别后样品的纯度还需分别后样品的纯度还需HPLC等方法测定等方法测定混合溶剂的回收混合溶剂的回收二二 溶剂选择在高速逆流色谱中的重要性溶剂选择在高速逆流色谱中的重要性分别度分别度Rs: 2(tR2- tR1)/W1+W2Rs: 2(tR2- tR1)/W1+W2提高分别度的方法提高分别度的方法CCC &CPC: (tR2- tR1)CCC &CPC: (tR2- tR1) , HPLC: W1+W2, HPLC: W1+W2样品：极性、溶解度、纯度预处置样品：极性、溶解度、纯度预处置溶剂：两相溶剂的体积应尽量一样，挥发性较强溶剂：两相溶剂的体积应尽量一样，挥发性较强 样品样品+ +溶剂：溶剂：
5、沉降时间沉降时间301.5 1.5 溶剂系统：溶剂系统：固定相保管率：固定相保管率：75% 75% 表表1最正确溶剂体系选择表最正确溶剂体系选择表极极性性较较弱弱溶溶剂剂最最正正确确溶溶剂剂极极性较强溶剂性较强溶剂heptane,CHCl3THFH2Oheptane, toluene, MiBK, CHCl3, EtOAc ACO H2OheptanemethylethylketoneH2OTHFDMSOH2Otoluene,MtBE,MiBK,EtOAcMeCNH2Oheptane,toluene,CHCl3,EtOAcBuOHH2Oheptane,toluene,CHCl3,EtOAcPr
6、OHH2Oheptane,CHCl3,EtOAcEtOHH2Oheptane, toluene, CHCl3, EtOAc, BuOH MeOH H2Oheptane, toluene, CHCl3, MiBK, EtOAc, BuOH HOAc H2OCHCl3HCOOHH2O非水体系非水体系Heptane THF, DMF, EtOAc, PrOH, EtOH MeOH,MeCN逆流色谱中常用的几个三元溶剂体系相图逆流色谱中常用的几个三元溶剂体系相图 Type 1: Chloroform / Methanol / WaterType 1: Chloroform / Methanol / W
7、ater运用：杆菌肽，运用：杆菌肽，NiphimycinNiphimycin，克念菌素，克念菌素 ，Herbicidins A, BHerbicidins A, B等等lType 2. Ethyl acetate / butanol / Waterl运用：WAP-8294A ，弱极性样品Type 0: Water /Dimethylsulfoxide / Tetrahydrofuran 运用：极性强的难溶性样品如两性霉素B CPC separation of Amphotericin B(peak 7) Water-DMSO-THF(24.6:16.2:59.2, V/V/V)溶剂系统的选择与
8、优化溶剂系统的选择与优化步骤步骤1:1:采用简单的梯度洗脱系统如水采用简单的梯度洗脱系统如水- -乙腈乙腈100:0100:0 0:1000:100用用HPLCHPLC对样品进展极性扫描分析对样品进展极性扫描分析 ，得到样品的极性范围得到样品的极性范围步骤步骤2:溶剂系统溶剂系统的优化的优化区域区域化合物极性化合物极性溶剂系统溶剂系统A强极性强极性正己烷正己烷/正丁醇正丁醇/甲醇甲醇/水水B中极性中极性正己烷正己烷/乙酸乙酯乙酸乙酯/甲醇甲醇/水水C非极性非极性正己烷正己烷/乙腈乙腈步骤步骤3:溶剂比例的优化溶剂比例的优化一次只改动一种溶剂的量一次只改动一种溶剂的量取少量样品在试管中进展分配系
9、数实验取少量样品在试管中进展分配系数实验TLC或或HPLC测定实验结果测定实验结果实例：孢绿菌素实例：孢绿菌素(Sporaviridins)的分别的分别SporaviridinsA1A2B1B2C1C2R1HHHHOHOHR2OHOHNH2NH2OHOHR3C2H5CH3C2H5CH3C2H5CH3孢绿菌素：碱性，水溶性，抗孢绿菌素：碱性，水溶性，抗G+菌和毛癣菌等。菌和毛癣菌等。化学构造：含七个糖元的化学构造：含七个糖元的34元大环内酯化合物，主要有元大环内酯化合物，主要有6个组分，个组分，由于构造非常类似，用由于构造非常类似，用HPLC等方法难以分别。等方法难以分别。溶解性：只溶于极性溶剂
10、如水、甲醇和正丁醇等。溶解性：只溶于极性溶剂如水、甲醇和正丁醇等。HSCCC方法：方法：溶剂系统选择：溶剂系统选择：正丁醇正丁醇/水：主要分布在上相正丁醇，因此，必需降低孢绿水：主要分布在上相正丁醇，因此，必需降低孢绿菌素在上相中的溶解度。方法：参与非极性溶剂如正己烷和菌素在上相中的溶解度。方法：参与非极性溶剂如正己烷和乙醚。乙醚。正丁醇正丁醇/乙醚乙醚/水：先固定正丁醇和水的体积各水：先固定正丁醇和水的体积各10mL)，参与不，参与不同体积的乙醚，发现同体积的乙醚，发现10：4：10V/V/V)效果较好。再固定正效果较好。再固定正丁醇丁醇/乙醚乙醚10：4，调整水的体积，确定正丁醇：乙醚：水
11、为，调整水的体积，确定正丁醇：乙醚：水为10：4：12。HSCCC：固定相保管率：固定相保管率：75%，分别时间：，分别时间：3.5h，洗脱体积：，洗脱体积：500mL分别前粗品分别前粗品15mg，分别后分别得到纯组分，分别后分别得到纯组分A1(1.4mg),A2(0.6mg),B1(0.7mg),B2(0.5mg),C1(1.1mg),C2(1.4mg)。lHPLC separation of sporaviridins. Column: Cosmosil 5C18 (5 lum, 150 mm*4.6 mm), mobile phase: methanol-1 M ammonium lch
12、loride (74:26,v/v), flow rate:1ml/min, detection: 232 nm. 孢绿菌素各组分在正丁醇系统中的分配系数 分配系数U/L正丁醇/乙醚/水 C2 B2 A2 C1 B1 A1 10:0:10 2.96 6.41 6.65 4.87 8.81 9.09 10:3:10 0.96 2.17 2.78 1.84 3.34 4.19 10:4:10 0.50 1.12 1.59 1.04 1.85 2.91 10:5:10 0.38 0.78 1.11 0.74 1.25 2.12 10:6:10 0.39 0.90 1.19 0.81 1.39 1.7
13、0 10:7:10 0.24 0.63 1.10 0.59 1.08 1.82 10:4:11 0.31 0.89 1.24 0.70 1.50 2.00 10:4:12 0.38 1.09 1.41 0.80 1.85 2.32 10:4:13 0.37 1.05 1.51 0.73 1.58 2.10 10:4:14 0.29 1.09 1.17 0.57 1.22 1.74lHPLC separatin of each sporaviridin component. Column: Cosmosil 5C18 (5 um, 150 mm*4.6mm), mobile phase: met
14、hanol-1 M ammonium choride (74:26, v/v), folw rate: 1ml/min,detection: 232 nm. 三三 高速逆流色谱技术分别纯化抗生素实例高速逆流色谱技术分别纯化抗生素实例文献报道：文献报道：样品样品 溶剂系统溶剂系统 流动相流动相 发表时间发表时间肽类肽类短杆菌肽短杆菌肽A,B,C C6H6-CHCl3-MeOH-H2O LP A,B,C C6H6-CHCl3-MeOH-H2O LP 19821982多粘菌素多粘菌素 n-BuOH-0.04MTFA(1%glycerol) LP n-BuOH-0.04MTFA(1%glycerol)
15、 LP 19911991杆菌肽杆菌肽 CHCl3-MeOH-H2O CHCl3-MeOH-H2O LP 1991LP 1991 CHCl3-EtOH-MeOH-H2O CHCl3-EtOH-MeOH-H2O LP 1991LP 1991WAP-8294A n-BuOH-EtOAC-0.005M TFA LP WAP-8294A n-BuOH-EtOAC-0.005M TFA LP 2001 2001 放线菌素类放线菌素类放线菌素混合物放线菌素混合物 Et2O-nC6H14-MeOH-H2O UP Et2O-nC6H14-MeOH-H2O UP 1986 1986 样品样品溶剂系统溶剂系统流动相
16、流动相发表时间发表时间大环内酯类大环内酯类2-去甲基红霉素去甲基红霉素nC5H12-C6H6-AcO-iPrOH-0.01Mcitratebuffer(pH6.3)UP1988尼达霉素尼达霉素CCl4-MeOH-0.01MK3PO4buffer(pH7)UP1988TiacumicinsCCl4-CHCl3-MeOH-H2OUP1988ColoradocinCHCl3-MeOH-H2OUP1988孢绿菌素孢绿菌素n-BuOH-Et2O-H2OLP1990霉菌素霉菌素n-C6H14-EtOAc-MeOH-8%NH3.H2OLP1991Dunaimycinn-C6H14-EtOAc-MeOH-H2
17、OUP1991原始霉素原始霉素CHCl3-EtOAc-MeOH-H2OUP1992伊维菌素伊维菌素n-C6H14-EtOAc-MeOH-H2OLP1996螺旋霉素螺旋霉素n-C6H14-EtOAc-MeOH-H2OUP2000 样品样品 溶剂系统溶剂系统 流动流动相相 发表时间发表时间蒽环类蒽环类道诺红霉素衍生物道诺红霉素衍生物 CHCl3-CH2Cl2-nC6H14- CHCl3-CH2Cl2-nC6H14- MeOH-H2O MeOH-H2O UP 1981UP 1981Benzanthrins A, B CCl4-CHCl3-MeOH-H2O UP 1986Benzanthrins A,
18、 B CCl4-CHCl3-MeOH-H2O UP 1986Tetracenomycin D EtOAC-C6H12-MeOH-H2O UP 2005Tetracenomycin D EtOAC-C6H12-MeOH-H2O UP 2005多烯类多烯类呋罗托霉素呋罗托霉素 CCl4-CHCl3-MeOH-H2O UP CCl4-CHCl3-MeOH-H2O UP 19851985克念菌素克念菌素 CHCl3-MeOH-H2O UP CHCl3-MeOH-H2O UP 19871987头孢类头孢类Cephalosporin C & PEG600 15%W/W-(NH4)2SO4 Cephalos
19、porin C & PEG600 15%W/W-(NH4)2SO4 Desacetyl Cephalosporin C 17.5%W/W LP Desacetyl Cephalosporin C 17.5%W/W LP 19951995样品样品 溶剂系统溶剂系统 流动相流动相 发表时间发表时间其它其它Pentalenolactone CHCl3-MeOH-H2O UP Pentalenolactone CHCl3-MeOH-H2O UP 1985 1985 内酯内酯Tirandamycin A, B n-C6H14-EtOAc-MeOH-H2O UP Tirandamycin A, B n-C
20、6H14-EtOAc-MeOH-H2O UP 19851985Siderochelin A CHCl3-MeOH-H2O UP Siderochelin A CHCl3-MeOH-H2O UP 19851985A 201E CCl4-CHCl3-MeOH-H2O A 201E CCl4-CHCl3-MeOH-H2O UP 1985UP 1985Bu 2313B n-C6H14-CH2Cl2- MeOH-H2O LP Bu 2313B n-C6H14-CH2Cl2- MeOH-H2O LP 19851985Sordarin derivative CH2Cl2-CF3COOH(0.04%) UP
21、Sordarin derivative CH2Cl2-CF3COOH(0.04%) UP 20042004SCH 42282 CHCl3-MeOH-H2O SCH 42282 CHCl3-MeOH-H2O UP 1998UP 1998( (含糖大环内酰胺含糖大环内酰胺) ) 我们的任务我们的任务1.HSCCC分别海洋小单孢菌产生的黄酮类化合物分别海洋小单孢菌产生的黄酮类化合物HSCCC分别前粗品分别前粗品FW635HPLC图图HSCCC:仪器：同田生物仪器：同田生物TBE-300CHCl3:CH3OH:H2O(4:3:2,V/V/V)MobilePhase:LP，转速，转速800rpmFW63
22、5I1t110.75minFW635I-2t211.35min2.HSCCC分别大环内酯类抗生素分别大环内酯类抗生素从土壤放线菌次级代谢产物中分别出两个大环内酯类抗真菌抗从土壤放线菌次级代谢产物中分别出两个大环内酯类抗真菌抗生素生素Ac1和和Ac2,两者构造类似，难以用两者构造类似，难以用HPLC等色谱方法分别。等色谱方法分别。分别前分别前HPLC分析图分析图HSCCC分别分别仪器：同田生物仪器：同田生物TBE-300溶剂体系选择：正己烷：异丙醚：甲醇：水溶剂体系选择：正己烷：异丙醚：甲醇：水=2：3：6：5下相下相HPLC图图上相上相HPLC图图计算计算K值和值和值：值：K值：值：KAc1=
23、上相中上相中Ac1的峰面积的峰面积/下相中下相中Ac1的峰面的峰面积积=1699782/2298768=0.74KAc2=上相中上相中Ac2的峰面积的峰面积/下相中下相中Ac2的峰的峰面积面积=2542940/2172947=1.17值值=KAc2/KAc1=1.17/0.74=1.58固定相：上相；保管率；固定相：上相；保管率；79%；流速：；流速：1mL/min转速：转速：800rpm分别后分别后Ac1HPLC图图Ac2HPLC图图3HSCCC分别环孢菌素由茄病镰刀菌产生分别环孢菌素由茄病镰刀菌产生环孢菌素：环孢菌素：A，X=H,Y=CH3；B，X=Y=H；C，X=OH,Y=CH3；D，X
24、=Y=CH3；H，(D-MeVal11)CsA环孢菌素环孢菌素A B、C、D和和H的化学构造的化学构造HSCCCHSCCC分别纯化天然环孢菌素分别纯化天然环孢菌素 仪器：同田生物仪器：同田生物TBE-300TBE-300分别前分别前分别后分别后: :石油醚石油醚/ /丙酮丙酮/ /水水3 3：3 3：2 2, Mobile Phase: LP , Mobile Phase: LP 组份组份 纯度纯度% % 收率收率% %第一部分第一部分 Cyclosporin C 99.3 85.0 Cyclosporin C 99.3 85.0第二部分第二部分 Cyclosporin B 98.7 88.5
25、 Cyclosporin B 98.7 88.5第三部分第三部分 Cyclosporin A 98.6 90.2 Cyclosporin A 98.6 90.2第四部分第四部分 Cyclosporin D 98.4 86.3 Cyclosporin D 98.4 86.3 Cyclosporin C 10.816min Cyclosporin B 11.915min Cyclosporin A 13.493min Cyclosporin D 16.043min 蒸发光散射器蒸发光散射器(ELSD)在线检测在线检测HSCCC分别分别HSCCC分分别环孢菌素其它菌素其它组分分CsL(组分分1HSC
26、CC分分别环孢菌素其它菌素其它组分分组分分2构造待确定构造待确定HSCCC分分别环孢菌素其它菌素其它组分分CsE(组分分3HSCCC分别半合成环孢菌素异构体分别半合成环孢菌素异构体异构体异构体1化学构造化学构造HPLC分析图分析图异构体异构体1分别的溶剂系统选择分别的溶剂系统选择(石油醚石油醚/丙酮丙酮/水水HSCCC分别分别石油醚石油醚/丙酮丙酮/水水=3:3:2,流动相：流动相：LP固定相保管率：固定相保管率：76%;流速：流速：1.5ml/min;转速转速:900rpm;=K2：K1=0.69/0.43=1.60溶剂比例a上(峰面积)a下(峰面积)b上(峰面积)b下(峰面积)K1(a上/
27、 a下)K2(b上/ b下)3：2：220501052458306394608338131620.831.033：3：230461077112647255803636821470.430.693：4：2330148113373343185606364982370.250.29分别前分别前分别后分别后异构体异构体2顺顺-反异构体反异构体HPLC分析图分析图异构体异构体2分别的溶剂系统选择分别的溶剂系统选择(石油醚石油醚/甲醇甲醇/丙酮丙酮/水水HSCCC分别分别石油醚石油醚/甲醇甲醇/丙酮丙酮/水水=3：1.5：3：2,流动相：流动相：LP固定相保管率：固定相保管率：83%;流速：流速：2.0m
28、l/min;转速转速:900rpm;=K2/K1=1.28/0.83=1.54溶剂比例a上(峰面积)a下(峰面积)b上(峰面积)b下(峰面积)K1(a上/ a下)K2(b上/ b下)3：0.5：3：212380407217200216238221189036980.570.333：1.0：3：2880688813836092518637052423800.660.993：1.5：3：21135302513614393641640249964500.831.28分别前分别前分别后：分别后：2A反式反式2B顺式顺式致谢：同田生物的大力支持致谢：同田生物的大力支持本所：方东升本所：方东升季新燕季新燕温耀明温耀明陈振伟陈振伟陈秀明陈秀明方剑英方剑英范建辉等范建辉等谢谢大家！谢谢大家！
