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1、第一节第一节 基因诱变基因诱变一、蛋白质工程一、蛋白质工程通过蛋白质化学、蛋白质晶体学、蛋白动力学通过蛋白质化学、蛋白质晶体学、蛋白动力学的研究获取关于蛋白质的物理、化学等各方面的研究获取关于蛋白质的物理、化学等各方面的信息，在此基础上对编码该蛋白质的基因进的信息，在此基础上对编码该蛋白质的基因进行有目的的设计改造，并通过基因工程将其表行有目的的设计改造，并通过基因工程将其表达和纯化，最终投入实际应用。达和纯化，最终投入实际应用。专一改变基因中某一个或某些特定氨基专一改变基因中某一个或某些特定氨基酸的技术。酸的技术。二、定点突变（二、定点突变（site-specific mutagenesis
2、）加拿大科学家加拿大科学家Michael Smith1985年建立，年建立，并与并与1993年获年获Nobel化学奖。化学奖。1. M13 DNA1. M13 DNA进行的寡核苷酸介导诱变进行的寡核苷酸介导诱变进行的寡核苷酸介导诱变进行的寡核苷酸介导诱变（1）条件）条件所要改变的基因编码区的精确的核苷酸序列。所要改变的基因编码区的精确的核苷酸序列。所要引入的氨基酸变化。所要引入的氨基酸变化。（2）方法）方法取得目的基因。取得目的基因。GGCTTACCGAAT5533插入到双链形式的插入到双链形式的M13噬菌体载体中噬菌体载体中分离出分离出M13正链重组载体正链重组载体GGCTTACCGAATG
3、GCTTA合成带有突变核苷酸的目的基因寡核苷酸片段合成带有突变核苷酸的目的基因寡核苷酸片段CCGAAG53带有突变核苷酸的寡核苷酸片段与带有突变核苷酸的寡核苷酸片段与M13（+）链链复性。复性。错配的核苷酸位于片段的中部，以利于复性杂交。错配的核苷酸位于片段的中部，以利于复性杂交。GGCTTACCGAA53G以寡核苷酸链作引物，以以寡核苷酸链作引物，以M13（+）作模板作模板,用用Klenow片段合成片段合成M13（-）链。链。GGCTTAGCCGAA53用用T4DNA连接酶连接结成完整的双链连接酶连接结成完整的双链GGCTTACCGAAG转化大肠杆菌，噬菌体转化大肠杆菌，噬菌体DNA在大肠杆
4、菌中扩增，在大肠杆菌中扩增，形成一半野生型形成一半野生型M13双链双链DNA，一半突变型一半突变型M13双链双链DNA噬菌体。噬菌体。野生型野生型CCGAAG诱变型诱变型GGCTTCGGCTTACCGAAT（M13的复制型是双链环状的复制型是双链环状DNA）。）。母链母链（3 3）缺点：）缺点：分离提取分离提取M13M13双链双链DNADNA，再转化大肠杆菌，用寡聚核再转化大肠杆菌，用寡聚核苷酸探针挑选突变型载体克隆。苷酸探针挑选突变型载体克隆。切下突变基因，接到表达载体中表达诱变的蛋白质。切下突变基因，接到表达载体中表达诱变的蛋白质。通常只有通常只有1%-5%1%-5%的噬菌斑含有突变的基因
5、。的噬菌斑含有突变的基因。（4 4）改进：）改进：目的基因插入双链形式的目的基因插入双链形式的M13M13噬菌体后，转入特噬菌体后，转入特殊的受体菌株中。殊的受体菌株中。2. 寡核苷酸介导的寡核苷酸介导的PCR诱变诱变（1）方法）方法将目的基因克隆到质粒上。将目的基因克隆到质粒上。在欲突变的位置上设计两对引物，分别在欲突变的位置上设计两对引物，分别带有两条链的突变核苷酸。带有两条链的突变核苷酸。ATGCATGCATGCATGCTACGTACGTACGTACGATGAATGCATGCTACGATGCATGCATGCATGCTACGTACGTACGTACGCATGCTACGTACTTACP1P2P
6、3P4分别进行分别进行PCR，扩增出线性的全长质粒。扩增出线性的全长质粒。但两组但两组PCR产物的末端位置不同。产物的末端位置不同。TACTTACGTACGATGCATGAATGCATGCTACGGTACGATGCATGAATGTACGTACTTACCATGCPCR产物变性成单链，混合后复性，形成产物变性成单链，混合后复性，形成具有粘性末端的杂交双链（具有粘性末端的杂交双链（1-4；2-3）。）。1234TACTTACGTACGTACGGTACGTACGTACTTACATGCATGAATGCATGCATGCATGAATGCATGC环化成有两个切口的开环质粒。用连接酶环化成有两个切口的开环质粒。
7、用连接酶连接或直接转入细菌（细菌会修复切口）。连接或直接转入细菌（细菌会修复切口）。1423粘性末端粘性末端粘性末端粘性末端3. 3.改进型双引物诱变改进型双引物诱变改进型双引物诱变改进型双引物诱变方法（是目前较常用的方法之一）：方法（是目前较常用的方法之一）：目的基因克隆到目的基因克隆到M13噬菌体载体中。噬菌体载体中。分离提取分离提取M13单链单链DNA作模板。作模板。设计两个不同区段的设计两个不同区段的PCR引物，延伸方向一致，引物，延伸方向一致，其中一个引物的其中一个引物的5端磷酸化。端磷酸化。引物引物1上引入突变核苷酸。上引入突变核苷酸。引物引物2对应于载体上的一个单一酶切位点，并将
8、这对应于载体上的一个单一酶切位点，并将这个位点突变一个核苷酸，使内切酶无法识别。个位点突变一个核苷酸，使内切酶无法识别。（一般设计在抗菌素抗性基因内）。（一般设计在抗菌素抗性基因内）。ATGCATGCATGCATGCTACTTACGTACG欲突变的位点欲突变的位点引物引物1CTGGAATTCATGCGACGACCTTAAATACG引物引物2单一酶切位点单一酶切位点P磷酸化磷酸化用用DNA聚合酶延伸后用聚合酶延伸后用T4DNA连接酶连连接酶连接成杂交双链。接成杂交双链。ATGCATGCATGCATGCTACTTACGTACGCTGGAATTCATGCGAC用引物用引物2对应的单一限制性内切酶切杂
9、交双链，会对应的单一限制性内切酶切杂交双链，会得到模板链被切开一个口但新生的链完整的杂交双链得到模板链被切开一个口但新生的链完整的杂交双链环。环。EcoRI酶切口酶切口转化修复缺陷型大肠杆菌。转化修复缺陷型大肠杆菌。GACCTTAAATACG4. 4. 重叠延伸诱变重叠延伸诱变重叠延伸诱变重叠延伸诱变模板链由于已经成为线性分子，且又不能被修模板链由于已经成为线性分子，且又不能被修复，所以不能在菌体内稳定存在，只剩下新生的复，所以不能在菌体内稳定存在，只剩下新生的突变链在菌体内复制。突变链在菌体内复制。目的基因克隆到载体上（不一定是目的基因克隆到载体上（不一定是M13）。）。设计两对引物：设计两
10、对引物：引物引物1和引物和引物2是目的基因两端的载体上的通用引物；是目的基因两端的载体上的通用引物；引物引物3和引物和引物4是与突变位点对应的反向互补序列。是与突变位点对应的反向互补序列。12CTGCTACGGGACGATGCCCTGCTGCGGGACGACGCC引物引物3引物引物4分别以引物分别以引物1、4和引物和引物2、3为组合进行为组合进行PCR。结结果形成带有突变的基因的左右两个部分。果形成带有突变的基因的左右两个部分。GACGACGCCCTGCTGCGG14CTGCTGCGG3GACGACGCC2两组两组PCR产物混合后变性、复性，可能形成下列产物混合后变性、复性，可能形成下列两种杂
11、交链，其中一种复性方式能够进一步在两种杂交链，其中一种复性方式能够进一步在3端端继续延伸，补足全长基因序列。继续延伸，补足全长基因序列。 1G 4C2C 3G 不能延伸不能延伸能延伸能延伸 1G2C 带突变的全长基因带突变的全长基因除去多余的引物，用通用引物除去多余的引物，用通用引物1、2依次为模板依次为模板进行进行PCR扩增。得到含有预期突变位点的基因。扩增。得到含有预期突变位点的基因。1G2C12插入载体进行表达突变的产物。插入载体进行表达突变的产物。第二节第二节 基因工程生产抗体基因工程生产抗体每一种生物的生命都始终经受着其他物种的每一种生物的生命都始终经受着其他物种的威胁。威胁。自然法
12、则之一自然法则之一一、抗体（一、抗体（antibody）1. 脊椎动物的免疫系统有三种基本的工作形式：脊椎动物的免疫系统有三种基本的工作形式：（1）细胞免疫（）细胞免疫（cellular immunity）T细胞中的一类（细胞中的一类（Killer T cell）杀死被病原感染杀死被病原感染的细胞。的细胞。T细胞中的另一类（细胞中的另一类（Helper T cell）对病原做出反应，对病原做出反应，分泌蛋白质（淋巴因子）刺激机体作出整体反应分泌蛋白质（淋巴因子）刺激机体作出整体反应（如产生巨噬细胞等）。（如产生巨噬细胞等）。（2）淋巴免疫）淋巴免疫（3）体液免疫）体液免疫B细胞分泌抗体与病原结
13、合。细胞分泌抗体与病原结合。二、抗体的结构和功能二、抗体的结构和功能（1）抗体的结构）抗体的结构有两条相同有两条相同的重链的重链（H）和两和两条相同的轻条相同的轻链（链（L）组组成的成的Y字形字形四聚体。四聚体。（2）抗体各部位的功能）抗体各部位的功能 抗体的抗原识别位点抗体的抗原识别位点位于位于H链和链和L链的链的N端（端（Y字形的支角上）。字形的支角上）。 恒定区（恒定区（C区）区）有三个互补决定区（有三个互补决定区（CDR）组成，这三个组成，这三个CDR都位于都位于H链和链和L链的链的N端的可变区内（端的可变区内（VH、VL）重链上有重链上有3个（个（CH1、CH2、CH3），），轻链上
14、有轻链上有1个（个（CL）。）。不同的抗体分子的恒定区的差异只有一个或两不同的抗体分子的恒定区的差异只有一个或两个氨基酸。个氨基酸。抗体分子的空间结构抗体分子的空间结构（3）木瓜蛋白酶处理后的抗体的结构）木瓜蛋白酶处理后的抗体的结构木瓜蛋白酶可将抗体分解成木瓜蛋白酶可将抗体分解成3各部分：各部分：两个两个Fab片段：片段：属于属于Y字形的两个角。包含完整的字形的两个角。包含完整的L链和链和H链链的的VH和和CH1一个一个Fc片段片段是是Y字形的柄部。包括两条重链的字形的柄部。包括两条重链的CH2和和CH3（4）Fab和和Fc片段的功能片段的功能 Fab具有抗原结合活性和特异性。具有抗原结合活性
15、和特异性。其实只要其实只要Fab上的上的VH和和VL（合称合称Fv片断）即可。片断）即可。Fc片段没有抗原结片段没有抗原结合活性，但它是抗原结合活性，但它是抗原结合到抗体上后激发机体合到抗体上后激发机体免疫反应的主要部位。免疫反应的主要部位。三、抗体的表达系统三、抗体的表达系统1. 在重组噬菌体中筛选生产抗体在重组噬菌体中筛选生产抗体（1）原理：）原理：抗体分子的抗体分子的Fab（Fv片段）是抗原的结合区。片段）是抗原的结合区。Fv片段编码重链和轻链的基因形成任意组合，片段编码重链和轻链的基因形成任意组合，然后检测他们与所需抗原的结合能力。然后检测他们与所需抗原的结合能力。（2）克隆载体）克隆
16、载体分别克隆分别克隆H链和链和L链的链的Fv片段，形成两种链的片段，形成两种链的cDNA文库。文库。 载体或载体或M13载体。载体。丝状噬菌体（单链环状丝状噬菌体（单链环状DNA）。如）。如M13、fd、f1等。等。（3）表达载体）表达载体Filamentous phage fdg3p：外壳蛋白外壳蛋白3；其余类似。其余类似。（3）方法）方法噬菌体展示（噬菌体展示（Phage display）：）：将外源蛋白（多肽、酶、抗体、将外源蛋白（多肽、酶、抗体、DNA结合蛋白）结合蛋白）结合到噬菌体的外壳蛋白上形成融合蛋白，表达结合到噬菌体的外壳蛋白上形成融合蛋白，表达于噬菌体的外表面。于噬菌体的外表
17、面。细菌表面展示细菌表面展示（Bacteria surface display）从经过免疫的小鼠或人的从经过免疫的小鼠或人的B细胞中分离细胞中分离mRNA（既有重链也有轻链的既有重链也有轻链的mRNA）。）。反转录制备反转录制备cDNA。设计一对重链的引物和一对轻链的引物，通过设计一对重链的引物和一对轻链的引物，通过PCR将重链和轻链的将重链和轻链的cDNA扩增。扩增。用特定的限制性内切酶切用特定的限制性内切酶切PCR产物。产物。辅助辅助M13噬菌体：噬菌体外壳蛋白基因完整。噬菌体：噬菌体外壳蛋白基因完整。从从H链文库和链文库和L链文库中随机切出链文库中随机切出H链和链和L链片段，链片段，把酶
18、切后的把酶切后的H链和链和L链片断连接，随机克隆到链片断连接，随机克隆到M13载载体的外壳蛋白体的外壳蛋白3（或（或8）下游，形成融合蛋白文库。）下游，形成融合蛋白文库。（抗体组合文库）（抗体组合文库） 把重链和轻链的把重链和轻链的cDNA PCR片段分别克隆到克片段分别克隆到克隆载体中，制成隆载体中，制成cDNA文库。文库。 构建构建M13载体：只包含外壳蛋白载体：只包含外壳蛋白3（或（或8基因）、基因）、细菌和病毒复制起点。细菌和病毒复制起点。 提取各噬菌斑的重组噬菌体颗粒，与抗原进行亲提取各噬菌斑的重组噬菌体颗粒，与抗原进行亲和分析，寻找结合力最强的噬菌体。和分析，寻找结合力最强的噬菌体
19、。分析亲和力强的载体上的抗体基因组合序列，转分析亲和力强的载体上的抗体基因组合序列，转到其他的表达载体上表达。到其他的表达载体上表达。重组载体与辅助载体共同感染细菌，形成有重重组载体与辅助载体共同感染细菌，形成有重组的组的M13外壳（外壳（3蛋白或蛋白或8蛋白上连着抗体片段蛋白上连着抗体片段）的的M13（内部所包装的内部所包装的DNA绝大多数是载体，辅绝大多数是载体，辅助载体助载体DNA复制效率差）。复制效率差）。第三节第三节 基因工程生产疫苗基因工程生产疫苗一、传统疫苗一、传统疫苗1.民间：民间：利用天花的干痂来预防天花。利用天花的干痂来预防天花。1796年乡村医生年乡村医生Edward J
20、enner用一种温和的奶用一种温和的奶牛的疾病牛痘感染人类，发现牛痘感染过的人不牛的疾病牛痘感染人类，发现牛痘感染过的人不会再被天花感染。会再被天花感染。2.第一次获得了真正意义上的疫苗第一次获得了真正意义上的疫苗Jenner把从牛逗脓疮中得到的渗出液注射到把从牛逗脓疮中得到的渗出液注射到8岁岁的小男孩的小男孩James Phipps 的体内，经过的体内，经过3次注射后，次注射后，Phipps 对天花有了完全的抗性。对天花有了完全的抗性。19世纪末，世纪末，Louis Pasteur 制成狂犬病疫苗。制成狂犬病疫苗。Von Behring制成白喉病疫苗。制成白喉病疫苗。Kitasato Shi
21、basaburo 制成破伤风病疫苗制成破伤风病疫苗 现在人类已经获得了麻疹、白喉、百日咳、破现在人类已经获得了麻疹、白喉、百日咳、破伤风、天花、脊髓灰质炎等病的疫苗。伤风、天花、脊髓灰质炎等病的疫苗。3. 疫苗的发展疫苗的发展但对艾滋病、疟疾、肺结核等依然束手无策。可但对艾滋病、疟疾、肺结核等依然束手无策。可能是需要细胞免疫（只有减毒活疫苗才能有效地能是需要细胞免疫（只有减毒活疫苗才能有效地诱发细胞免疫）。诱发细胞免疫）。典型的疫苗主要是灭活的和减毒的致病物质。典型的疫苗主要是灭活的和减毒的致病物质。病源物在培养、纯化后，或者被灭活，或者被病源物在培养、纯化后，或者被灭活，或者被降低毒性，降低
22、毒性，但前提是不能丧失其引起免疫反应但前提是不能丧失其引起免疫反应的能力。的能力。4. 疫苗的成分疫苗的成分5.传统疫苗的局限性传统疫苗的局限性（1）有些致病物无法在培养基上生长，所以很多）有些致病物无法在培养基上生长，所以很多病没办法获得疫苗。病没办法获得疫苗。（2）动物和人的病毒需要在动物细胞中培养，）动物和人的病毒需要在动物细胞中培养，成本极高。成本极高。（3）培养的动物或人类病毒的生长速度和）培养的动物或人类病毒的生长速度和 产量一产量一般较低。般较低。（4）需要对实验室和实验人员采取保护措施。）需要对实验室和实验人员采取保护措施。（5）疫苗中的致病物质在生产中有可能没有被完）疫苗中的
23、致病物质在生产中有可能没有被完全杀死或充分减毒。全杀死或充分减毒。（6）减毒的菌株有可能发生突变。）减毒的菌株有可能发生突变。（7）有些疾病（如）有些疾病（如AIDS）用传统的疫苗防治效果用传统的疫苗防治效果甚微。甚微。（8）绝大多数现行的疫苗的有效期都很短，并需）绝大多数现行的疫苗的有效期都很短，并需要冷冻保存，不利于在落后地区推广。要冷冻保存，不利于在落后地区推广。二、基因工程疫苗二、基因工程疫苗用基因工程的方法表达出病源物的一段基因序列，用基因工程的方法表达出病源物的一段基因序列，将表达产物（多数是无毒性、无感染能力、但有将表达产物（多数是无毒性、无感染能力、但有较强的免疫原性）用作疫苗
24、。较强的免疫原性）用作疫苗。目前使用的多数乙肝疫苗就属于基因工程疫苗。目前使用的多数乙肝疫苗就属于基因工程疫苗。1. 亚基疫苗（亚基疫苗（subunite vaccine）利用病源物的某一部分制得的疫苗称为亚基疫苗。利用病源物的某一部分制得的疫苗称为亚基疫苗。亚基疫苗非常适合于用基因工程技术生产。亚基疫苗非常适合于用基因工程技术生产。避免了直接使用病源物带来的危险。避免了直接使用病源物带来的危险。利用纯化的蛋白质作免疫源，避免了由于外源蛋利用纯化的蛋白质作免疫源，避免了由于外源蛋白和核酸的混杂造成的副作用。白和核酸的混杂造成的副作用。缺点缺点纯化蛋白十分昂贵。纯化蛋白十分昂贵。纯化后的蛋白的构
25、象可能与在体内时不同，纯化后的蛋白的构象可能与在体内时不同，导致抗原性发生变化。导致抗原性发生变化。亚基疫苗不具备感染性，所以一般不能激活亚基疫苗不具备感染性，所以一般不能激活MHCI分子，也就很难激活杀伤性分子，也就很难激活杀伤性T细胞。细胞。（1）亚基疫苗的优缺点：）亚基疫苗的优缺点：优点优点（2）亚基疫苗举例）亚基疫苗举例单纯疱疹病毒（单纯疱疹病毒（HSV）疫苗疫苗衣壳呈衣壳呈20面体，周围有一层无定形的物质（壳皮）面体，周围有一层无定形的物质（壳皮）覆盖。壳皮外是类脂双层膜。覆盖。壳皮外是类脂双层膜。基因组是线性双链基因组是线性双链DNA，长，长152.5kb，含有末端含有末端重复序列
26、和内部重复序列。重复序列和内部重复序列。TRL长独特区长独特区ULIRL IRS短独特区短独特区USTRS长基因组区长基因组区短基因组区短基因组区HSV的核心是缠有的核心是缠有DNA的纤丝卷轴，纤维的末的纤丝卷轴，纤维的末端在衣壳下侧固定。端在衣壳下侧固定。HSV颗粒中至少有颗粒中至少有33种蛋白，其中一半是糖蛋种蛋白，其中一半是糖蛋白。白。制备亚基疫苗的基本前提是制备亚基疫苗的基本前提是鉴定出哪些成分能激鉴定出哪些成分能激发机体产生抗体发机体产生抗体。HSV-1型的衣壳蛋白型的衣壳蛋白D（gpD）就是能引起老鼠就是能引起老鼠产生完整的产生完整的HSV抗体的成分。抗体的成分。gpD是个膜蛋白，
27、把其跨膜区删除，成为分泌蛋是个膜蛋白，把其跨膜区删除，成为分泌蛋白，成为疫苗。白，成为疫苗。膜膜N端（膜外）端（膜外）C端（膜内）端（膜内）跨膜区跨膜区膜膜CN改造过的改造过的gpD口蹄疫病毒（口蹄疫病毒（FMDV）疫苗疫苗传统的口蹄疫疫苗是用传统的口蹄疫疫苗是用甲醛灭活甲醛灭活的口蹄疫病毒。的口蹄疫病毒。FMDV中得到抗体产生的主要成分是中得到抗体产生的主要成分是病毒衣壳蛋病毒衣壳蛋白白1（VP1）。（foot-and-mouth disease virus）FMDV是单链是单链RNA病毒。对牛和猪有极强的毒性。病毒。对牛和猪有极强的毒性。将将VP1的的cDNA克隆表达、纯化。克隆表达、纯化
28、。2.肽疫苗肽疫苗衣壳蛋白组衣壳蛋白组成的外壳成的外壳病毒衣壳病毒衣壳病毒核酸病毒核酸动物病毒结构动物病毒结构根据动物病毒的结根据动物病毒的结构，可以推测：构，可以推测：只有位于衣壳外表的蛋白结构域只有位于衣壳外表的蛋白结构域才能引起免疫反才能引起免疫反应。因此只需要合成衣壳蛋白的抗原决定簇（小应。因此只需要合成衣壳蛋白的抗原决定簇（小肽）就可以当作疫苗。肽）就可以当作疫苗。VP1 C端的端的3个肽段（个肽段（141-160aa、151-160aa、200-213aa）和）和N端的端的3个肽段（个肽段（9-24aa、17-32aa、25-41aa）分别接到载体蛋白上（提高小肽的稳定性）。分别接
29、到载体蛋白上（提高小肽的稳定性）。结果：结果：141-160aa的肽段能诱导豚鼠产生足够的的肽段能诱导豚鼠产生足够的FMDV抗体。抗体。如果把如果把141-158aa与与200-213aa两个肽段连起来，不两个肽段连起来，不用载体蛋白稳定就能激发豚鼠产生高水平的抗体。用载体蛋白稳定就能激发豚鼠产生高水平的抗体。比任何一个肽段单独使用更有效。比任何一个肽段单独使用更有效。把把VP1的的142-160aa序列于具有强免疫源性的载体蛋序列于具有强免疫源性的载体蛋白白乙肝抗原蛋白（乙肝抗原蛋白（HBcAg）连接，会自动组装连接，会自动组装成成“27nm”颗粒，颗粒，VP1的小肽恰好位于颗粒外表面。的小
30、肽恰好位于颗粒外表面。这可能成为未来投送肽疫苗的常规方法。这可能成为未来投送肽疫苗的常规方法。肽疫苗的局限性：肽疫苗的局限性：肽段不能太长、肽段的构象与抗原决定簇的构象肽段不能太长、肽段的构象与抗原决定簇的构象要一致、必须有足够强的免疫源性。要一致、必须有足够强的免疫源性。3.活体重组疫苗活体重组疫苗用基因工程的方法对细菌和病毒进行改造，使之用基因工程的方法对细菌和病毒进行改造，使之成为活体重组疫苗（成为活体重组疫苗（live recombinant vaccine）组成：组成：可以是非致病的微生物，用基因工程方法使之带上可以是非致病的微生物，用基因工程方法使之带上并表达某种特定病源物的抗原决
31、定簇基因，产生免并表达某种特定病源物的抗原决定簇基因，产生免疫原性。疫原性。也可以是本来的致病微生物，通过基因改造去掉也可以是本来的致病微生物，通过基因改造去掉毒性基因后仍保持免疫原性。毒性基因后仍保持免疫原性。霍乱活体重组疫苗的制作霍乱活体重组疫苗的制作病原菌：霍乱弧菌（病原菌：霍乱弧菌（Vibro cholerae）致病物：肠毒素。致病物：肠毒素。肠毒素的结构：肠毒素的结构：1个个A亚基和亚基和5个相同的个相同的B亚基。亚基。A亚基有亚基有ADP糖基化活性，有两个功能域：糖基化活性，有两个功能域：A1肽肽（毒性区，（毒性区，194aa）、）、A2肽（连接肽（连接A1和和B亚基）。亚基）。亚
32、基疫苗对霍乱菌的感染没有免疫作用。亚基疫苗对霍乱菌的感染没有免疫作用。利用重组利用重组DNA技术破坏技术破坏A1肽的基因序列，使突变的肽的基因序列，使突变的菌株不能产生肠毒素，成为非致病菌，做疫苗。菌株不能产生肠毒素，成为非致病菌，做疫苗。4.细菌疫苗细菌疫苗在非致病菌的细胞表面插入致病菌的表面抗原。在非致病菌的细胞表面插入致病菌的表面抗原。在细菌的鞭毛蛋白的高变区基因中插入霍乱菌素在细菌的鞭毛蛋白的高变区基因中插入霍乱菌素B亚基的亚基的50个氨基酸的个氨基酸的DNA片断。然后把重组片断。然后把重组DNA导入无鞭毛的沙门氏菌株。导入无鞭毛的沙门氏菌株。实验证明转入后的表达产物既有正常的鞭毛功能
33、，实验证明转入后的表达产物既有正常的鞭毛功能，又能激发小鼠产生高水平的针对霍乱菌素的抗体。又能激发小鼠产生高水平的针对霍乱菌素的抗体。5.肿瘤疫苗肿瘤疫苗肿瘤疫苗的应用基础是存在肿瘤特异性抗原，同时免肿瘤疫苗的应用基础是存在肿瘤特异性抗原，同时免疫系统对该抗原能够产生有效的应答。疫系统对该抗原能够产生有效的应答。(1)肿瘤细胞疫苗肿瘤细胞疫苗用肿瘤细胞作为抗原而制备的疫苗（必须事先灭活）。用肿瘤细胞作为抗原而制备的疫苗（必须事先灭活）。（2）基因工程肿瘤疫苗）基因工程肿瘤疫苗将不同的外源基因导入肿瘤细胞后再制成疫苗。将不同的外源基因导入肿瘤细胞后再制成疫苗。机理不十分清楚、效果很差。仍需努力。
34、机理不十分清楚、效果很差。仍需努力。6.DNA疫苗疫苗1993年年Wolff等意外地发现将等意外地发现将DNA直接注射到小鼠直接注射到小鼠骨骼肌细胞后可直接引起特异性免疫反应，而且可骨骼肌细胞后可直接引起特异性免疫反应，而且可以持续以持续2个月以上。个月以上。1994年和年和1995年年WHO和美国科学院分别召开专题和美国科学院分别召开专题会议讨论会议讨论DNA免疫的应用前景。免疫的应用前景。流感病毒的核心流感病毒的核心蛋白抗原（蛋白抗原（NP）表达载体表达载体小鼠骨小鼠骨骼细胞骼细胞流感病毒流感病毒小鼠存活率小鼠存活率提高提高50%！（1）DNA疫苗的构成疫苗的构成DNA疫苗是指含有一种疫苗
35、是指含有一种病原体抗原编码基因病原体抗原编码基因的重的重组组质粒质粒DNA。抗原编码基因抗原编码基因对于不易变异的病原：对于不易变异的病原：选用病原体表面糖蛋白编码基因。选用病原体表面糖蛋白编码基因。对于容易变异的病毒：对于容易变异的病毒：选择各型共有的核心蛋白基因中的保守选择各型共有的核心蛋白基因中的保守DNA序序列。列。i）选用选用ii）抗原编码基因的分离和筛选抗原编码基因的分离和筛选表达文库免疫技术（表达文库免疫技术（ELI）Expression-library immunization)基本原理：基本原理：病原体的病原体的DNA片段片段特定的质粒特定的质粒病原基因文库病原基因文库分别进
36、行分别进行DNA免疫测试免疫测试筛选病原基因组中最具有免筛选病原基因组中最具有免疫激活反应的疫激活反应的DNA片段片段 质粒表达载体质粒表达载体大多数采用大多数采用pUC系列的质粒基本骨架。系列的质粒基本骨架。基本组成元件：基本组成元件：细菌复制起点（细菌复制起点（ColEI ori）。）。细菌抗性基因（细菌抗性基因（Ampr、Kanr）。）。PolyA加尾信号。加尾信号。CpG序列（增强序列（增强DNA免疫活性）。免疫活性）。哺乳动物强启动子（哺乳动物强启动子（CMV、SV40）。）。CMV：cytomegalovirus（巨细胞病毒）。巨细胞病毒）。（2）DNA疫苗的作用机理疫苗的作用机理
37、与重组亚基疫苗类似，都是利用单一的蛋白质抗与重组亚基疫苗类似，都是利用单一的蛋白质抗原分子来诱导免疫反应。原分子来诱导免疫反应。（3）DNA疫苗的优点疫苗的优点既能诱导体液免疫，又能诱导细胞免疫。既能诱导体液免疫，又能诱导细胞免疫。同一个质粒上可以容纳多个抗原基因，有可能获同一个质粒上可以容纳多个抗原基因，有可能获得对多种疾病的免疫能力。得对多种疾病的免疫能力。DNA比蛋白质容易制备和保存。比蛋白质容易制备和保存。（4）DNA疫苗的缺点疫苗的缺点普遍存在免疫效力低的问题。普遍存在免疫效力低的问题。安全性问题（整合位点、后果）安全性问题（整合位点、后果）（5）DNA疫苗的改进疫苗的改进载体的优化
38、载体的优化增强载体的表达能力：增强载体的表达能力：如采用增强子如采用增强子启动子复合物。启动子复合物。提高载体的复制能力：提高载体的复制能力：（DNA疫苗不能自我复制）疫苗不能自我复制）甲病毒（甲病毒（alphavirus）是个负链是个负链RNA病毒，编病毒，编码复制酶（具有自我水解功能）。可以在寄主码复制酶（具有自我水解功能）。可以在寄主细胞内独立复制。有可能利用该病毒作载体细胞内独立复制。有可能利用该病毒作载体（用外源基因替换其结构基因）。（用外源基因替换其结构基因）。用用CpG序列优化载体：序列优化载体：试验表明试验表明适当长度的非甲基化的适当长度的非甲基化的CpG序列序列对提对提高高D
39、NA疫苗的免疫原性具有重要的作用。疫苗的免疫原性具有重要的作用。第四节第四节 人类疾病的基因治疗人类疾病的基因治疗迄今为止，还没有遗传病患者经传统的治疗方法治疗迄今为止，还没有遗传病患者经传统的治疗方法治疗后能过上正常人的生活，他们的后代也同样难逃厄运。后能过上正常人的生活，他们的后代也同样难逃厄运。临床统计：临床统计：25%的生理缺陷、的生理缺陷、30%的儿童死亡、的儿童死亡、60%的成年人的成年人疾病都是由遗传疾病引起的。疾病都是由遗传疾病引起的。一、基因治疗的回顾和现状一、基因治疗的回顾和现状（1）基因治疗的概念）基因治疗的概念向靶组织或细胞中引入外源基因向靶组织或细胞中引入外源基因DN
40、A或或RNA片段，片段，以纠正或补偿基因的缺陷，关闭或抑制异常表达以纠正或补偿基因的缺陷，关闭或抑制异常表达的基因，从而达到治疗的目的。的基因，从而达到治疗的目的。（2）基因治疗的发展）基因治疗的发展1973年一名美国医生在德国给一对姐妹（缺少一种年一名美国医生在德国给一对姐妹（缺少一种稀有的酶）注入肖普氏乳头瘤病毒，结果无效。稀有的酶）注入肖普氏乳头瘤病毒，结果无效。第二例是在第二例是在1980年，美国一名医生对两名地中海贫年，美国一名医生对两名地中海贫血患者进行基因治疗。由于未得到血患者进行基因治疗。由于未得到NIH的批准，受到的批准，受到广泛的抨击。广泛的抨击。后来开始在动物身上进行试验
41、。后来开始在动物身上进行试验。NIH及其下属的重组及其下属的重组DNA顾问委员会经过长期的审顾问委员会经过长期的审查，终于批准了美国第一例临床治疗申请。查，终于批准了美国第一例临床治疗申请。1990年年9月月14日正式开始，由日正式开始，由Genetic therapy公司和公司和NIH。患者：两位患严重综合性免疫缺损症（患者：两位患严重综合性免疫缺损症（SCID）（）（缺缺少腺苷酸脱氨酶（少腺苷酸脱氨酶（ADA）的姑娘。的姑娘。第一位接受基因第一位接受基因治疗的人治疗的人Ashanti DiSilva方案：方案：把克隆的腺苷酸脱氨酶基因转入患者的把克隆的腺苷酸脱氨酶基因转入患者的T淋巴细胞，
42、淋巴细胞，培养后再转入患者体内。培养后再转入患者体内。疗效：疗效：Ashanti DiSilva的的症状有所改善，症状有所改善，25-30%的的T细胞能细胞能维持正常的维持正常的ADA水平，至今生活正常。水平，至今生活正常。但与她同时接受治疗的另一位女孩失败了。但与她同时接受治疗的另一位女孩失败了。1991年年Rosenberg等对等对50名黑色素瘤晚期患者进行基名黑色素瘤晚期患者进行基因治疗，取得一定的效果。因治疗，取得一定的效果。迄今为止，所有的基因治疗方法都是针对体细胞的，迄今为止，所有的基因治疗方法都是针对体细胞的，处于伦理、安全、技术上的考虑，性细胞基因治疗方处于伦理、安全、技术上的
43、考虑，性细胞基因治疗方案尚未被列入研究日程。案尚未被列入研究日程。方案：方案：把外源的肿瘤坏死因子基因转入把外源的肿瘤坏死因子基因转入肿瘤侵润淋巴细胞肿瘤侵润淋巴细胞（TIL），结果这种结果这种TIL能集中在肿瘤所在的部位杀能集中在肿瘤所在的部位杀死肿瘤细胞。死肿瘤细胞。二、体细胞治疗的生物学问题二、体细胞治疗的生物学问题（1）如何选定并获得用来进行基因治疗的细胞。）如何选定并获得用来进行基因治疗的细胞。（2）如何将修正的目的细胞重新引入患者体内。）如何将修正的目的细胞重新引入患者体内。（3）如何控制转入的正常基因的表达。）如何控制转入的正常基因的表达。（4）转基因细胞能否在体内增值。）转基因
44、细胞能否在体内增值。三、基因治疗的方案三、基因治疗的方案1. 体外体外原位（原位（exvivo)基因治疗基因治疗把病人的体细胞取出，在体外加入正常基因校正，把病人的体细胞取出，在体外加入正常基因校正，再把校正的细胞放回病人体内。再把校正的细胞放回病人体内。已批准了已批准了100多个临床方案。多个临床方案。2. 体内（体内（in vivo）基因治疗基因治疗原位：将新基因直接引入病人的疾病部位（病毒原位：将新基因直接引入病人的疾病部位（病毒载体或载体或DNA)。通过血液把治疗性基因带到病组织。通过血液把治疗性基因带到病组织。引入目的基因的引入目的基因的mRNA的反义序列，与目的基因的的反义序列，与
45、目的基因的mRNA相配对，造成供翻译的相配对，造成供翻译的mRNA大量减少，制大量减少，制止病基因的表达。止病基因的表达。也可以引入目的基因的反义也可以引入目的基因的反义DNA。3. 反义（反义（antisense）基因治疗。基因治疗。反义反义RNA的作用的作用反义寡聚反义寡聚RNA与与mRNA形成双链形成双链后，诱使后，诱使RNase H把把mRNA切断切断核酶是一类具有催化活性的核酶是一类具有催化活性的RNA分子。参与细分子。参与细胞内多种胞内多种RNA及其前体的加工和成熟过程。及其前体的加工和成熟过程。4. 核酶（核酶（ribozyme）基因治疗。基因治疗。 发现者发现者Altman和和
46、Cech获获1989年诺贝尔化学奖。年诺贝尔化学奖。1988年，年，Haseloff和和Cerlsch根据核酶根据核酶RNA的的锤头结构设计出第一个具有特异切割活性的锤头结构设计出第一个具有特异切割活性的人造核酶，并在体证实它确实具有特异性的人造核酶，并在体证实它确实具有特异性的切割活性。切割活性。其中利用核酶抗其中利用核酶抗HIV感染的工作尤其感染的工作尤其受到重视。细胞实验表明，核酶确实受到重视。细胞实验表明，核酶确实具有切割具有切割HIV基因组并阻断其复制的基因组并阻断其复制的效果。效果。四、基因治疗用的载体四、基因治疗用的载体1.反转录病毒载体反转录病毒载体主要是病毒。主要是病毒。反转
47、录病毒（反转录病毒（ritrovirus）属于正链属于正链RNA病毒，病毒，显显著的特点是具有著的特点是具有2倍体基因组倍体基因组。两个相同的。两个相同的RNA分子在分子在5端附近经氢键连接形成端附近经氢键连接形成70S RNA，这种这种结构可能在逆转录过程中起调节作用。结构可能在逆转录过程中起调节作用。基因组结构：类似于真核细胞基因组结构：类似于真核细胞mRNA反转录病毒一般只感染处在分裂状态的细胞。反转录病毒一般只感染处在分裂状态的细胞。反转录病毒结构反转录病毒结构流感病毒流感病毒HIV如如如如MoloneyMoloney murinemurine leukemia leukemia vi
48、rus(Moloneyvirus(Moloney MLV) MLV)envpolgagU3U3U5U5cappolyA35LTRLTRU5、U3：5段或段或3端独特序列。端独特序列。LTR：长末端重复序列。在病毒基因组整合中至关长末端重复序列。在病毒基因组整合中至关重要。整合时，整合酶在重要。整合时，整合酶在U5-U3连接处切开双链连接处切开双链DNA，随机插入到宿主基因组里。随机插入到宿主基因组里。LTR本身还具有启动子和本身还具有启动子和polyA加尾信号的功能。加尾信号的功能。RR + +：组装时必需的非编码序列。：组装时必需的非编码序列。env：外壳蛋白。外壳蛋白。pol：反转录酶和整
49、合酶。反转录酶和整合酶。gag：核心蛋白。核心蛋白。（1）反转录病毒载体的优点）反转录病毒载体的优点能稳定地将能稳定地将DNA插入宿主基因组的随机位点上。插入宿主基因组的随机位点上。侵染范围广、感染率高。侵染范围广、感染率高。整合的原病毒在宿主基因中比较稳定，拷贝数目较低。整合的原病毒在宿主基因中比较稳定，拷贝数目较低。包装的外源包装的外源DNA可达可达10kb。反转录病毒感染哺乳动物细胞，对宿主细胞没有毒性。反转录病毒感染哺乳动物细胞，对宿主细胞没有毒性。（2）用于基因治疗的反转录病毒载体构建）用于基因治疗的反转录病毒载体构建 把反转录病毒基因组中的整个把反转录病毒基因组中的整个pol、en
50、v和和gag基因的基因的3端删除。端删除。插入标记基因（如插入标记基因（如neor）。）。外源基因和启动子插入到外源基因和启动子插入到 +下游。下游。5LTR +外源基因外源基因neor3LTR反转录病毒反转录病毒DNA转化细胞的效率很低，必须包装转化细胞的效率很低，必须包装成成病毒颗粒病毒颗粒转染细胞。转染细胞。用两个缺失了用两个缺失了 +的反转录病毒染色体转化细胞，的反转录病毒染色体转化细胞，以制造病毒外壳蛋白。以制造病毒外壳蛋白。（3）包装细胞系的构建）包装细胞系的构建5LTRgag3LTRpolenv3LTR5LTR病毒外壳蛋白病毒外壳蛋白包装细胞包装细胞（4 4）载体）载体）载体）载
51、体RNARNA的包装的包装的包装的包装用载体用载体DNA转化包装细胞系转化包装细胞系转入的载体上带有转入的载体上带有 +，转录成的载体，转录成的载体RNA就会就会被包装细胞中原有的病毒外壳蛋白识别包装成被包装细胞中原有的病毒外壳蛋白识别包装成重组病毒颗粒。重组病毒颗粒。5LTR +外源基因外源基因neor3LTR（5）利用这种重组病毒颗粒，高效转染靶细胞）利用这种重组病毒颗粒，高效转染靶细胞进行基因治疗。进行基因治疗。2. 2.腺病毒（腺病毒（腺病毒（腺病毒（adenovirusadenovirus）载体载体载体载体（1 1）腺病毒的基因组：）腺病毒的基因组：）腺病毒的基因组：）腺病毒的基因组
52、：（2）腺病毒的腺病毒的腺病毒的腺病毒的优点：优点：比较安全，无致病、致癌、致畸作用。比较安全，无致病、致癌、致畸作用。宿主范围广，不仅能感染有分裂能力的细胞，宿主范围广，不仅能感染有分裂能力的细胞，也能感染不能分裂的细胞（如神经细胞）。也能感染不能分裂的细胞（如神经细胞）。线状双链线状双链DNA病毒，基因组中有病毒，基因组中有14个基因。共同个基因。共同特点是都带有倒置的末端重复（特点是都带有倒置的末端重复（ITR），），在病毒在病毒的复制过程中起非常重要的作用。的复制过程中起非常重要的作用。腺病毒的结构腺病毒的结构可以在呼吸道和肠道中繁殖，可以通过口服或可以在呼吸道和肠道中繁殖，可以通过口
53、服或喷雾的方式进行基因治疗。喷雾的方式进行基因治疗。载体中的插入片段可达载体中的插入片段可达7.5kb（有包装容量限制有包装容量限制）。）。腺病毒容易制备、纯化。腺病毒容易制备、纯化。基因组结构和功能了解得清楚。基因组结构和功能了解得清楚。是目前最常用的基因治疗载体之一。是目前最常用的基因治疗载体之一。把腺病毒把腺病毒DNA删除一些非必须区（如删除一些非必须区（如E1或或E3区）区），增加插入能力。，增加插入能力。构建质粒，含有构建质粒，含有E1或或E3区两侧的同源序列。区两侧的同源序列。两侧序列之间插入外源两侧序列之间插入外源基因和选择标记基因。基因和选择标记基因。（3）腺病毒载体的构建）腺
54、病毒载体的构建用同源重组的方法插入外源基因。用同源重组的方法插入外源基因。ITR E1ITRE3把质粒切成线性。把质粒切成线性。质粒与病毒质粒与病毒DNA（缺缺失失E1或或E3）共同转染共同转染细胞，在细胞中发生同细胞，在细胞中发生同源重组，把外源源重组，把外源DNA加加到病毒基因组中。到病毒基因组中。分离重组腺病毒，成为基因治疗的载体。分离重组腺病毒，成为基因治疗的载体。（4 4）重组腺病毒）重组腺病毒）重组腺病毒）重组腺病毒DNADNA在细胞中的生存在细胞中的生存在细胞中的生存在细胞中的生存以游离的附加体形式存在于细胞中，不能整合以游离的附加体形式存在于细胞中，不能整合到细胞基因组中。基因
55、表达时间短。到细胞基因组中。基因表达时间短。E1是腺病毒繁殖的必须区。缺失是腺病毒繁殖的必须区。缺失E1的重组腺的重组腺病毒必须在已经被腺病毒（辅助病毒）感染的细病毒必须在已经被腺病毒（辅助病毒）感染的细胞中繁殖。胞中繁殖。E3区在腺病毒的繁殖过程中不是必需的。缺区在腺病毒的繁殖过程中不是必需的。缺失失E3的重组腺病毒不需要辅助病毒。的重组腺病毒不需要辅助病毒。五、癌症的基因治疗五、癌症的基因治疗国际上已批准的国际上已批准的130多种基因治疗方案中，多种基因治疗方案中，70%是是针对癌症的。针对癌症的。（1）癌症的基因治疗中常用的治疗性基因）癌症的基因治疗中常用的治疗性基因直接杀伤或抑制癌细胞
56、生长的基因：直接杀伤或抑制癌细胞生长的基因：抑癌基因、癌基因的反义序列、编码细胞抑癌基因、癌基因的反义序列、编码细胞程序性死亡的基因等。程序性死亡的基因等。可提高免疫系统能力的基因：可提高免疫系统能力的基因：细胞因子基因等。细胞因子基因等。（2 2）导入抑癌基因的基因治疗）导入抑癌基因的基因治疗）导入抑癌基因的基因治疗）导入抑癌基因的基因治疗多种药物的耐药性基因：多种药物的耐药性基因：主要目的是提高造血细胞及其他细胞对放疗、化疗主要目的是提高造血细胞及其他细胞对放疗、化疗及其他抗癌药物的耐受性。及其他抗癌药物的耐受性。癌症一般是癌症一般是一对抑癌基因一对抑癌基因都发生了失活突变。因都发生了失活
57、突变。因此导入一个抑癌基因能抑制癌细胞的生长甚至使此导入一个抑癌基因能抑制癌细胞的生长甚至使肿瘤细胞逆转。肿瘤细胞逆转。如抑癌基因：如抑癌基因：Rb、P16、P21、P53、Dcc等。等。（3 3）针对癌基因的基因治疗）针对癌基因的基因治疗）针对癌基因的基因治疗）针对癌基因的基因治疗用反义疗法导入癌基因的反义用反义疗法导入癌基因的反义DNA或或RNA，使癌使癌基因产物减少。基因产物减少。如如k-ras的反义基因。的反义基因。（4）用）用“自杀基因自杀基因”（suicide gene）将一种基因转入癌细胞，这种基因编码的蛋白将一种基因转入癌细胞，这种基因编码的蛋白能把无害的药物前体（能把无害的药
58、物前体（prodrug）转变为有毒物转变为有毒物质，从而将癌细胞杀死。质，从而将癌细胞杀死。如胸苷激酶基因（如胸苷激酶基因（tk）原理：原理：基因治疗中使用的基因治疗中使用的tk是底物特异性较差的是底物特异性较差的HSV-1-tk（单纯疱疹单纯疱疹I型）和型）和VZV-tk（水痘带状疱疹）。水痘带状疱疹）。Tk的正常功能：的正常功能：胸苷胸苷dTMPHSV-1-tk还能催化：还能催化：无环鸟苷（无环鸟苷（ACV）9-鸟嘌呤（鸟嘌呤（GCV）磷酸化磷酸化产物产物掺入掺入DNADNA链不链不能延伸能延伸细胞死亡细胞死亡VZV-tk能特异性催化能特异性催化6-甲氧基嘌呤阿拉伯糖核苷甲氧基嘌呤阿拉伯糖
59、核苷（araM）的磷酸化，形成的磷酸化，形成araMP。araMP在细胞在细胞中进一步被其他的酶转化成中进一步被其他的酶转化成araATP。araMaraMPVZV-tkaraATParaATP是是DNA聚合酶的抑制物。聚合酶的抑制物。旁观者效应（旁观者效应（bystander effect）：）：只要有部分肿瘤细胞导入只要有部分肿瘤细胞导入tk，就可杀死全部的肿瘤就可杀死全部的肿瘤细胞。（机理不清）细胞。（机理不清）提高机体的免疫力。对原发肿瘤细胞和转移肿瘤提高机体的免疫力。对原发肿瘤细胞和转移肿瘤细胞作出免疫应答。细胞作出免疫应答。如：如：IL-2、IL-4、IL-6、IL7、TWF、IN
60、F- 、GM-CSF其中使用最广泛的是其中使用最广泛的是IL-2与与LAK细胞联合使用细胞联合使用治疗黑色素瘤和肾癌。治疗黑色素瘤和肾癌。（5）导入细胞因子基因进行基因治疗）导入细胞因子基因进行基因治疗多选用反转录病毒。（多选用反转录病毒。（只转染处在分裂状态的细只转染处在分裂状态的细胞胞）。）。载体：载体：载体：载体：（6）导入）导入MHC I类抗原基因进行基因治疗类抗原基因进行基因治疗肿瘤细胞一般不表达肿瘤细胞一般不表达MHC I类抗原，从而逃避免类抗原，从而逃避免疫系统对他的识别。疫系统对他的识别。导入导入MHC I类抗原基因，提高免疫系统对肿瘤细类抗原基因，提高免疫系统对肿瘤细胞的识别
61、，杀伤肿瘤细胞。胞的识别，杀伤肿瘤细胞。（7）导入）导入MDR1基因进行基因治疗基因进行基因治疗MDR1编码一种称为编码一种称为P-糖蛋白的穿膜蛋白，它可糖蛋白的穿膜蛋白，它可以将对正常细胞有毒的药物泵出细胞外，保护正以将对正常细胞有毒的药物泵出细胞外，保护正常细胞免受药物杀伤。常细胞免受药物杀伤。如导入骨髓前体细胞或造血干细胞。如导入骨髓前体细胞或造血干细胞。尾声：基因工程技术的社会伦理问题尾声：基因工程技术的社会伦理问题一、基因技术的特点：在基因水平上进行操作。一、基因技术的特点：在基因水平上进行操作。二、后果：没有人能预测。二、后果：没有人能预测。三、基因工程的技术问题：三、基因工程的技
62、术问题：1.外源基因引入生物体（特别是人体）后：外源基因引入生物体（特别是人体）后：是否会破坏调节细胞生长的重要基因是否会破坏调节细胞生长的重要基因2. 基因工程是否会导致极难控制的新型生物出现。基因工程是否会导致极难控制的新型生物出现。四、基因工程的伦理问题四、基因工程的伦理问题1. 宗教界人士的强烈反对宗教界人士的强烈反对否定上帝创造万物、甚至能人造生物。否定上帝创造万物、甚至能人造生物。2. 动物保护组织的强大压力动物保护组织的强大压力用动物作为模型进行各种基因操作是对所有生用动物作为模型进行各种基因操作是对所有生物生存权的极大损害。物生存权的极大损害。3. 素食主义者素食主义者转基因植
63、物使他们非自愿地摄入动物蛋白。侵犯转基因植物使他们非自愿地摄入动物蛋白。侵犯了他们的基本人权。了他们的基本人权。上帝已经创造了物种，而且很完善了，为什么上帝已经创造了物种，而且很完善了，为什么还要改变？还要改变？ 五、基因技术的社会问题五、基因技术的社会问题基因是否有好坏之分；基因是否有好坏之分；人种是否有优劣之分。人种是否有优劣之分。1996年从白种人的基因组中分离到一种抗年从白种人的基因组中分离到一种抗HIV感染感染的蛋白编码序列（迄今尚未在其他人种中找到）。的蛋白编码序列（迄今尚未在其他人种中找到）。给一些狂人提供了新的种族歧视借口。给一些狂人提供了新的种族歧视借口。六、生殖细胞的基因操作问题六、生殖细胞的基因操作问题后果后果“不堪设想不堪设想”科学技术是一把双刃剑，它可以造福于人科学技术是一把双刃剑，它可以造福于人类，也可以给人类带来灾难类，也可以给人类带来灾难 ！
