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1、实时荧光定量实时荧光定量PCR仪使用仪使用1；.PCR原理原理:PCR（聚合（聚合酶链式反式反应）: 是一种用于放大扩增特定的是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，片段的分子生物学技术， 它可看作是生物体它可看作是生物体外的特殊外的特殊DNA复制，复制，PCR的最大特点，是能将微量的的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。基于聚大幅增加。基于聚合酶制造的合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。度之间很好地进行控制。实时定量定量PCR技技术：利用利用荧光信号的光信号的变化化实时
2、检测PCR扩增反增反应中每一个循中每一个循环扩增增产物量的物量的变化，化，通通过Ct值和和标准曲准曲线的关系的关系对起始模板起始模板进行定量分析行定量分析2；.PCR工作过程：3；.PCR仪器器BIO-RAD CFX96 ABI7500 QuantStudio3 line96204；.定量定量标准曲准曲线（Quantitation-Standard Curve)相相对定量定量标准曲准曲线（Quantitation-Relative Standard Curve )定量定量CT比比较法（法（Quantitation-Comparative Ct Ct）溶解曲溶解曲线（Melt Curve )基因
3、分型（基因分型（Genotyping）定性定性实验（Presence/Absence)实验类实验类型型: :5；.绝对定量定量&相相对定量：定量： 绝对定量的目的是测定目的基因在样本中的分子数目,即通常所说的拷贝数.相对定量的目的是测定目的基因在两个或多个样本中的含量的相对比例,而不需要知道它们在每个样本中的拷贝数. 绝对定量实验必须使用已知拷贝数的绝对标准品,必须做标准曲线.相对定量可以做标准曲线,也可以不做标准曲线. 6；. AB7500AB7500绝对绝对定量定量定量定量1、双击桌面图标、双击桌面图标 ，或从，或从 Start All Programs Applied Biosystem
4、s 7500 Software 7500 V2.0 开启软件。进入主界面后选择开启软件。进入主界面后选择 Advanced Setup 。2. 默认进入默认进入 Setup 下的下的 Experiment Properties 界面界面 2.1 输入实验名称输入实验名称 （ Experiment Name）7；. 2.2 确确认仪器型号器型号 2.3 在在实验类型中，型中，选择 Quantitation-Standard Curve2.4 选择试剂种种类2.5 确确认运行模式运行模式8；.TaqMan探探针法法（寡核苷酸探针）： 5端端荧光光报告基告基团与靶基因特异性与靶基因特异性结合的序列合
5、的序列3端端淬淬灭基基团完整的探完整的探针：检测不到不到报告告荧光光切断的探切断的探针：检测到到报告告荧光光5-3外切外切酶活性将探活性将探针酶切降解切降解 水解探水解探针，使，使报告基告基团和淬和淬灭基基团分离分离淬淬灭基基团报告告基基团9；.3. 进入入 Setup 下的下的 Plate Setup 界面，界面，编辑基因（基因（ Target）及）及样本（本（ Sample）10；.3.1在在 界面中界面中设置基因及置基因及样品，品， 添加新的基因，添加新的基因，并在并在Target name编辑基因名称，基因名称，Reporter和和Quencher中中选择所所标记的的荧光基光基团及淬及
6、淬灭基基团； 利用利用 添加新的添加新的样本，并本，并编辑样品名称。品名称。11；.3.2在在 界面中界面中进行行样品板的排布分配品板的排布分配 S :标准曲准曲线数据点，数据点， U :未知未知样本，本， N :阴性阴性对照照 勾勾选基因基因 勾勾选样本名称本名称3.3 设置置标准曲准曲线：利用鼠：利用鼠标单选或拖曳以或拖曳以选择反反应孔（一般情况下，每个孔（一般情况下，每个 梯度梯度设置三个副孔），而后勾置三个副孔），而后勾选左左侧的基因，在的基因，在Task选项中中选择S， 在在Quantity中中输入拷入拷贝数。按照相同操作，完成数。按照相同操作，完成标准曲准曲线其他数据点的其他数据点
7、的设 置（建置（建议5个梯度）。个梯度）。12；.标标准曲准曲准曲准曲线线: :标标准品准品准品准品 目的：生成目的：生成标准曲准曲线，建立，建立Ct值与与浓度之度之间的的线性关系性关系标准曲准曲线的制的制备:至少至少5个点的个点的10倍倍标准曲准曲线 10倍倍连续梯度稀梯度稀释方法：方法：1v原液原液(标准品准品i) +9v稀稀释缓冲液，得冲液，得标准品准品ii1v标准品准品ii+9v稀稀释缓冲液，得冲液，得标准品准品iii1v标准品准品iii +9v稀稀释缓冲液，得冲液，得标准品准品iv1v 标准品准品iv +9v稀稀释缓冲液，得冲液，得标准品准品v 不可由不可由标准品准品i分分别加不同体
8、加不同体积的稀的稀释缓冲液直接得到冲液直接得到标准品准品ii、 iii、 iv、 v13；.4. 在在 Setup 下的下的 Run Method 界面中，界面中，设定反定反应条件。条件。14；.5、点、点击 文件文件储存成存成 Experiment Document Single Files（ *.eds）格式，格式， 然后在然后在 按下按下 按按钮，反，反应即开始即开始进行。行。15；.6、实验结束后，点束后，点击界面右上角的界面右上角的 Analyze 按按钮，软件将会件将会显示示实验结果：果：16；.7、查看看标准曲准曲线时，可通，可通过更改更改Plot Settings来改来改变标准
9、曲准曲线的的显示方式。示方式。 Eff%代表代表扩增效率增效率(Eff% ：90%110%）。）。 R2值代表代表标准曲准曲线的数据点与回的数据点与回归曲曲线的接近程度，的接近程度， 0.9917；.8、对于于 SYBR Green 法法实验，可以在，可以在 Melt Curve 界面中界面中查看熔解曲看熔解曲线。18；.9、检测 QC Summary 结果，可以快速果，可以快速查看看实验中是否有反中是否有反应孔存在异常情孔存在异常情 况。况。黄色三角形中的数字黄色三角形中的数字 1 代表有一种异常情况，代表有一种异常情况，2 代表有两种异常情况，代表有两种异常情况， 以次以次类推。推。详细信
10、息及解决方案可以在信息及解决方案可以在 Flag Details查看。看。19；.10、分析之后的、分析之后的结果，可以利用菜果，可以利用菜单中的中的 功能，功能，导出出 Excel 格式的格式的结果。或果。或者者视图板布局板布局选中所需孔位右中所需孔位右击Copy，粘，粘贴。20；.若想存若想存储图片片结果，可直接在果，可直接在图片上片上单击鼠鼠标右右键，选择 Save as，存成，存成 JPEG 格式的格式的图片。片。21；.数据分析数据分析数据分析数据分析: : 四个四个阶段段 对对数数数数图图 线线形形形形图图22；.基基线、阈值线、 Ct值23；.自自动设置基置基线： 每个每个样品都
11、品都设置独立的基置独立的基线，如果背景信号，如果背景信号过高，高，软件可能会将背景信号件可能会将背景信号误认为扩增信号，增信号，这时，基，基线的范的范围会被会被设置的很小，因此自置的很小，因此自动设置基置基线失失败，需要，需要手手动设置基置基线。 点点击 选择基基线设置不正确的反置不正确的反应孔，取消孔，取消“Auto Threshold” 和和“Auto Baseline”选项基基线一般一般为3-15个循个循环24；.手手动设定定阈值： 点点击 选择基基线设置不正确的基因，取消置不正确的基因，取消AutoThreshold点点击25；.日常日常日常日常实验实验中的注意事中的注意事中的注意事中的注意事项项实验室分区：室分区：样品品处理区、定量理区、定量PCR反反应制制备区、区、扩增区增区移液器使用移液器使用带滤芯的芯的枪头先加阴性先加阴性对照，后加照，后加样品，再由低品，再由低浓度到高度到高浓度度标准品，最后加阳性准品，最后加阳性对照照反反应后的后的PCR管管应当直接当直接废弃，切不可在弃，切不可在实验区域内开启区域内开启PCR管管/ 8联管管/板上不可用板上不可用记号笔号笔标记PCR管管/ 8联管管/板使用光学平盖或光学膜，不要裸手触摸盖或膜表面板使用光学平盖或光学膜，不要裸手触摸盖或膜表面PCR管或管或8联管要管要对称放置称放置26；. 谢谢！27；.
