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2、主要内容v基本原理基本原理v定量依据（掌握）定量依据（掌握）v仪器及结构（掌握）仪器及结构（掌握）v测定条件选择测定条件选择v定量方法及仪器使用（掌握）定量方法及仪器使用（掌握） 分光光度计分光光度计一、基本原理一、基本原理1 1、光的基础知识：、光的基础知识：（1）基本性质：）基本性质：波动性：如光的折射、衍射、干涉现象波动性：如光的折射、衍射、干涉现象微粒性：微粒性：如光的吸收、反射如光的吸收、反射（2）光的分类）光的分类：根据波长不同，光可分为以下几个区：根据波长不同，光可分为以下几个区：10nm400nm780nm30um紫外光区紫外光区可可见见光光区区红外光区红外光区（3）单色光和复
3、合光：）单色光和复合光：单色光单色光：只有单一波长光组成的光；：只有单一波长光组成的光； 复合光复合光：由两种或两种以上波长光组成的光。：由两种或两种以上波长光组成的光。一、基本原理一、基本原理（续）（续）2、物、物质对质对光的光的选择选择性吸收性吸收 （2）对对不不同同有有色色物物质质，其其max不不同同，吸吸收收曲曲线线形形状状也也不不同。同。 实验：实验：使使不同波不同波长长的光的光透透过过某一某一固定固定浓浓度度C C和和同一液同一液层层厚度厚度b b的的均匀有色均匀有色溶液，溶液，测测量此溶量此溶液液对对每一波每一波长长光光的吸收程度的吸收程度A A。 然后以波然后以波长为长为横坐横
4、坐标标，吸光度，吸光度为纵为纵坐坐标标作作图图，所得曲，所得曲线线称称为为吸收曲吸收曲线线。 两点结论：两点结论：（1）对对同同一一有有色色物物质质，不不论论其其浓浓度度大大小小，其其最最大大吸吸收收处处对对应应的的波波长长max不不变变，A随随浓浓度度增增大大而增大；而增大；应应用：用：在分光光度法中，选择在分光光度法中，选择max为入射光波长。为入射光波长。描述了有色物描述了有色物质对质对不同波不同波长长光的吸收能光的吸收能力力A吸收曲吸收曲线线：灵敏度高灵敏度高稳定性稳定性好好二、定量依据二、定量依据 v 表达式：表达式：A=lg(IA=lg(I0 0/I/I透透)=)=abcabc 式
5、中：式中： I I0 0入射光强度入射光强度 I I透透 透射光强度透射光强度 AA吸光度吸光度 c c有色溶液的浓度，有色溶液的浓度，mol/Lmol/L； b b吸收池液层厚度，吸收池液层厚度，cmcm。 aa比例常数，称比例常数，称为为吸光系数吸光系数。 物理意义：物理意义： 当当一束平行单色光一束平行单色光通过通过均匀的有色溶液均匀的有色溶液时，溶液的吸光度与溶液浓度时，溶液的吸光度与溶液浓度和液层厚度的乘积成正比。和液层厚度的乘积成正比。反映物反映物质对质对光光吸收能力的大吸收能力的大小小1 1、郎白、郎白- -比耳定律：比耳定律：2、透光率、透光率T% T T范范围围：0 0100
6、%100%（15%15%65%65%） A A范范围围：（最佳范围：最佳范围：0.10.10.70.7）则：则：T T与与A A之间的关系：之间的关系：T=（I透透/I0）100%3、吸光度的测量要用参比液、吸光度的测量要用参比液（掌握）（掌握） 消除方法：消除方法： 采用光学性采用光学性质质相同相同、厚度相同的厚度相同的比色皿盛上比色皿盛上纯试剂纯试剂作参比，作参比，调节仪调节仪器，器，使透使透过过参比皿的吸光度参比皿的吸光度A=0A=0 原因：原因： 为为消除比色皿的反射和试剂吸收消除比色皿的反射和试剂吸收对光强度的影响，对光强度的影响，使光使光强强度的减弱度的减弱仅仅与溶液中待与溶液中待
7、测测物物质质的的浓浓度有关度有关。4 4、偏离朗白、偏离朗白- -比耳定律的原因比耳定律的原因 非单色光引起的偏离非单色光引起的偏离 朗白朗白- -比耳定律适用于理想溶液。比耳定律适用于理想溶液。 消除措施消除措施: :将溶液稀释到一定程度。将溶液稀释到一定程度。 消消除除措措施施: : 入入射射光光选选择择被被测测溶溶液液吸吸收收曲线较平直部分曲线较平直部分( (高峰处高峰处) )对应的波长。对应的波长。溶液浓度偏大溶液浓度偏大（三）分光光度计（三）分光光度计 仪器基本组成：仪器基本组成： 光源、单色器、吸收池、读数检测系统光源、单色器、吸收池、读数检测系统722S型型752型型可见分光光度
8、计：可见分光光度计：721721型、型、722722型、型、72207220、722722S S、723723、72307230等等紫外紫外-可见分光光度计：可见分光光度计：751751、752752型型等等（三）分光光度计（三）分光光度计 具有足够的光强度；具有足够的光强度；光强在一定时间内保持稳定。光强在一定时间内保持稳定。（稳压装置）（稳压装置）棱镜材质：棱镜材质： a a、玻璃的：用于可玻璃的：用于可见见光区；光区； b b、石英的：适用于紫外光区。石英的：适用于紫外光区。 1 1、光源：、光源：作用：作用：提供波长连续的复合光光提供波长连续的复合光光对光源的要求：对光源的要求：2、单
9、色器、单色器：作用：作用：把复合光转变为单色光。把复合光转变为单色光。以棱镜、光栅作为单色器以棱镜、光栅作为单色器 3 3、吸收池（又叫比色皿）、吸收池（又叫比色皿）可见光度计：玻璃材质可见光度计：玻璃材质紫外光度计：石英材质紫外光度计：石英材质比色皿架中的比色皿比色皿架中的比色皿比色皿比色皿 3 3、吸收池（续）、吸收池（续）（1）手拿毛面；）手拿毛面；（2）装）装2/3满，事前润洗满，事前润洗23遍；遍；（3）用镜头纸擦干外周水滴，使光面干净；）用镜头纸擦干外周水滴，使光面干净；（4）位置放正；）位置放正；（5）测完后及时倒掉，冲洗干净）测完后及时倒掉，冲洗干净（洗涤方法见（洗涤方法见P2
10、2）；（6）保持比色皿的配套性）保持比色皿的配套性（如不清楚时，应事前检验其配套性，（如不清楚时，应事前检验其配套性，见实训篇见实训篇P21P21）使用时注意事项使用时注意事项（见实训篇见实训篇P22P22 ）： 光信号光信号 电信号，通过数据转换，显示吸光度值。电信号，通过数据转换，显示吸光度值。4、检测系统：、检测系统：作用：作用：常用的是光电管。常用的是光电管。四、显色反应及条件的选择四、显色反应及条件的选择 显色反应：显色反应：待测物质待测物质+显色剂显色剂 有色物质有色物质（1）灵敏度高；）灵敏度高；（2）选择性好；）选择性好；（3）显色剂的）显色剂的A0；（3）生成物有足够的稳定时
11、间。）生成物有足够的稳定时间。 （1）显色剂用量：）显色剂用量： （2）反应液酸度、温度：）反应液酸度、温度： （3）反应时间：）反应时间：（以上各项加入量都是通过实验确定的）（以上各项加入量都是通过实验确定的）1、显色反应的选择：、显色反应的选择：2、显色条件的选择：、显色条件的选择： 3 3、测量条件的选择：、测量条件的选择：（1）入射光波长的选择：）入射光波长的选择：（2）参比液选择：）参比液选择： 总原则：总原则：使测得的吸光度真正反映待测物浓度值使测得的吸光度真正反映待测物浓度值 常用的参比液：常用的参比液：a、纯溶液；纯溶液； b、空白溶液空白溶液（3）吸光度范围选择：）吸光度范围
12、选择：0.10.7v五、定量方法：五、定量方法：标准曲线法（以六价铬为例说明）标准曲线法（以六价铬为例说明） 1、配制标准系列、配制标准系列： 先配制先配制标准储备液标准储备液（含六价铬（含六价铬100ug/mL），），使用当天稀释为使用当天稀释为标准使用液标准使用液(5ug/mL)。然后向一组然后向一组50mL比色管中比色管中分别加入分别加入标准使用液，体积如下：标准使用液，体积如下：00.20.51.002.004.006.008.0010.00对应的六价铬含量：对应的六价铬含量：01.02.551020304050 （ug）定容至定容至5050mLmL刻度；刻度； 加酸，摇匀；加显色剂。
13、加酸，摇匀；加显色剂。 2 2、测定对应的吸光度值、测定对应的吸光度值：A0A1A2A3A4A5A6A7A83 3、利用、利用含量含量与与对应的吸光度值对应的吸光度值在坐标系中绘制标准曲线在坐标系中绘制标准曲线(如何绘制？如何绘制？)横坐标横坐标纵坐标纵坐标五、定量方法五、定量方法（续上篇）（续上篇）4、测量待测样品的、测量待测样品的A值；值；5、从标准曲线上查得（或计算）待测物含量从标准曲线上查得（或计算）待测物含量m；6、计算水样浓度：、计算水样浓度： m从从标标准准曲曲线线上上查查得得（或或计计算算）待待测测物物含含量量，ug；V水样水样水样体积，水样体积，mL。如何绘制标准曲线呢？如何
14、绘制标准曲线呢？六、回归与相关分析六、回归与相关分析（见实训篇（见实训篇P26P26） 1 1、直线回归方程的建立、直线回归方程的建立 xi(自变量自变量)x1x2x3xixnyi（实测值）实测值）y1y1y1yiyn如果如果x、y之间是线性关系，则有关系式：之间是线性关系，则有关系式：y=a+bx；当当x=xi时，时， yi/=a+bxi若使估计值与实测值之间误差最小，需使若使估计值与实测值之间误差最小，需使 为最小值为最小值 。把把yi/=a+bxi代入上式，求导，经过数学运算，得到代入上式，求导，经过数学运算，得到a、b的计算式。的计算式。六、回归与相关分析六、回归与相关分析（续）（续）
15、 1 1、直线回归方程的建立、直线回归方程的建立（续）（续） 得到回归方程：得到回归方程：y=a+bx根据方程画出的直线是误差最小的一条直线，叫校准曲线。根据方程画出的直线是误差最小的一条直线，叫校准曲线。2 2、相关系数、相关系数r r x x、y y之间是否有线性关系？由相关系数之间是否有线性关系？由相关系数r r来检验。来检验。 （1）正相关：）正相关： 0 r1，y随随x的增大而增大。的增大而增大。r = 1时，时，x、y之间完全正相关；之间完全正相关； 分光光度法中，一般要求分光光度法中，一般要求r0.9990。r范围：范围：-11之间（分为之间（分为正相关和负相关正相关和负相关）（
16、2）负相关：）负相关：-1r00，y随随x的增大而减小。的增大而减小。r=-1时，时，x、y之间完全负相关；之间完全负相关；3 3、标准曲线绘制过程、标准曲线绘制过程（见实训篇（见实训篇P28P28）： （1）把实验数据列表并计算，求出）把实验数据列表并计算，求出xi2、yi2、xiyi及加和值；及加和值；注意：注意：标准曲线是一段线段，而不是直线，不能随意延伸。标准曲线是一段线段，而不是直线，不能随意延伸。（4）在坐标纸上画标准曲线）在坐标纸上画标准曲线（选取较远的两点连线，准确度较高）（选取较远的两点连线，准确度较高）（3）计算截距）计算截距a和斜率和斜率b，得到标准曲线方程；得到标准曲线
17、方程；（2）计算相关系数）计算相关系数r，并判断并判断x和和y之间的相关性；之间的相关性；（以上的计算可用计算器直接求得。）以上的计算可用计算器直接求得。）3 3、标准曲线绘制过程、标准曲线绘制过程（续（续）： 另见另见“光度法应用实例光度法应用实例”721仪器使用721光度计及使用方法：光度计及使用方法：（1）打开开关预热至稳定；）打开开关预热至稳定；（2）调波长钮至所需波长；）调波长钮至所需波长；（3）打开暗盒盖，调）打开暗盒盖，调0钮或键，使钮或键，使T为为0；放好参比液，盖上暗盒盖，调；放好参比液，盖上暗盒盖，调100钮或键，使钮或键，使T为为100，即，即A0。（4）拉出拉杆，依次读
18、数。拉出拉杆，依次读数。注意比色皿使用方法及配套性检验注意比色皿使用方法及配套性检验722仪器使用722光度计及使用方法：光度计及使用方法：（1）打开开关预热至稳定；）打开开关预热至稳定；（2）调波长钮至所需波长；）调波长钮至所需波长；（3）打开暗盒盖，按功能键显示）打开暗盒盖，按功能键显示T，再再按按0键使键使T显示为显示为0；放好参比液，盖上；放好参比液，盖上暗盒盖，按暗盒盖，按100键，使键，使T显示为显示为100。再按功能键使显示再按功能键使显示A，即即A0。（4）拉出拉杆，依次读数。拉出拉杆，依次读数。注意比色皿使用方法及配套性检验注意比色皿使用方法及配套性检验谢谢！再见！谢谢！再见！谢谢！再见！
