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1、1987年,日本大阪大学(OsakaUniversity)在对一种细菌编码的碱性磷酸酶基因进行研究时,发现在这个基因编码区域的附近存在一小段不同寻常的DNA片段,但一直不清楚功能。后来的研究发现,这种重复序列广泛存在于细菌和古细菌中。2002年才正式命名为成簇的规律(gul)间隔性短回文重复序列CRISPR(Clusteredregulatoryinterspacedshortpalindromicrepeats).2013年之后,研究者们在science和nature等国际(guj)著名杂志上发表多篇文章介绍CRISPR/Cas9系统,并且已成功在人类、小鼠、斑马鱼等物种上实现精准的基因修饰
2、。系统(xtng)概述第1页/共24页第一页,共25页。已测序的接近90%的古细菌和40%的细菌的基因组或是质粒中至少(zhsho)存在CRISPR基因座。根据Cas基因核心元件序列的不用,CRISPR/Cas免疫体统分为3中类型:型、型和型。型和型CRISPR/Cas免疫系统需要多个Cas蛋白形成复合体切割DNA双链,而型CRISPR/Cas9免疫系统只需要一个Cas9蛋白来切割DNA双链,目前型系统是被改造(gizo)的最成功的人工核酸内切酶。系统(xtng)概述的分布与分类:第2页/共24页第二页,共25页。CRISPR/Cas系统(xtng)是很多细菌和大部分古细菌的天然免疫系统(xt
3、ng),通过对入侵的病毒和核酸进行特异性的识别,利用Cas蛋白进行切割,从而达到对自身的免疫。系统(xtng)获得:系统(xtng)概述第3页/共24页第三页,共25页。系统结构主要(zhyo)由两部分组成:第4页/共24页第四页,共25页。结构(jigu):CRISPR是一种特殊的DNA重复序列家族,广泛分布于细菌和古细菌基因(jyn)组中。CRISPR位点通常由短的高度保守的重复序列(repeats)组成,重复序列的长度通常为21-48bp,重复序列之间被26-72bp间隔序列(spacer)隔开。CIRSPR通过这些间隔序列(spacer)与靶基因(jyn)进行识别。系统结构第5页/共2
4、4页第五页,共25页。家族(jiz):Cas(CRISPRassociated)存在于CRISPR位点附近,是一种双链DNA核酸酶,能在guideRNA引导下对靶位点进行切割。它与fokI酶功能类似,但是(dnsh)它并不需要形成二聚体才能发挥作用。系统结构第6页/共24页第六页,共25页。uCRISPR基因座的表达(biod)(包括转录和转录后的成熟加工)u当该噬菌体再次入侵细菌时,CRISPR簇首先转录为长的crRNA前体,然后逐步(zhb)加工成小的成熟的crRNA.uCRISPR/Cas系统(xtng)活性的发挥或外源遗传物质的干扰ucrRNA结合相关的Cas蛋白后,形成crRNA-C
5、as蛋白复合体,通过碱基互补配对精确地与目标DNA相结合,随后Cas蛋白对目标DNA进行断裂和降解。系统作用机制第7页/共24页第七页,共25页。系统(xtng)Type 因其简单性及可操作性,被改造(gizo)成有力的基因工程工具-CRISPR/Cas9。现在广泛使用的CRISPR/Cas9系统来源于酿脓链球菌。TypeII系统具有以下(yxi)特点:u在CRISPR/Cas基因座上游会表达tracrRNA;utracrRNA会参与crRNA的加工,这个工程亦需要RNaseIII的参与;utracrRNA会与crRNA形成二聚体指导Cas对双链DNA的切割。第8页/共24页第八页,共25页。
6、Cas9是一种核酸内切酶,其具有(jyu):RuvC和HNH两个内切酶活性中心Jinek等发现Cas9在细菌和试管里对双链DNA具有强烈(qinli)的切割能力,但是这种切割能力需要的crRNA和tracrRNA介导。系统(xtng)第9页/共24页第九页,共25页。Jinek等创造性的把crRNA和部分tracrRNA融合成一条嵌合的RNA链,使其同时具有crRNA和tracrRNA的特性,随后的切割实验表明(biomng),这条嵌合的RNA同样可以引导Cas9切割目标DNA。现在普遍使用的都是crRNA和全长tracrRNA融合体,简称sgRNA(singleguideRNA)系统(xtn
7、g)第10页/共24页第十页,共25页。系统(xtng)酿脓链球菌第11页/共24页第十一页,共25页。系统(xtng)第12页/共24页第十二页,共25页。系统(xtng)gRNA在线设计(shj)工具:第13页/共24页第十三页,共25页。系统(xtng)第14页/共24页第十四页,共25页。u基因(jyn)敲除或者敲入;u基因(jyn)修复;u基因(jyn)调控;u文库筛选。系统CRISPR/Cas作用:第15页/共24页第十五页,共25页。脱靶(tub)效应u2013年,研究者们发表多篇文章介绍CRISPR/Cas9系统,但CRISPR/Cas9目前仍存在一个很严重(ynzhng)且无
8、法避免的问题,即潜在的脱靶效应不可消除。uCRISPR/Cas9与靶位点识别的特异性主要(zhyo)依赖于gRNA与靠近PAM处10-12bp碱基的配对,而其余远离PAM处8-10bp碱基的错配对靶位点的识别影响不大。uCas9蛋白不具特异性第16页/共24页第十六页,共25页。沈彬,20156.降低(jingd)脱靶效应Cas9切口(qiku)酶通过点突变的方法(fngf),使Cas9只有单链切割活性,类似于切口酶第17页/共24页第十七页,共25页。YuHisanoet al.20146.降低(jingd)脱靶效应添加(tinji)同源臂(homologyarm,HR)第18页/共24页第
9、十八页,共25页。NicolasWyvekenset al.2015FoKI-dCas96.降低(jingd)脱靶效应第19页/共24页第十九页,共25页。FengZhanget al.20156.降低(jingd)脱靶效应CRISPR/Cpf1系统(xtng)Cpf1系统更简单一些,它只需要一条RNA。Cpf1酶也比标准SpCas9要小,使得它更易于(yy)传送至细胞和组织内。Cpf1以一种不同于Cas9的方式切割DNA。Cas9切割留下“平端”(bluntends)。Cpf1复合物生成的两条链切口是偏移的,在裸露端留下了短悬端(overhang)。这预计有助于精确插入。Cpf1切口远离识别
10、位点。Cpf1IsaSingleRNA-GuidedEndonucleaseofaClass2CRISPR-CasSystem第20页/共24页第二十页,共25页。7.视频:基因(jyn)编辑CRISPR-Cas9原理第21页/共24页第二十一页,共25页。thank you第22页/共24页第二十二页,共25页。知识知识(zh shi)(zh shi)回回顾顾Knowledge Knowledge ReviewReview祝您成功(chnggng)!第23页/共24页第二十三页,共25页。感谢您的观看(gunkn)!第24页/共24页第二十四页,共25页。内容(nirng)总结1987年,日本大阪大学(Osaka University) 在对一种细菌编码的碱性磷酸酶基因进行研究时,发现在这个基因编码区域的附近存在一小段不同寻常的DNA片段,但一直不清楚功能。2013年之后,研究者们在science 和nature等国际著名杂志上发表多篇文章介绍(jisho)CRISPR/Cas9系统,并且已成功在人类、小鼠、斑马鱼等物种上实现精准的基因修饰。第23页/共24页。感谢您的观看第二十五页,共25页。