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1、食品中大肠菌群的测定食品中大肠菌群的测定食品中大肠菌群的测定食品中大肠菌群的测定1一一一一 大肠菌群的概念及组成大肠菌群的概念及组成大肠菌群的概念及组成大肠菌群的概念及组成大肠菌群的概念大肠菌群的概念 大肠菌群系指一群需氧及兼性厌氧，在大肠菌群系指一群需氧及兼性厌氧，在3737能分解乳糖产酸、产气的革兰能分解乳糖产酸、产气的革兰氏氏阴性阴性无芽胞杆菌。无芽胞杆菌。 大肠菌群的组成大肠菌群的组成 大肠埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属、产气克雷伯氏菌属和阴沟肠杆菌。大肠埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属、产气克雷伯氏菌属和阴沟肠杆菌。2二、大肠菌群的测定意义二、大肠菌群的测定意义二、大肠菌群的测定意义二、大肠菌群的
2、测定意义1 1、粪便污染的指标菌：、粪便污染的指标菌： 大肠菌群或大肠杆菌大肠菌群或大肠杆菌 2 2、以大肠菌群作为粪便指标菌原因、以大肠菌群作为粪便指标菌原因 （1 1）在粪便中数量最大；）在粪便中数量最大； （2 2）在外环境中存活的时间与致病菌大体相同；）在外环境中存活的时间与致病菌大体相同； （3 3）检测方法简便容易。）检测方法简便容易。 3二、大肠菌群的测定意义二、大肠菌群的测定意义二、大肠菌群的测定意义二、大肠菌群的测定意义3 3、大肠菌群的测定意义、大肠菌群的测定意义 （1 1）判断食品中否受到粪便污染。）判断食品中否受到粪便污染。 （2 2）有利于控制肠道传染病的发生和流行。
3、）有利于控制肠道传染病的发生和流行。 （3 3）有利于控制食品在生产加工、运输、保存等过程中的卫生状况。）有利于控制食品在生产加工、运输、保存等过程中的卫生状况。4三、三、三、三、大肠菌群的生物学特性大肠菌群的生物学特性大肠菌群的生物学特性大肠菌群的生物学特性1.1.形态与染色：革兰氏染色阴性，无芽胞杆菌。形态与染色：革兰氏染色阴性，无芽胞杆菌。 2.2.发酵乳糖产酸产气发酵乳糖产酸产气 3.3.培养特性：在琼脂上的典型菌落培养特性：在琼脂上的典型菌落: :呈深紫黑色或中心深紫色，圆形，稍呈深紫黑色或中心深紫色，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，常有金属光泽；凸起，边缘整齐，表面光滑，常有金属
4、光泽； 在麦康凯琼脂上的典型菌落在麦康凯琼脂上的典型菌落: :呈桃红色或中心桃红、圆形，扁平，光滑湿润。呈桃红色或中心桃红、圆形，扁平，光滑湿润。 5糖发酵试验糖发酵试验大肠杆菌革兰氏染色镜下照片6大肠杆菌在伊红美蓝琼脂平板上的特征 7麦康凯琼脂平板照片8中华人民共和国国家标准GB 4789.32010食品安全国家标准食品微生物学检验 大肠菌群计数2010-03-26 发布2010-06-01 实施中 华 人 民 共 和 国 卫 生 部 发布9.前言n本标准代替GB/T 4789.3-2008食品卫生微生物学检验大肠菌群计数。n本标准与GB/T 4789.3-2008相比，主要修改如下：n修改
5、了标准的中英文名称；n“第二法大肠菌群平板计数法”的平板菌落数的选择范围修改为“15 CFU150 CFU”；n删除了“第三法大肠菌群PetrifilmTM 测试片法”。n本标准的附录A、附录B为规范性附录。n本标准所代替标准的历次版本发布情况为：nGB 4789.3-1984、GB 4789.3-1994、GB /T 4789.3-2003、GB /T 4789.3-2008。10食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数n1 范围n本标准规定了食品中大肠菌群（Coliforms）计数的方法。n本标准适用于食品中大肠菌群的计数。n2 术语和定义n2.1 大肠菌群coliformsn在一定培
6、养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。n2.2 最可能数most probable number，MPNn基于泊松分布的一种间接计数方法。113 设备和材料n除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：n3.1 恒温培养箱：36 1 。n3.2 冰箱：2 5 。n3.3 恒温水浴箱：46 1 。n3.4 天平：感量0.1 g。n3.5 均质器。n3.6 振荡器。n3.7 无菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头。n3.8 无菌锥形瓶：容量500 mL。n3.9 无菌培养皿：直径90 mm。n3.1
7、0 pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸。n3.11 菌落计数器。124 培养基和试剂n4.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（Lauryl Sulfate Tryptose，LST）肉汤：见附录A 中A.1。n4.2 煌绿乳糖胆盐（Brilliant Green Lactose Bile，BGLB）肉汤：见附录A 中A.2。n4.3 结晶紫中性红胆盐琼脂（Violet Red Bile Agar，VRBA）：见附录A 中A.3。n4.4 磷酸盐缓冲液：见附录A 中A.4。n4.5 无菌生理盐水：见附录A 中A.5。n4.6 无菌1 mol/L NaOH：见附录A 中A.6。n4.7 无菌1 mol/
8、L HCl：见附录A 中A.7。13第一法大肠菌群MPN 计数法n5 检验程序n大肠菌群MPN计数的检验程序见下图1。14156 操作步骤n6.1 样品的稀释n6.1.1 固体和半固体样品：称取25 g 样品,放入盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内,8000 r/min10000 r/min 均质1 min2 min,或放入盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min2 min，制成1:10 的样品匀液。n6.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25 mL 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌
9、玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10 的样品匀液。n6.1.3 样品匀液的pH 值应在6.57.5 之间，必要时分别用1 mol/L NaOH 或1 mol/L HCl 调节。16n6.1.4 用1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液1 mL，沿管壁缓缓注入9 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1 支1 mL 无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1:100 的样品匀液。n6.1.5 根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1 次，换用1 支1 mL 无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至
10、样品接种完毕，全过程不得超过15 min。176.2 初发酵试验n每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1 mL，则用双料LST肉汤），361 培养24 h2 h，观察倒管内是否有气泡产生，24 h2 h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至48 h2 h，产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。186.3 复发酵试验n用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，36 1培养48 h2 h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性
11、管。196.4 大肠菌群最可能数（MPN）的报告n按6.3确证的大肠菌群LST阳性管数，检索MPN表（见附录B），报告每g（mL）样品中大肠菌群的MPN值。20第二法大肠菌群平板计数法n7 检验程序n大肠菌群平板计数法的检验程序见图2。218 操作步骤n8.1 样品的稀释n按6.1进行。n8.2 平板计数n8.2.1 选取2个3个适宜的连续稀释度, 每个稀释度接种2个无菌平皿，每皿1 mL。同时取1 mL生理盐水加入无菌平皿作空白对照。n8.2.2 及时将15 mL20 mL冷至46 的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）约倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加
12、3 mL4 mLVRBA覆盖平板表层。翻转平n板，置于36 1 培养18 h24 h。22n8.3 平板菌落数的选择n选取菌落数在15 CFU150 CFU 之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。n典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5 mm 或更大。n8.4 证实试验n从VRBA 平板上挑取10 个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB 肉汤管内，36 1 n培养24 h48 h，观察产气情况。凡BGLB 肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。238.5 大肠菌群平板计数的报告n经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以8.3中计数的平板菌落数，再乘
13、以稀释倍数，即为每g（mL）样品中大肠菌群数。n例：10-4样品稀释液1 mL，在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：1006/10104/g（mL）=6.0105CFU/g（mL）。24附录A（规范性附录）培养基和试剂nA.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤nA.1.1 成分n胰蛋白胨或胰酪胨 20.0 gn氯化钠 5.0 gn乳糖 5.0 gn磷酸氢二钾（K2HPO4） 2.75 gn磷酸二氢钾（KH2PO4） 2.75 gn月桂基硫酸钠 0.1 gn蒸馏水 1 000 mLnpH 6.80.2nA.1.2
14、 制法n将上述成分溶解于蒸馏水中，调节 pH。分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10 mL。121 高压n灭菌15 min。25A.2 煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤nA.2.1 成分n蛋白胨 10.0 gn乳糖 10.0 gn牛胆粉（oxgall或oxbile）溶液 200 mLn0.1%煌绿水溶液 13.3 mLn蒸馏水 800 mLnpH 7.20.1nA.2.2 制法n将蛋白胨、乳糖溶于约500 mL蒸馏水中，加入牛胆粉溶液200 mL（将20.0 g脱水牛胆粉溶于200 mLn蒸馏水中，调节pH至7.07.5），用蒸馏水稀释到975 mL，调节pH，再加入0.1%煌绿水溶液13.3 mL
15、，n用蒸馏水补足到1 000 mL，用棉花过滤后，分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10 mL。121 高压灭n菌15 min。26A.3 结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）nA.3.1 成分n蛋白胨 7.0 gn酵母膏 3.0 gn乳糖 10.0 gn氯化钠 5.0 gn胆盐或3号胆盐 1.5 gn中性红 0.03 gn结晶紫 0.002 gn琼脂 15 g18 gn蒸馏水 1 000 mLnpH 7.40.1A.3.2 制法n将上述成分溶于蒸馏水中，静置几分钟，充分搅拌，调节pH。煮沸2 min，将培养基冷却至45 n50 倾注平板。使用前临时制备，不得超过3 h。27A.4 磷酸盐缓冲液nA.4.1 成分n磷酸二氢钾（KH2PO4） 34.0 gn蒸馏水 500 mLnpH 7.2nA.4.2 制法n贮存液：称取34.0 g的磷酸二氢钾溶于500 mL蒸馏水中，用大约175 mL的1 mol/L氢氧化钠溶液调节npH，用蒸馏水稀释至1 000 mL后贮存于冰箱。n稀释液：取贮存液1.25 mL，用蒸馏水稀释至1 000 mL，分装于适宜容器中，121 高压灭菌15 min。28附录B（规范性附录）大肠菌群最可能数（MPN）检索表nB.1 大肠菌群最可能数（MPN）检索表n每g（mL）检样中大肠菌群最可能数（MPN）的检索见表B.1。2930 结束！31
