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1、7/24/20241利用染色体的复制元件来驱动外源利用染色体的复制元件来驱动外源利用染色体的复制元件来驱动外源利用染色体的复制元件来驱动外源DNADNA片段复片段复片段复片段复制的载体称为制的载体称为制的载体称为制的载体称为人工染色体载体人工染色体载体。人工染色体载体人工染色体载体:模拟染色体的复制方式，因此都能装载大片模拟染色体的复制方式，因此都能装载大片模拟染色体的复制方式，因此都能装载大片模拟染色体的复制方式，因此都能装载大片段的段的段的段的DNADNA片段。片段。片段。片段。7/24/20242vvv目前常用的人造染色体载体包括：目前常用的人造染色体载体包括：目前常用的人造染色体载体包
2、括：目前常用的人造染色体载体包括： 细菌人工染色体载体（细菌人工染色体载体（细菌人工染色体载体（细菌人工染色体载体（BACBAC）酵母人工染色体载体（酵母人工染色体载体（酵母人工染色体载体（酵母人工染色体载体（YACYAC）黏粒载体（黏粒载体（黏粒载体（黏粒载体（ cosmid ）P1P1人工染色体载体（人工染色体载体（人工染色体载体（人工染色体载体（PACPAC）7/24/20243pHC79pHC796400 6400 bpbpTcTcr rl l l l fragmentfragmentcoscosorioriApApr rPstIPstIBamHIBamHISalISalIvv1978
3、1978年年年年J.Collins和和B.Hohn等人等人发明发明发明发明构建构建构建构建1.8 kb1.8 kb的的的的l l l l- -DNADNA片段片段片段片段 + pBR322+ pBR322片段装载范围为片段装载范围为片段装载范围为片段装载范围为31 - 31 - 45 kb45 kb。第一节第一节 黏粒黏粒（cosmidcosmid）载体载体7/24/20244第一节第一节 黏粒黏粒（cosmidcosmid）载体载体黏粒克隆载体黏粒克隆载体黏粒克隆载体黏粒克隆载体（柯斯质粒载体柯斯质粒载体柯斯质粒载体柯斯质粒载体）实际上是质粒的衍实际上是质粒的衍实际上是质粒的衍实际上是质粒的
4、衍生物，是由英文生物，是由英文生物，是由英文生物，是由英文“ “ coscos site-carrying site-carrying plasmid”plasmid”缩写而成缩写而成缩写而成缩写而成的，其原意是指的，其原意是指的，其原意是指的，其原意是指带带带带coscos位点的质粒。位点的质粒。位点的质粒。位点的质粒。pHC79pHC796400 6400 bpbpTcTcr rl l l l fragmentfragmentcoscosorioriApApr rPstIPstIBamHIBamHISalISalI7/24/20245考斯质粒考斯质粒考斯质粒考斯质粒（cosmidcosmi
5、d）= = 质粒质粒质粒质粒+ cos+ cos序列。序列。序列。序列。pHC79pHC796400 6400 bpbpTcTcr rl l l l fragmentfragmentcoscosorioriApApr rPstIPstIBamHIBamHISalISalIuu它是用正常的质粒同它是用正常的质粒同它是用正常的质粒同它是用正常的质粒同 噬菌体的噬菌体的噬菌体的噬菌体的coscos位点构成。位点构成。位点构成。位点构成。uu coscos序列是序列是序列是序列是l l l l噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体DNA DNA 中将中将中将中将DNADNA包装到噬包装到噬包装到噬包装到噬菌体颗粒中
6、所需的菌体颗粒中所需的菌体颗粒中所需的菌体颗粒中所需的DNADNA序列。序列。序列。序列。7/24/20246黏粒黏粒黏粒黏粒它的大小一般它的大小一般它的大小一般它的大小一般 5-7kb 5-7kb 左左左左右，用来克隆大片段右，用来克隆大片段右，用来克隆大片段右，用来克隆大片段 DNADNA。克隆的最大克隆的最大克隆的最大克隆的最大 DNA DNA 片段可达片段可达片段可达片段可达45kb45kb。质粒复制起点（质粒复制起点（质粒复制起点（质粒复制起点（colE1colE1） 象象象象质粒一样转化和增殖。质粒一样转化和增殖。质粒一样转化和增殖。质粒一样转化和增殖。抗性标记抗性标记抗性标记抗性
7、标记AmpAmpr r 。 coscos位点。有的粘粒载体含位点。有的粘粒载体含位点。有的粘粒载体含位点。有的粘粒载体含有有有有2 2个个个个coscos位点。位点。位点。位点。pHC79pHC796400 6400 bpbpTcTcr rl l l l fragmentfragmentcoscosorioriApApr rPstIPstIBamHIBamHISalISalI一、黏粒的结构特征和用途一、黏粒的结构特征和用途7/24/20247一、黏粒的结构特征和用途一、黏粒的结构特征和用途vv能像能像能像能像l l l l- - - -DNADNA那样进行体外包装，并高效转染受那样进行体外包装
8、，并高效转染受那样进行体外包装，并高效转染受那样进行体外包装，并高效转染受体细胞；体细胞；体细胞；体细胞； vv能像质粒那样在受体细胞中自主复制；能像质粒那样在受体细胞中自主复制；能像质粒那样在受体细胞中自主复制；能像质粒那样在受体细胞中自主复制；vv重组操作简便，筛选容易；重组操作简便，筛选容易；重组操作简便，筛选容易；重组操作简便，筛选容易；vv装载量大装载量大装载量大装载量大（45 kb45 kb）且克隆片段具有一定的大小且克隆片段具有一定的大小且克隆片段具有一定的大小且克隆片段具有一定的大小范围；范围；范围；范围；vv不能体内包装，不裂解受体细胞。不能体内包装，不裂解受体细胞。不能体内
9、包装，不裂解受体细胞。不能体内包装，不裂解受体细胞。7/24/20248二、二、 构建构建cosmid克隆载体的策略克隆载体的策略根据根据根据根据 噬菌体克隆载体和质粒克隆载体两者的噬菌体克隆载体和质粒克隆载体两者的噬菌体克隆载体和质粒克隆载体两者的噬菌体克隆载体和质粒克隆载体两者的这些性质，取长去短，设计由这些性质，取长去短，设计由这些性质，取长去短，设计由这些性质，取长去短，设计由质粒质粒质粒质粒和含有和含有和含有和含有coscos位点位点位点位点的这种的这种的这种的这种DNADNA片段组装成一类新的克隆载体，即片段组装成一类新的克隆载体，即片段组装成一类新的克隆载体，即片段组装成一类新的
10、克隆载体，即cosmidcosmid克隆载体克隆载体克隆载体克隆载体。7/24/20249由由由由DNADNA片段和片段和片段和片段和pBR322pBR322质粒质粒质粒质粒DNADNA联合组成的。联合组成的。联合组成的。联合组成的。c co os smmi id d载载载载体体体体 - - - - - pHC797/24/202410pBR322质粒质粒(p43)7/24/202411用用用用 噬菌体基因组的噬菌体基因组的噬菌体基因组的噬菌体基因组的crocrorr的的的的BglBgl限制片限制片限制片限制片段，取代段，取代段，取代段，取代pBR322pBR322质粒质粒质粒质粒DNADNA
11、的位于的位于的位于的位于1 4591 4591 1 666bp666bp之间的之间的之间的之间的Sau3ASau3A片段，产生出具有片段，产生出具有片段，产生出具有片段，产生出具有BglBgl单单单单切割位点切割位点切割位点切割位点的重组体分子。的重组体分子。的重组体分子。的重组体分子。然后通过然后通过然后通过然后通过这个位点这个位点这个位点这个位点，将带有，将带有，将带有，将带有coscos序列序列序列序列、长度、长度、长度、长度为为为为1.78kb1.78kb的的的的DNADNA之之之之BglBgl片段片段片段片段插入进去，于是得插入进去，于是得插入进去，于是得插入进去，于是得到了到了到了
12、到了pHC79pHC79柯斯质粒柯斯质粒柯斯质粒柯斯质粒. .7/24/202412DNADNA片段除了片段除了片段除了片段除了coscos位点之外，在其两侧还位点之外，在其两侧还位点之外，在其两侧还位点之外，在其两侧还具有与噬菌体包装有关具有与噬菌体包装有关具有与噬菌体包装有关具有与噬菌体包装有关的的的的DNADNA短序列；短序列；短序列；短序列；质粒质粒质粒质粒DNADNA部部部部分则是一个完整的分则是一个完整的分则是一个完整的分则是一个完整的复制子。复制子。复制子。复制子。克隆能力为克隆能力为克隆能力为克隆能力为313145kb45kb，而且能够被包，而且能够被包，而且能够被包，而且能够
13、被包装成为具有感染性能装成为具有感染性能装成为具有感染性能装成为具有感染性能的噬菌体颗粒。的噬菌体颗粒。的噬菌体颗粒。的噬菌体颗粒。7/24/202413三、三、 cosmid克隆载体的特征克隆载体的特征构建的构建的构建的构建的cosmidcosmid克隆载体是一种环形双链克隆载体是一种环形双链克隆载体是一种环形双链克隆载体是一种环形双链DNADNA分子，分子，分子，分子，般在般在般在般在5-7kb5-7kb。 cosmidcosmid克隆载体具有质粒的性质。克隆载体具有质粒的性质。克隆载体具有质粒的性质。克隆载体具有质粒的性质。包括以下包括以下包括以下包括以下4 4个方面个方面个方面个方面7
14、/24/202414cosmidcosmid克隆载体具有质粒的复制子，在大肠克隆载体具有质粒的复制子，在大肠克隆载体具有质粒的复制子，在大肠克隆载体具有质粒的复制子，在大肠杆菌细胞内按质粒复制的方式进行复制，具有转杆菌细胞内按质粒复制的方式进行复制，具有转杆菌细胞内按质粒复制的方式进行复制，具有转杆菌细胞内按质粒复制的方式进行复制，具有转化大肠杆菌的功能，并且在氨苄青霉素作用下，化大肠杆菌的功能，并且在氨苄青霉素作用下，化大肠杆菌的功能，并且在氨苄青霉素作用下，化大肠杆菌的功能，并且在氨苄青霉素作用下，同样也会获得扩增。同样也会获得扩增。同样也会获得扩增。同样也会获得扩增。cosmidcosm
15、id克隆载体通常也具抗菌素抗性基因，克隆载体通常也具抗菌素抗性基因，克隆载体通常也具抗菌素抗性基因，克隆载体通常也具抗菌素抗性基因，作为重组体分子表型选择标记。其中有一些还带作为重组体分子表型选择标记。其中有一些还带作为重组体分子表型选择标记。其中有一些还带作为重组体分子表型选择标记。其中有一些还带上基因插入失活的克隆位点。上基因插入失活的克隆位点。上基因插入失活的克隆位点。上基因插入失活的克隆位点。7/24/202415具有具有具有具有 噬菌体的特性。在此克隆载体上含有一噬菌体的特性。在此克隆载体上含有一噬菌体的特性。在此克隆载体上含有一噬菌体的特性。在此克隆载体上含有一个个个个coscos
16、位点。位点。位点。位点。 cosmidcosmid克隆载体在克隆了合适长度的外源克隆载体在克隆了合适长度的外源克隆载体在克隆了合适长度的外源克隆载体在克隆了合适长度的外源DNADNA，并在体外包装成噬菌体颗粒之后，可以，并在体外包装成噬菌体颗粒之后，可以，并在体外包装成噬菌体颗粒之后，可以，并在体外包装成噬菌体颗粒之后，可以高效地转导对高效地转导对高效地转导对高效地转导对 噬菌体敏感的大肠杆菌寄主细胞。噬菌体敏感的大肠杆菌寄主细胞。噬菌体敏感的大肠杆菌寄主细胞。噬菌体敏感的大肠杆菌寄主细胞。7/24/202416进入寄主细胞之后的进入寄主细胞之后的进入寄主细胞之后的进入寄主细胞之后的cosmi
17、dcosmid克隆载体克隆载体克隆载体克隆载体DNADNA分子，便按照分子，便按照分子，便按照分子，便按照 噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体DNADNA同样的方式环化起同样的方式环化起同样的方式环化起同样的方式环化起来。来。来。来。但由于但由于但由于但由于cosmidcosmid克隆载体并不含有克隆载体并不含有克隆载体并不含有克隆载体并不含有 噬菌体的全噬菌体的全噬菌体的全噬菌体的全部必要基因，因此它不能通过溶菌周期，无部必要基因，因此它不能通过溶菌周期，无部必要基因，因此它不能通过溶菌周期，无部必要基因，因此它不能通过溶菌周期，无法形成子代噬菌体颗粒。法形成子代噬菌体颗粒。法形成子代噬菌体颗粒。法形
18、成子代噬菌体颗粒。外源片段克隆在黏粒载体中是以大肠杆菌菌外源片段克隆在黏粒载体中是以大肠杆菌菌外源片段克隆在黏粒载体中是以大肠杆菌菌外源片段克隆在黏粒载体中是以大肠杆菌菌落的形式表现出来的，而不是噬菌斑。落的形式表现出来的，而不是噬菌斑。落的形式表现出来的，而不是噬菌斑。落的形式表现出来的，而不是噬菌斑。7/24/202417构建的构建的构建的构建的cosmidcosmid克隆载体较小，因此能承载比较克隆载体较小，因此能承载比较克隆载体较小，因此能承载比较克隆载体较小，因此能承载比较大的外源大的外源大的外源大的外源DNADNA片段。片段。片段。片段。 如果如果如果如果cosmidcosmid克
19、隆载体的大小为克隆载体的大小为克隆载体的大小为克隆载体的大小为6.5 kb6.5 kb，按入噬，按入噬，按入噬，按入噬菌体容许菌体容许菌体容许菌体容许包装包装包装包装的的的的量量量量计算，能承载的外源计算，能承载的外源计算，能承载的外源计算，能承载的外源DNADNA片段片段片段片段最大可达最大可达最大可达最大可达44.5 kb(44.5 kb(即即即即51 kb51 kb6.5 kb)6.5 kb)，最小的也有，最小的也有，最小的也有，最小的也有29.9kb(29.9kb(即即即即36.4kb36.4kb6.5kb6.5kb) )，所以用这样的，所以用这样的，所以用这样的，所以用这样的cosm
20、idcosmid克克克克隆载体能克隆隆载体能克隆隆载体能克隆隆载体能克隆40kb40kb左右的外源左右的外源左右的外源左右的外源DNADNA片段。片段。片段。片段。 7/24/202418四、四、cosmid克隆载体的工作原理克隆载体的工作原理cosmidcosmid克隆载体具有质粒克隆载体的性克隆载体具有质粒克隆载体的性克隆载体具有质粒克隆载体的性克隆载体具有质粒克隆载体的性质，可以按一般质粒克隆载体进行操作，转质，可以按一般质粒克隆载体进行操作，转质，可以按一般质粒克隆载体进行操作，转质，可以按一般质粒克隆载体进行操作，转化受体细胞，可在受体细胞内进行自行复制。化受体细胞，可在受体细胞内进
21、行自行复制。化受体细胞，可在受体细胞内进行自行复制。化受体细胞，可在受体细胞内进行自行复制。 实际上，使用实际上，使用实际上，使用实际上，使用cosmidcosmid克隆载体主要利用它克隆载体主要利用它克隆载体主要利用它克隆载体主要利用它的的的的 噬菌体克隆载体性质噬菌体克隆载体性质噬菌体克隆载体性质噬菌体克隆载体性质。 7/24/202419因为因为因为因为cosmidcosmid克隆载体含有克隆载体含有克隆载体含有克隆载体含有coscos位点，可位点，可位点，可位点，可承载大的承载大的承载大的承载大的DNADNA片段，进行体外包装后能高片段，进行体外包装后能高片段，进行体外包装后能高片段，
22、进行体外包装后能高效率转导受体细胞效率转导受体细胞效率转导受体细胞效率转导受体细胞 。使用使用使用使用cosmidcosmid克隆载体的程序与使用克隆载体的程序与使用克隆载体的程序与使用克隆载体的程序与使用 噬菌噬菌噬菌噬菌体克隆载体的程序有所不同体克隆载体的程序有所不同体克隆载体的程序有所不同体克隆载体的程序有所不同 。7/24/202420作为作为作为作为 噬菌体克隆载体，线形重组噬菌体克隆载体，线形重组噬菌体克隆载体，线形重组噬菌体克隆载体，线形重组DNADNA分分分分子两端必须各有一个子两端必须各有一个子两端必须各有一个子两端必须各有一个coscos末端。而末端。而末端。而末端。而co
23、smidcosmid克隆载克隆载克隆载克隆载体只有一个体只有一个体只有一个体只有一个coscos位点，因此必须先对位点，因此必须先对位点，因此必须先对位点，因此必须先对cosmidcosmid克隆克隆克隆克隆载体进行适当处理，构成具有两个载体进行适当处理，构成具有两个载体进行适当处理，构成具有两个载体进行适当处理，构成具有两个coscos位点的二位点的二位点的二位点的二联体线形联体线形联体线形联体线形DNADNA分子。分子。分子。分子。7/24/202421当外源当外源当外源当外源DNADNA片段组入二联体线形片段组入二联体线形片段组入二联体线形片段组入二联体线形DNADNA分子，分子，分子，
24、分子，并且两个并且两个并且两个并且两个coscos位点之间的位点之间的位点之间的位点之间的DNADNA核苷酸序列达到足核苷酸序列达到足核苷酸序列达到足核苷酸序列达到足够长时，两个够长时，两个够长时，两个够长时，两个coscos位点可被位点可被位点可被位点可被A A蛋白切割，产生具蛋白切割，产生具蛋白切割，产生具蛋白切割，产生具有两个有两个有两个有两个coscos末端的重组末端的重组末端的重组末端的重组DNADNA分子，就能进行有分子，就能进行有分子，就能进行有分子，就能进行有效的体外包装。效的体外包装。效的体外包装。效的体外包装。 7/24/202422使用使用cosmid克隆载体的基本程序是
25、：克隆载体的基本程序是： 先用一种限制性核酸内切酶切割先用一种限制性核酸内切酶切割先用一种限制性核酸内切酶切割先用一种限制性核酸内切酶切割cosmidcosmid克隆载体克隆载体克隆载体克隆载体 具有两个具有两个具有两个具有两个coscos位点的二联体线形位点的二联体线形位点的二联体线形位点的二联体线形DNADNA分子分子分子分子 DNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶 切割二联体线形切割二联体线形切割二联体线形切割二联体线形DNADNA分子和部分切割待克隆的外源分子和部分切割待克隆的外源分子和部分切割待克隆的外源分子和部分切割待克隆的外源DNADNA片段片段片段片段 成为可用于体外包装的样品成
26、为可用于体外包装的样品成为可用于体外包装的样品成为可用于体外包装的样品 DNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶7/24/2024237/24/2024247/24/202425不管是不管是不管是不管是(a)(a)程序还是程序还是程序还是程序还是(b)(b)程序，最后获得的重程序，最后获得的重程序，最后获得的重程序，最后获得的重组线形组线形组线形组线形DNADNA分子必须保留质粒的复制起始位点分子必须保留质粒的复制起始位点分子必须保留质粒的复制起始位点分子必须保留质粒的复制起始位点( (oriori) )和选择标记基因，保证重组的线形
27、和选择标记基因，保证重组的线形和选择标记基因，保证重组的线形和选择标记基因，保证重组的线形DNADNA分子导入受体细胞后，分子导入受体细胞后，分子导入受体细胞后，分子导入受体细胞后，coscos末端自行连接环化，末端自行连接环化，末端自行连接环化，末端自行连接环化，按质粒的性质进行自主复制，并且有效地表达按质粒的性质进行自主复制，并且有效地表达按质粒的性质进行自主复制，并且有效地表达按质粒的性质进行自主复制，并且有效地表达选择标记基因的产物，供筛选阳性克隆子。选择标记基因的产物，供筛选阳性克隆子。选择标记基因的产物，供筛选阳性克隆子。选择标记基因的产物，供筛选阳性克隆子。7/24/202426
28、五、五、 cosmid克隆载体（自学克隆载体（自学P72）vv常用的粘性粒有常用的粘性粒有常用的粘性粒有常用的粘性粒有PHC79PHC79、PJB8PJB8、MUA-3MUA-3和和和和KOSIKOSI等，它们大多具等，它们大多具等，它们大多具等，它们大多具有一种或多种限制性有一种或多种限制性有一种或多种限制性有一种或多种限制性内切酶的单一酶切位点。内切酶的单一酶切位点。内切酶的单一酶切位点。内切酶的单一酶切位点。采用这种大容量采用这种大容量采用这种大容量采用这种大容量载体不仅可减少构建基因组载体不仅可减少构建基因组载体不仅可减少构建基因组载体不仅可减少构建基因组DNADNA文库的重文库的重文
29、库的重文库的重组克隆数目，减少工作量，提高筛选时的组克隆数目，减少工作量，提高筛选时的组克隆数目，减少工作量，提高筛选时的组克隆数目，减少工作量，提高筛选时的阳性检出率，而且极其适合高等真核基因阳性检出率，而且极其适合高等真核基因阳性检出率，而且极其适合高等真核基因阳性检出率，而且极其适合高等真核基因的克隆工作。的克隆工作。的克隆工作。的克隆工作。7/24/202427六、六、 构建构建cosmid文库应注意哪些问题文库应注意哪些问题vv载体分子的自身连接，从而导致效率降低载体分子的自身连接，从而导致效率降低载体分子的自身连接，从而导致效率降低载体分子的自身连接，从而导致效率降低或者失败。或者
30、失败。或者失败。或者失败。 载体自身只相当于可以插入片段的载体自身只相当于可以插入片段的载体自身只相当于可以插入片段的载体自身只相当于可以插入片段的1/101/10左右，左右，左右，左右，因此往往会出现因此往往会出现因此往往会出现因此往往会出现载体同载体自身连接载体同载体自身连接载体同载体自身连接载体同载体自身连接，结果，结果，结果，结果在一个重组分子内可有几个柯斯质粒载体连在一个重组分子内可有几个柯斯质粒载体连在一个重组分子内可有几个柯斯质粒载体连在一个重组分子内可有几个柯斯质粒载体连在一起。但用在一起。但用在一起。但用在一起。但用碱性磷酸酶处理，可阻止载体碱性磷酸酶处理，可阻止载体碱性磷酸
31、酶处理，可阻止载体碱性磷酸酶处理，可阻止载体分子自身连接；分子自身连接；分子自身连接；分子自身连接； 7/24/202428 大小不等的外源片段相互连接后插入同一个载体分子大小不等的外源片段相互连接后插入同一个载体分子大小不等的外源片段相互连接后插入同一个载体分子大小不等的外源片段相互连接后插入同一个载体分子。 结果使在基因组内本来不是相邻的片段错乱地连接成一结果使在基因组内本来不是相邻的片段错乱地连接成一结果使在基因组内本来不是相邻的片段错乱地连接成一结果使在基因组内本来不是相邻的片段错乱地连接成一个片段，会影响实验结果的分析，后来专门选出个片段，会影响实验结果的分析，后来专门选出个片段，会
32、影响实验结果的分析，后来专门选出个片段，会影响实验结果的分析，后来专门选出303045kb45kb的外源的外源的外源的外源DNADNA插入载体插入载体插入载体插入载体DNADNA，此时，此时，此时，此时，每个载体只可能每个载体只可能每个载体只可能每个载体只可能插入一个外源片段插入一个外源片段插入一个外源片段插入一个外源片段，因为如果二，因为如果二，因为如果二，因为如果二个个个个片段，则将超过包装片段，则将超过包装片段，则将超过包装片段，则将超过包装成噬菌体颗粒的限度；成噬菌体颗粒的限度；成噬菌体颗粒的限度；成噬菌体颗粒的限度； 7/24/202429 细菌的菌落体积远大于噬菌斑，因此如用柯细菌
33、的菌落体积远大于噬菌斑，因此如用柯细菌的菌落体积远大于噬菌斑，因此如用柯细菌的菌落体积远大于噬菌斑，因此如用柯斯质粒制备基因文库，则斯质粒制备基因文库，则斯质粒制备基因文库，则斯质粒制备基因文库，则筛选所需的含某一筛选所需的含某一筛选所需的含某一筛选所需的含某一DNADNA片段的菌落很费时间。片段的菌落很费时间。片段的菌落很费时间。片段的菌落很费时间。 现虽建立了高密度菌落筛选法，但由于柯斯现虽建立了高密度菌落筛选法，但由于柯斯现虽建立了高密度菌落筛选法，但由于柯斯现虽建立了高密度菌落筛选法，但由于柯斯质粒制成的基因文库常常不太稳定，质粒制成的基因文库常常不太稳定，质粒制成的基因文库常常不太稳
34、定，质粒制成的基因文库常常不太稳定，插入的大插入的大插入的大插入的大片段外源片段外源片段外源片段外源DNADNA有可能通过同宿主基因组交换而有可能通过同宿主基因组交换而有可能通过同宿主基因组交换而有可能通过同宿主基因组交换而致丢失等，所以最常使用的还是噬菌体载体。致丢失等，所以最常使用的还是噬菌体载体。致丢失等，所以最常使用的还是噬菌体载体。致丢失等，所以最常使用的还是噬菌体载体。7/24/2024307/24/202431pYAC4pYAC4CEN4CEN4EcoRIEcoRIURA3URA3TELTELBamHIBamHITELTELorioriApApr rTRP1TRP1ARS1ARS
35、1酵母人工染色体酵母人工染色体酵母人工染色体酵母人工染色体(yeast (yeast artificial chromosomeartificial chromosome，YAC)YAC)是一类酵母穿梭载体。是一类酵母穿梭载体。是一类酵母穿梭载体。是一类酵母穿梭载体。YACYAC具有具有具有具有自主复制序自主复制序自主复制序自主复制序列列列列、克隆位点克隆位点克隆位点克隆位点以及可在细菌以及可在细菌以及可在细菌以及可在细菌和酵母菌中和酵母菌中和酵母菌中和酵母菌中选择的标记基因选择的标记基因选择的标记基因选择的标记基因。此外，此外，此外，此外，YACYAC还具有酵母菌染还具有酵母菌染还具有酵母菌
36、染还具有酵母菌染色体的一些特点。可以接受色体的一些特点。可以接受色体的一些特点。可以接受色体的一些特点。可以接受100-1000kb100-1000kb的外源的外源的外源的外源DNADNA片段。片段。片段。片段。第二节第二节 酵母人工染色体载体酵母人工染色体载体7/24/202432pYAC4pYAC4CEN4CEN4EcoRIEcoRIURA3URA3TELTELBamHIBamHITELTELorioriApApr rTRP1TRP1ARS1ARS1这种人工染色体克隆载这种人工染色体克隆载这种人工染色体克隆载这种人工染色体克隆载体实际上是一种体实际上是一种体实际上是一种体实际上是一种“ “
37、穿梭穿梭穿梭穿梭” ”克克克克隆载体，含有质粒克隆载体隆载体，含有质粒克隆载体隆载体，含有质粒克隆载体隆载体，含有质粒克隆载体所必备的所必备的所必备的所必备的第一受体第一受体第一受体第一受体( (大肠杆大肠杆大肠杆大肠杆菌菌菌菌) )源源源源质粒复制起始位点质粒复制起始位点质粒复制起始位点质粒复制起始位点( (oriori) )，还含有，还含有，还含有，还含有第二受体第二受体第二受体第二受体( (如如如如酵母菌酵母菌酵母菌酵母菌) )染色体染色体染色体染色体DNADNA着丝点、着丝点、着丝点、着丝点、端粒和复制起始位点端粒和复制起始位点端粒和复制起始位点端粒和复制起始位点的序列，的序列，的序列
38、，的序列，以及合适的以及合适的以及合适的以及合适的选择标记选择标记选择标记选择标记基因。基因。基因。基因。第二节第二节 酵母人工染色体载体酵母人工染色体载体7/24/202433pYACpYAC4 4CEN4CEN4EcoRIEcoRIURA3URA3TELTELBamHIBamHITELTELorioriApApr rTRP1TRP1ARS1ARS1一、一、YAC载体的复制元件和标志基因载体的复制元件和标志基因YACYAC载体应含有下列元件：载体应含有下列元件：载体应含有下列元件：载体应含有下列元件： 酵母染色体的端粒序列酵母染色体的端粒序列酵母染色体的端粒序列酵母染色体的端粒序列 酵母染色
39、体的复制子酵母染色体的复制子酵母染色体的复制子酵母染色体的复制子酵母染色体的着丝粒序列酵母染色体的着丝粒序列酵母染色体的着丝粒序列酵母染色体的着丝粒序列 酵母系统的选择标记酵母系统的选择标记酵母系统的选择标记酵母系统的选择标记大肠杆菌的复制子标记大肠杆菌的复制子标记大肠杆菌的复制子标记大肠杆菌的复制子标记YACYAC载体的装载量为载体的装载量为载体的装载量为载体的装载量为250250 - 400 kb - 400 kb7/24/202434|这样的克隆载体在第一受体细胞内可以按这样的克隆载体在第一受体细胞内可以按这样的克隆载体在第一受体细胞内可以按这样的克隆载体在第一受体细胞内可以按质粒复制形
40、式进行高拷贝复制。质粒复制形式进行高拷贝复制。质粒复制形式进行高拷贝复制。质粒复制形式进行高拷贝复制。|这种克隆载体在体外与目的这种克隆载体在体外与目的这种克隆载体在体外与目的这种克隆载体在体外与目的DNADNA片段重组片段重组片段重组片段重组后，转化第二受体细胞，可在转化的细胞内后，转化第二受体细胞，可在转化的细胞内后，转化第二受体细胞，可在转化的细胞内后，转化第二受体细胞，可在转化的细胞内按染色体按染色体按染色体按染色体DNADNA复制的形式进行复制和传递。复制的形式进行复制和传递。复制的形式进行复制和传递。复制的形式进行复制和传递。7/24/202435筛选第一受体的克隆子，一般采用抗菌
41、素筛选第一受体的克隆子，一般采用抗菌素筛选第一受体的克隆子，一般采用抗菌素筛选第一受体的克隆子，一般采用抗菌素抗性选择标记；抗性选择标记；抗性选择标记；抗性选择标记；筛选第二受体的克隆子，常用与受体互补筛选第二受体的克隆子，常用与受体互补筛选第二受体的克隆子，常用与受体互补筛选第二受体的克隆子，常用与受体互补的营养缺陷型的营养缺陷型的营养缺陷型的营养缺陷型。人工染色体克隆载体的人工染色体克隆载体的人工染色体克隆载体的人工染色体克隆载体的特点特点特点特点：能容纳长达能容纳长达能容纳长达能容纳长达1000 kb1000 kb甚至甚至甚至甚至3000 kb3000 kb的外源的外源的外源的外源DNA
42、DNA片段。片段。片段。片段。7/24/202436人工人工酵母酵母染色体克隆载体的构建染色体克隆载体的构建YAC(YAC(酵母人工染色体酵母人工染色体酵母人工染色体酵母人工染色体) )克隆载体是最早构建克隆载体是最早构建克隆载体是最早构建克隆载体是最早构建成功的人工染色体克隆载体。成功的人工染色体克隆载体。成功的人工染色体克隆载体。成功的人工染色体克隆载体。将酵母染色体将酵母染色体将酵母染色体将酵母染色体DNADNA的端粒的端粒的端粒的端粒(TEL)(TEL)、DNADNA复制复制复制复制起点起点起点起点 (ARS)(ARS)和着丝粒和着丝粒和着丝粒和着丝粒(CEN)(CEN)以及必要的选择
43、标记以及必要的选择标记以及必要的选择标记以及必要的选择标记(HISA4(HISA4和和和和TRPlTRPl) )基因序列克隆到大肠杆菌质粒基因序列克隆到大肠杆菌质粒基因序列克隆到大肠杆菌质粒基因序列克隆到大肠杆菌质粒pBR322pBR322中，构建成中，构建成中，构建成中，构建成YCAYCA克隆载体。克隆载体。克隆载体。克隆载体。7/24/202437pYAC4pYAC4CEN4CEN4EcoRIEcoRIURA3URA3TELTELBamHIBamHITELTELorioriApApr rTRP1TRP1ARS1ARS1二、二、YAC载体的工作原理载体的工作原理EcoRIEcoRIEcoRI
44、EcoRIEcoRIEcoRIEcoRIEcoRIEcoRIBamHIBamHIBamHI连连连连连连接接接接接接转化酵母菌转化酵母菌转化酵母菌转化酵母菌转化酵母菌转化酵母菌重组酵母染色体重组酵母染色体重组酵母染色体重组酵母染色体重组酵母染色体重组酵母染色体7/24/202438此克隆载体的此克隆载体的此克隆载体的此克隆载体的sup4sup4( (抑制基因：抑制赭色抑制基因：抑制赭色抑制基因：抑制赭色抑制基因：抑制赭色表型表型表型表型 ) )基因上，组装了供插入外源基因上，组装了供插入外源基因上，组装了供插入外源基因上，组装了供插入外源DNADNA片段片段片段片段的克隆位。的克隆位。的克隆位。
45、的克隆位。常用的常用的YAC克隆载体有克隆载体有3种：种：pYAC3pYAC3、pYAC4pYAC4和和和和pYAC5pYAC5。差别：差别：差别：差别：在在在在sup4sup4基因上的克隆位点不同，分别是基因上的克隆位点不同，分别是基因上的克隆位点不同，分别是基因上的克隆位点不同，分别是SnaBISnaBI、EcoRIEcoRI和和和和NotINotI。（红色，赤红色）（红色，赤红色）（红色，赤红色）（红色，赤红色）7/24/202439vv主要结构：主要结构：主要结构：主要结构： 两个可在酵母菌中利用的选择基两个可在酵母菌中利用的选择基两个可在酵母菌中利用的选择基两个可在酵母菌中利用的选择
46、基因，因，因，因，URA3URA3和和和和TRP1(TRP1(色氨酸合成基色氨酸合成基色氨酸合成基色氨酸合成基因因因因) )； 酵母菌着丝粒序列酵母菌着丝粒序列酵母菌着丝粒序列酵母菌着丝粒序列 (centromere4,CEN4)(centromere4,CEN4)； 一个自主复制序列一个自主复制序列一个自主复制序列一个自主复制序列(ARS1)(ARS1)； 两个来自嗜热四膜虫两个来自嗜热四膜虫两个来自嗜热四膜虫两个来自嗜热四膜虫 ( (TetrahymennaTetrahymenna thermophilpthermophilp) )的末的末的末的末端重复序列端重复序列端重复序列端重复序列(
47、TEL)(TEL)，以保持重组，以保持重组，以保持重组，以保持重组YACYAC为线状结构；为线状结构；为线状结构；为线状结构；YAC载体载体-pYAC47/24/202440在两个末端序列中间，有在两个末端序列中间，有在两个末端序列中间，有在两个末端序列中间，有一段填充序列一段填充序列一段填充序列一段填充序列(HIS3(HIS3) )，以，以，以，以便便便便pYAC4pYAC4在细菌细胞中稳在细菌细胞中稳在细菌细胞中稳在细菌细胞中稳定扩增；定扩增；定扩增；定扩增；AmpAmp抗性及细菌质粒复制抗性及细菌质粒复制抗性及细菌质粒复制抗性及细菌质粒复制原点；原点；原点；原点；一个一个一个一个EcoE
48、coR R 克隆位点，该克隆位点，该克隆位点，该克隆位点，该位点位于酵母菌位点位于酵母菌位点位于酵母菌位点位于酵母菌Sup4 Sup4 tRNAtRNA基因内。基因内。基因内。基因内。 7/24/202441克隆载体克隆载体克隆载体克隆载体pYAC4pYAC47/24/202442首先用首先用首先用首先用EcoRIEcoRI和和和和BamHIBamHI双酶切割，获得均具双酶切割，获得均具双酶切割，获得均具双酶切割，获得均具BamHIBamHI和和和和EcoRIEcoRI切割末端的两个切割末端的两个切割末端的两个切割末端的两个DNADNA片段片段片段片段( (双臂双臂双臂双臂) )，随后把两端具
49、，随后把两端具，随后把两端具，随后把两端具EcoRIEcoRI切割末端的外源切割末端的外源切割末端的外源切割末端的外源DNADNA与此与此与此与此双臂连接，构成酵母人工染色体。用电激仪把此双臂连接，构成酵母人工染色体。用电激仪把此双臂连接，构成酵母人工染色体。用电激仪把此双臂连接，构成酵母人工染色体。用电激仪把此人工染色体转化酵母受体细胞。人工染色体转化酵母受体细胞。人工染色体转化酵母受体细胞。人工染色体转化酵母受体细胞。在成功构建在成功构建在成功构建在成功构建pYAC4pYAC4克隆载体的基础上，进一克隆载体的基础上，进一克隆载体的基础上，进一克隆载体的基础上，进一步构建了人类人工染色体步构
50、建了人类人工染色体步构建了人类人工染色体步构建了人类人工染色体(HAC)(HAC)克隆载体和哺乳克隆载体和哺乳克隆载体和哺乳克隆载体和哺乳动物人工染色体动物人工染色体动物人工染色体动物人工染色体(MAC)(MAC)克隆载体。克隆载体。克隆载体。克隆载体。pYAC4使用程序：使用程序：7/24/202443vvSup4Sup4基因编码赭色抑制基因编码赭色抑制基因编码赭色抑制基因编码赭色抑制TrpTrp- -tRNAtRNA，抑制赭色，抑制赭色，抑制赭色，抑制赭色表型表型表型表型( (成为白色成为白色成为白色成为白色) )。vv不含外源不含外源不含外源不含外源DNADNA片段的片段的片段的片段的p
51、YAC4pYAC4载体转化酵母菌，载体转化酵母菌，载体转化酵母菌，载体转化酵母菌，转化子的菌落呈白色。转化子的菌落呈白色。转化子的菌落呈白色。转化子的菌落呈白色。vv带有插入的外源带有插入的外源带有插入的外源带有插入的外源DNADNA片段的片段的片段的片段的pYAC4pYAC4重组载体，重组载体，重组载体，重组载体，其其其其Sup4Sup4已经失活，结果转化酵母菌后所产生已经失活，结果转化酵母菌后所产生已经失活，结果转化酵母菌后所产生已经失活，结果转化酵母菌后所产生的转化子形成赭色菌落。的转化子形成赭色菌落。的转化子形成赭色菌落。的转化子形成赭色菌落。选择标记选择标记-Sup47/24/202
52、444vv一般酵母表达载体都以一般酵母表达载体都以一般酵母表达载体都以一般酵母表达载体都以大大大大肠杆菌质粒肠杆菌质粒肠杆菌质粒肠杆菌质粒为基本骨架再为基本骨架再为基本骨架再为基本骨架再加上加上加上加上酵母的自主复制序列，酵母的自主复制序列，酵母的自主复制序列，酵母的自主复制序列，选择标记，外源基因插入选择标记，外源基因插入选择标记，外源基因插入选择标记，外源基因插入位点，启动子和终止子。位点，启动子和终止子。位点，启动子和终止子。位点，启动子和终止子。 vv既能在酵母菌中复制也能既能在酵母菌中复制也能既能在酵母菌中复制也能既能在酵母菌中复制也能在大肠杆菌中复制，所谓在大肠杆菌中复制，所谓在大
53、肠杆菌中复制，所谓在大肠杆菌中复制，所谓酵母菌酵母菌酵母菌酵母菌大肠杆菌穿梭载大肠杆菌穿梭载大肠杆菌穿梭载大肠杆菌穿梭载体。体。体。体。7/24/202445vv启动子和终止子的选择；启动子和终止子的选择；启动子和终止子的选择；启动子和终止子的选择；vv表达盒的稳定性；表达盒的稳定性；表达盒的稳定性；表达盒的稳定性；vv外源蛋白的累积部位；外源蛋白的累积部位；外源蛋白的累积部位；外源蛋白的累积部位；vv产量的提高。产量的提高。产量的提高。产量的提高。理想的酵母表达系统要考虑理想的酵母表达系统要考虑7/24/202447酿酒酵母作表达系统的缺点酿酒酵母作表达系统的缺点vv在在在在YACYAC载体
54、中的插入片段会出现缺失和重排载体中的插入片段会出现缺失和重排载体中的插入片段会出现缺失和重排载体中的插入片段会出现缺失和重排的现象。的现象。的现象。的现象。vv容易形成嵌合体。即在单个容易形成嵌合体。即在单个容易形成嵌合体。即在单个容易形成嵌合体。即在单个YACYAC中的插入片中的插入片中的插入片中的插入片段由段由段由段由2 2个或多个独立的基因片段连接组成的现个或多个独立的基因片段连接组成的现个或多个独立的基因片段连接组成的现个或多个独立的基因片段连接组成的现象。象。象。象。vvYACYAC染色体与宿主细胞的染色体大小相近，染色体与宿主细胞的染色体大小相近，染色体与宿主细胞的染色体大小相近，
55、染色体与宿主细胞的染色体大小相近， YACYAC染色体转入酵母细胞后很难从中分离出染色体转入酵母细胞后很难从中分离出染色体转入酵母细胞后很难从中分离出染色体转入酵母细胞后很难从中分离出来。来。来。来。7/24/202448 细菌人造染色体通细菌人造染色体通细菌人造染色体通细菌人造染色体通常是在大肠杆菌性因常是在大肠杆菌性因常是在大肠杆菌性因常是在大肠杆菌性因子子子子F F质粒的基础上构质粒的基础上构质粒的基础上构质粒的基础上构建的，其装载量范围建的，其装载量范围建的，其装载量范围建的，其装载量范围在在在在50 - 300 kb50 - 300 kb之间。之间。之间。之间。第三节第三节 细菌人工
56、染色体载体细菌人工染色体载体（Bacterial Bacterial Artificial Chromosomes BACArtificial Chromosomes BAC）7/24/202449一、一、BAC载体及其结构载体及其结构 BAC 载体载体载体载体的大小的大小的大小的大小约约约约7.57.5 kbkb，其，其，其，其本质实际本质实际本质实际本质实际上是一个上是一个上是一个上是一个质粒克隆载体质粒克隆载体质粒克隆载体质粒克隆载体。与常规克隆载体的核心与常规克隆载体的核心与常规克隆载体的核心与常规克隆载体的核心区别在于其复制单元的区别在于其复制单元的区别在于其复制单元的区别在于其复制
57、单元的特殊性。特殊性。特殊性。特殊性。 BACBAC复制单复制单复制单复制单元来自元来自元来自元来自F F质粒。质粒。质粒。质粒。7/24/202450一、一、BAC载体及其结构载体及其结构正常细菌人工染色体含正常细菌人工染色体含正常细菌人工染色体含正常细菌人工染色体含有：有：有：有： 严谨型控制的复制区严谨型控制的复制区严谨型控制的复制区严谨型控制的复制区（orioriS S) ) 启动启动启动启动DNADNA复制的由复制的由复制的由复制的由ATPATP驱驱驱驱动的解旋酶（动的解旋酶（动的解旋酶（动的解旋酶（RepRepE E) ) 确保确保确保确保3 3个低拷贝并使质粒精个低拷贝并使质粒精
58、个低拷贝并使质粒精个低拷贝并使质粒精确分配到子代细胞的基因座。确分配到子代细胞的基因座。确分配到子代细胞的基因座。确分配到子代细胞的基因座。 （parAparA、 parBparB 、parCparC) )7/24/202451一、一、BAC载体及其结构载体及其结构标记基因是氯霉素抗性标记基因是氯霉素抗性标记基因是氯霉素抗性标记基因是氯霉素抗性基因（基因（基因（基因（CmCmr r) )可以通过可以通过可以通过可以通过 - -互补原理筛互补原理筛互补原理筛互补原理筛选重组子选重组子选重组子选重组子设计了用于回收克隆设计了用于回收克隆设计了用于回收克隆设计了用于回收克隆DNADNA的的的的Not
59、NotI I酶切位点。酶切位点。酶切位点。酶切位点。用于克隆用于克隆用于克隆用于克隆DNADNA片段体外片段体外片段体外片段体外转录的转录的转录的转录的SP6SP6和和和和T7T7启动子。启动子。启动子。启动子。7/24/202452Structure of a bacterial Structure of a bacterial artificial chromosome artificial chromosome (BAC), used for cloning (BAC), used for cloning large fragments of donor large fragments
60、of donor DNA. DNA. CMCMR R is a selectable is a selectable marker for marker for chloramphenicolchloramphenicol resistance. resistance. oriSoriS, , repErepE, , parAparA, , and and parBparB are F are F genes for replication and genes for replication and regulation of copy regulation of copy number. n
61、umber. cosNcosN is the is the coscos site from site from l l phage. phage. HinHindIIIdIII and and BamBamHIHI are cloning are cloning sites at which foreign sites at which foreign DNA is inserted. The two DNA is inserted. The two promoters are for promoters are for transcribing the inserted transcrib
62、ing the inserted fragment. The fragment. The NotINotI sites sites are used for cutting out are used for cutting out the inserted fragment.the inserted fragment.7/24/202453二、二、BAC载体工作原理载体工作原理 BACBAC载体的工作原理与常规的质粒克载载体的工作原理与常规的质粒克载载体的工作原理与常规的质粒克载载体的工作原理与常规的质粒克载体相似。体相似。体相似。体相似。不同的是：不同的是：uuBACBAC载体装载的是大片段
63、载体装载的是大片段载体装载的是大片段载体装载的是大片段DNADNA，一般在，一般在，一般在，一般在100Kb300Kb 100Kb300Kb 。对对如此大的如此大的如此大的如此大的DNADNA片段一般片段一般片段一般片段一般要通过脉冲凝胶电泳分离。要通过脉冲凝胶电泳分离。要通过脉冲凝胶电泳分离。要通过脉冲凝胶电泳分离。uuBACBAC载体的拷贝数小，制备难度大。载体的拷贝数小，制备难度大。载体的拷贝数小，制备难度大。载体的拷贝数小，制备难度大。7/24/202454二、二、BAC载体工作原理载体工作原理解决方法：解决方法：将将 BAC载体装载作为外源片段克隆载体装载作为外源片段克隆到常规高拷贝
64、质粒克载体上，如到常规高拷贝质粒克载体上，如（pGEM-4Z），从大肠杆菌中以多拷贝），从大肠杆菌中以多拷贝的形式复制，便于载体的制备，使用时的形式复制，便于载体的制备，使用时将高拷贝质粒去掉。将高拷贝质粒去掉。7/24/202455各种类型的各种类型的各种类型的各种类型的pBACspBACs在大肠杆菌受体菌只能在大肠杆菌受体菌只能在大肠杆菌受体菌只能在大肠杆菌受体菌只能维持单一拷贝维持单一拷贝维持单一拷贝维持单一拷贝pBACspBACs主要适用于：主要适用于：主要适用于：主要适用于：克隆大型基因簇（克隆大型基因簇（克隆大型基因簇（克隆大型基因簇（gene clustergene cluste
65、r）结构结构结构结构构建动植物基因文库构建动植物基因文库构建动植物基因文库构建动植物基因文库二、二、BAC载体工作原理载体工作原理7/24/202456BAC载体载体7/24/2024577/24/202458噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体P1P1基本特征：基本特征：基本特征：基本特征：不存在噬菌体不存在噬菌体不存在噬菌体不存在噬菌体DNADNA分子的整合作分子的整合作分子的整合作分子的整合作用体系，而是变成了一种进行独立复用体系，而是变成了一种进行独立复用体系，而是变成了一种进行独立复用体系，而是变成了一种进行独立复制的环形的质粒制的环形的质粒制的环形的质粒制的环形的质粒DNADNA分子。分子。分
66、子。分子。第四节第四节 P1噬菌体载体和噬菌体载体和P1人工染色体人工染色体载体（略）载体（略）7/24/202459PAC载体载体7/24/202460人工染色体克隆载体的应用人工染色体克隆载体的应用1、构建基因组文库、构建基因组文库2、基因治疗、基因治疗3、基因功能鉴定、基因功能鉴定7/24/202461质粒质粒质粒质粒* *受体细胞受体细胞受体细胞受体细胞结构结构结构结构插入片断插入片断插入片断插入片断举例举例举例举例 E.coliE.coli环状环状环状环状 8* 8*p pUCUC18/19 , T-18/19 , T-载体载体载体载体pGEMpGEM- 3z- 3z等等等等 噬菌体
67、噬菌体噬菌体噬菌体E.coliE.coli线状线状线状线状9 - 24kb9 - 24kbEMBLEMBL系列，系列，系列，系列， gtgt系列系列系列系列丝状噬菌体及噬菌粒丝状噬菌体及噬菌粒丝状噬菌体及噬菌粒丝状噬菌体及噬菌粒E.coliE.coli环状环状环状环状 10 kb 10 kbM13mpM13mp系列系列系列系列粘粒载体粘粒载体粘粒载体粘粒载体E.coliE.coli环状环状环状环状35- 45kb35- 45kbpJB8,c2RB, pJB8,c2RB, pcoslEMBLpcoslEMBL, , pWE15/16, pWE15/16, pCVpCV BAC (Bacteria
68、l Artificial BAC (Bacterial Artificial ChroChromomosome)some)E.coliE.coli环状环状环状环状300 kb300 kbPelPel oBACoBAC系列系列系列系列PAC (P1-derived Artificial PAC (P1-derived Artificial chromosome)chromosome)E.coliE.coli环状环状环状环状100 - 2000 kb100 - 2000 kbPCYPAC1PCYPAC1YAC (Yeast Artificial YAC (Yeast Artificial chro
69、mosome )chromosome )酵母细胞酵母细胞酵母细胞酵母细胞线性染色体线性染色体线性染色体线性染色体100 - 2000 kb100 - 2000 kbMAC (Mammalian MAC (Mammalian Artificial Chromosome)Artificial Chromosome)哺乳类细胞哺乳类细胞哺乳类细胞哺乳类细胞线性染色体线性染色体线性染色体线性染色体 1000 kb 1000 kb病毒载体病毒载体病毒载体病毒载体动物细胞动物细胞动物细胞动物细胞环状环状环状环状SV40 SV40 载体，昆虫载体，昆虫载体，昆虫载体，昆虫杆状病毒载体杆状病毒载体杆状病毒载体
70、杆状病毒载体穿梭载体穿梭载体穿梭载体穿梭载体动物细胞动物细胞动物细胞动物细胞和细菌和细菌和细菌和细菌环状环状环状环状pSVK3pSVK3质粒，质粒，质粒，质粒，PBV,PBV,TiTi质粒质粒质粒质粒载体的种类和特征载体的种类和特征7/24/202462质粒质粒质粒质粒 噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体柯斯质粒柯斯质粒柯斯质粒柯斯质粒单链噬菌单链噬菌单链噬菌单链噬菌体体体体克隆克隆克隆克隆DNADNA大片段大片段大片段大片段 * *+ + +- -构建基因组文库构建基因组文库构建基因组文库构建基因组文库- -+ + +- -构建构建构建构建DNADNA文库文库文库文库+ +- - - -常规的亚克隆化
71、常规的亚克隆化常规的亚克隆化常规的亚克隆化+ +- - - -构建新型的构建新型的构建新型的构建新型的DNADNA结构结构结构结构+ +- - - -序列分析序列分析序列分析序列分析+ +- - -+ +单链探针单链探针单链探针单链探针+ +*- - -+ +外源基因在大肠杆菌中的外源基因在大肠杆菌中的外源基因在大肠杆菌中的外源基因在大肠杆菌中的表达表达表达表达+ +- - - -四种常用载体的比较四种常用载体的比较* * 外源外源外源外源DNADNA如超过如超过如超过如超过10kb10kb，则重组质粒的转化率和则重组质粒的转化率和则重组质粒的转化率和则重组质粒的转化率和DNADNA得率都非常低得率都非常低得率都非常低得率都非常低* * 已有个别材料可用于此目的已有个别材料可用于此目的已有个别材料可用于此目的已有个别材料可用于此目的7/24/202463
