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1、十章蛋白质和氨基酸的测定Stillwatersrundeep.流流静静水深水深,人人静静心深心深Wherethereislife,thereishope。有生命必有希望。有生命必有希望蛋白质的组成及特性蛋白质的组成及特性蛋白蛋白质的的组成成: : 蛋蛋白白质由由很很多多的的AAAA单体体以以肽键结合合而而成成的的具具有有一一定定空空间结构构的的含含氮氮有有机机化化合合物物，有有的的含含有有P P、S S、 CuCu、FeFe、I I等等元元素素，分分子子量量高高达达数数万万数数百百万万。含含氮氮是是蛋白质区别于其它有机化合物的主要标志。蛋白质区别于其它有机化合物的主要标志。蛋蛋白白质质系系数数
2、：一一般般而而言言，蛋蛋白白质质含含氮氮量量约约为为16%16%，即即1 1份份氮氮相相当当于于6.256.25份份蛋蛋白白质，此数值（质，此数值（6.256.25）称为蛋白质系数。）称为蛋白质系数。 氨基酸的种氨基酸的种类: :自然界中已自然界中已经发现的氨基酸的氨基酸约有有170170多种，其中多种，其中组成蛋白的氨基酸只有成蛋白的氨基酸只有2222种种（都是（都是 -AA-AA），其中），其中对人而言的必需氨基酸有人而言的必需氨基酸有8 8种（犬的必需氨基酸有种（犬的必需氨基酸有9 9种）。种）。组成蛋白的氨基酸（成蛋白的氨基酸（ -AA-AA）的通式）的通式及及AAAA两性两性电解解质
3、特性：特性：部分食品的蛋白质含量部分食品的蛋白质含量谷类和面食：谷类和面食： （% %）大米（糙米、长粒、生）大米（糙米、长粒、生） 7.97.9大米（白米、长粒、生）大米（白米、长粒、生） 7.17.1小麦粉（整粒）小麦粉（整粒） 13.713.7玉米粉（整粒、黄色）玉米粉（整粒、黄色） 6.96.9玉米淀粉玉米淀粉 0.30.3豆类：豆类：大豆（成熟的种子、生）大豆（成熟的种子、生） 36.536.5豆（腰子状、所有品种）豆（腰子状、所有品种） 23.623.6豆腐（生、普通）豆腐（生、普通） 8.18.1水果和蔬菜：水果和蔬菜：苹果（生、带皮）苹果（生、带皮） 0.20.2芦笋（生）芦笋
4、（生） 2.32.3草莓（生）草莓（生） 0.60.6莴苣（冰、生）莴苣（冰、生） 1.01.0肉、家禽、鱼：肉、家禽、鱼：牛肉（颈肉、烤前腿）牛肉（颈肉、烤前腿） 18.518.5牛肉（腌制、干牛肉）牛肉（腌制、干牛肉） 29.129.1鸡（可供煎炸的鸡胸肉、生）鸡（可供煎炸的鸡胸肉、生） 23.123.1火腿（切片、普通的）火腿（切片、普通的） 17.617.6鸡蛋（生、全蛋）鸡蛋（生、全蛋） 12.512.5鱼（太平洋鳕鱼、生）鱼（太平洋鳕鱼、生） 17.917.9鱼（罐装金枪鱼滴干的固体）鱼（罐装金枪鱼滴干的固体） 26.526.5乳制品：乳制品：牛乳（全脂、液体）牛乳（全脂、液体）
5、3.33.3牛乳（脱脂、干）牛乳（脱脂、干） 36.236.2干酪干酪 24.924.9酸奶（普通的、低脂）酸奶（普通的、低脂） 5.35.3优质蛋白蛋白质（对人人类而言而言）必需氨基酸：必需氨基酸：在在组成蛋白的氨基酸中，在成蛋白的氨基酸中，在人人体内不能合成或合成速度很慢的氨基酸。体内不能合成或合成速度很慢的氨基酸。 人人类而言而言, ,优质蛋白蛋白质的定的定义: :l l蛋白蛋白质中必需氨基酸的含量高中必需氨基酸的含量高, ,且且总体氨基酸的体氨基酸的组成比例接近母乳蛋白成比例接近母乳蛋白氨基酸比例的蛋白氨基酸比例的蛋白质。动物来源和豆类食品是很好的优质蛋白质。动物来源和豆类食品是很好的
6、优质蛋白质。一般而言一般而言：动物性蛋白所含必需氨基酸的种物性蛋白所含必需氨基酸的种类及数量及数量较多多, ,而植物性蛋白而植物性蛋白所含必需氨基酸的种所含必需氨基酸的种类及数量及数量较少。少。若若蛋白蛋白质或某些必需氨基酸供或某些必需氨基酸供给不足不足： l l会会导生物体生生物体生长发育育缓慢，体重减慢，体重减轻，抵抗力下降，容易患病；，抵抗力下降，容易患病；l l男性精液品男性精液品质下降，精子数量减少，性欲降低；下降，精子数量减少，性欲降低；l l女性引起不孕，即使女性引起不孕，即使怀孕，胎儿也常孕，胎儿也常发育不良而育不良而发生死胎或畸胎。生死胎或畸胎。 开发蛋白质的生理效价高的食品
7、及合理配膳等开发蛋白质的生理效价高的食品及合理配膳等 是食品科学从业者的一项重要任务是食品科学从业者的一项重要任务！常用的蛋白质和氨基酸的测定方法常用的蛋白质和氨基酸的测定方法常用的蛋白质和氨基酸的测定方法：常用的蛋白质和氨基酸的测定方法：蛋蛋白白质质含含量量测测定定最最常常用用的的方方法法是是凯凯氏氏定定氮氮法法，准准确确、操操作作较较费费时时，在在国国内内外外应用普遍。应用普遍。双双缩缩脲脲法法、染染料料结结合合法法、酚酚试试剂剂法法等等也也常常用用于于蛋蛋白白质质含含量量测测定定，由由于于方方法法简简便快速，故多用于便快速，故多用于生产单位质量控制分析生产单位质量控制分析。另另外外，国国
8、外外采采用用近近红红外外分分析析仪仪，利利用用波波长长在在0.750.753 3m m范范围围内内的的近近红红外外线线具具有被蛋白质组分吸收及反射的特性，建立了有被蛋白质组分吸收及反射的特性，建立了近红外光谱快速定量方法近红外光谱快速定量方法。在一般的常规检验中多进行在一般的常规检验中多进行氨基酸总量的测定氨基酸总量的测定，通常采用酸碱滴定法来完成。，通常采用酸碱滴定法来完成。本章重点：本章重点：凯氏定氮法的原理及注意事氏定氮法的原理及注意事项，双，双缩脲法、印三法、印三酮法及氨基酸自法及氨基酸自动分析分析仪的的原理及注意事原理及注意事项，动物物实验法法，氨基酸总量的测定，氨基酸总量的测定。
9、第二节第二节 蛋白质的定性测定蛋白质的定性测定考马斯亮蓝法考马斯亮蓝法 (Stain with Coomassie blue)(Stain with Coomassie blue)：考马斯亮蓝法：考马斯亮蓝法灵敏度比灵敏度比氨基黑氨基黑高五倍，尤其适用于高五倍，尤其适用于SDSSDS电泳的微量蛋白质的染电泳的微量蛋白质的染色。在色。在549nm549nm有最大吸收值，蛋白质在有最大吸收值，蛋白质在1 110g10g呈线性关系。可呈线性关系。可以检测出以检测出0.1 ug 0.1 ug 的蛋白质条带的蛋白质条带. . 但但银染法银染法可以检测出可以检测出 2 ng2 ng的的蛋白质条带蛋白质条带
10、. .CoomassieBlueSTAININGPROCEDURES1.ReagentsCoomassieBlueR-250MethanolGlacialaceticacid2.GelStainningsolution,1L1.0gCommassieBlueR-250450mlwater450mlmethanol100mlGlacialaceticacid3.Geldestainingsolution,1L100mlMethanol100mlGlacialaceticacid800mlWater4.StainingProcedure1.Pickupthegelinto(20ml,usually
11、enough)Stainingsolutioninacontainerandagitatefor10minfor0.75mmGeland20minand1.5mmgel.Thestainingsolutioncanbereusedseveraltimes.2.Takethegeloutandrinsethegelwithafewchangesofwaterinanewcontainer3.Add50mldestainingsolution.Strongbandsarevisiableimmediatelyonalightbox,and1hourusuallyisenough.4.Todesta
12、incompletely,changedestainingsolution2-3timesandagitateovernight.5.Scanortakephototorecordtheresult.CoomassieBlueSTAININGPROCEDURES4.银染法银染法(Silverstaining):candetectaslittleas2ngofproteininasinglebandinSDS-PAGEGel.Reagents:SilvernitrateSodilumhydroxide30%ammoniumhydroxidecitricacid38%formaldehydeMet
13、hanolAceticacidStainingprocedure1.Sockgelin50%Methanol-10%aceticacidforatleast1hourwith2-3changesofsockingsolution2.Rinsegelwith3changesofwaterfortotal30minutes.3.silverstainingfor15mins4.Rinsegelwithtwiceindeionizedwater5.Developgelwithdevelopingsolution6.stopdevelopmentbyringsingin1%aceticacid.7。w
14、ashgelinwaterforatleast1hour.2DE2-DE:thetechniquetoseparateproteinsinthefirstdimensionaccordingtotheir isoelectric point, by Isoelectric Focusing(IEF), and in the seconddimension according to their molecular weight, by SDS-PAGE. 2-DEcombinedwithproteinidentificationbasingonmicrosequencing,aminoacidc
15、omposition and Mass spectrometry, provides an invaluable tool forproteomicstudies.Step1SamplePrepStep2First-Dimension(IEF)SeparationStep3Second-Dimension(SDS-PAGE)SeparationStep4ProteinDetectionbyStaining/Destaining凯氏定氮法凯氏定氮法 凯氏定氮法是先测定总氮量凯氏定氮法是先测定总氮量, , 然后乘以蛋白质换算系数，即可然后乘以蛋白质换算系数，即可得到粗蛋白质含量。可用于所有动、植物
16、食品的蛋白质含量测得到粗蛋白质含量。可用于所有动、植物食品的蛋白质含量测定。但因样品中常含有核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉以及含定。但因样品中常含有核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉以及含氮色素等非蛋白质的含氮化合物，氮色素等非蛋白质的含氮化合物，故结果称为粗蛋白质含量。故结果称为粗蛋白质含量。凯氏定氮法由凯氏定氮法由KieldahlKieldahl于于18331833年首先提出，经过长期改进，迄今已演变成年首先提出，经过长期改进，迄今已演变成常量法、微量法、自动定氮仪法、半微量法及改良凯氏法等多种，至今仍常量法、微量法、自动定氮仪法、半微量法及改良凯氏法等多种，至今仍被作为标准检验方法。在此主要介绍
17、被作为标准检验方法。在此主要介绍常量凯氏定氮法的原理及步骤常量凯氏定氮法的原理及步骤。原理原理: : 样品与浓硫酸和催化剂一同加热样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化消化，使蛋白质分解，其中碳，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化成二氧化碳和水逸出，而部分硫酸被还原成二氧化和氢被氧化成二氧化碳和水逸出，而部分硫酸被还原成二氧化硫，样品中的硫，样品中的有机氮转化为氨有机氮转化为氨与与过量的硫酸结合成硫酸铵过量的硫酸结合成硫酸铵; ; 然然后后加碱蒸馏加碱蒸馏，使氨蒸出，用弱酸硼酸吸收后再以标准强酸如盐使氨蒸出，用弱酸硼酸吸收后再以标准强酸如盐酸或硫酸溶液滴定酸或硫酸溶液滴定，根据标准酸消耗量可计算出蛋白质
18、的含量。，根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。 催化剂催化剂煮沸煮沸1、消化：、消化：NCOC+浓浓H2SO4（NH4）2SO4+CO2+SO2+H2O2、氨化：、氨化：2NaOH+（NH4）2SO42NH3+Na2SO4+2H2O3、吸收吸收: 2NH: 2NH3 3 + 4H + 4H3 3BOBO3 3 （NHNH4 4）2 2B B4 4O O7 7 + 5H + 5H2 2O O 4 4、滴定：（、滴定：（NHNH4 4）2 2B B4 4O O7 7 + 5H + 5H2 2O + 2HCl 2NHO + 2HCl 2NH4 4Cl + 4HCl + 4H3 3BOBO3 3 (
19、 (注注: NCOC, Nitrogen containing organic compounds ): NCOC, Nitrogen containing organic compounds )凯氏定氮法原理（方程式）凯氏定氮法原理（方程式）凯氏定氮法注意事项凯氏定氮法注意事项图：常量凯氏定氮消化及蒸馏装置图：常量凯氏定氮消化及蒸馏装置 a a消化装置消化装置 b b蒸馏吸收装置蒸馏吸收装置1 1、硫酸钾、硫酸钾 及及硫酸铜的作用硫酸铜的作用2 2、火候控制、火候控制3 3、装置的气、装置的气密性密性4 4、何时加碱、何时加碱5 5、难消化的、难消化的 对策对策6 6、停止蒸馏、停止蒸馏 说
20、明及注意事项说明及注意事项0 0: : 当浓硫酸的用量为当浓硫酸的用量为30ml30ml时，硫酸铜，硫酸钾，氢氧化钠等试剂时，硫酸铜，硫酸钾，氢氧化钠等试剂应按比例增加应按比例增加。所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。 消消化化时时不不要要用用强强火火，应应保保持持和和缓缓沸沸腾腾，以以免免粘粘附附在在凯凯氏氏瓶瓶内内壁壁上上的的含含氮氮化化合合物物未未消消化完全而造成氮损失。化完全而造成氮损失。消消化化过过程程中中应应注注意意不不时时转转动动凯凯氏氏烧烧瓶瓶，以以便便利利用用冷冷凝凝酸酸液液将将附附在在瓶瓶壁壁上上的的固固体体残残渣渣洗下并促进其消化完全。洗下并促
21、进其消化完全。样样品品中中若若含含脂脂肪肪或或糖糖较较多多时时，消消化化过过程程中中易易产产生生大大量量泡泡沫沫，为为防防止止泡泡沫沫溢溢出出瓶瓶外外，在在开开始始消消化化时时应应用用小小火火加加热热，并并不不停停地地摇摇动动；或或者者加加入入少少量量辛辛醇醇或或液液体体石石蜡蜡或或硅硅油油消消泡泡剂剂，并同时注意控制热源强度。并同时注意控制热源强度。当当样样品品消消化化液液不不易易澄澄清清透透明明时时，可可将将凯凯氏氏烧烧瓶瓶冷冷却却，加加入入30%30%过过氧氧化化氢氢2 23mL3mL后后再再继继续加热消化。续加热消化。若若取取样样量量较较大大，如如干干试试样样超超过过5g5g，可可按按
22、每每克克试试样样5mL5mL的的比比例例增增加加硫硫酸酸用用量量（何何时时会会必必要？）。要？）。一一般般消消化化至至呈呈透透明明后后，继继续续消消化化30min30min即即可可，但但对对于于含含有有特特别别难难以以氨氨化化的的氮氮化化合合物物的的样样品品，如如含含赖赖氨氨酸酸、组组氨氨酸酸、色色氨氨酸酸、酪酪氨氨酸酸或或脯脯氨氨酸酸等等时时，需需适适当当延延长长消消化化时时间间。有有机机物如分解完全，消化液呈蓝色或浅绿色，物如分解完全，消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时，呈较深绿色但含铁量多时，呈较深绿色。蒸馏装置不能漏气。蒸馏装置不能漏气。蒸蒸馏馏前前若若加加碱碱量量不不足足，消消化化液
23、液呈呈蓝蓝色色不不生生成成氢氢氧氧化化铜铜沉沉淀淀，此此时时需需再再增增加加氢氢氧氧化化钠钠用量。用量。硼硼酸酸吸吸收收液液的的温温度度不不应应超超过过4040，否否则则对对氨氨的的吸吸收收作作用用减减弱弱而而造造成成损损失失，此此时时可可置置于于冷水浴中使冷水浴中使用。用。1111蒸蒸馏馏完完毕毕后后，应应先先将将冷冷凝凝管管下下端端提提离离液液面面清清洗洗管管口口，再再蒸蒸1min1min后后关关掉掉热热源源，否否则则可可能能造成吸收液倒吸造成吸收液倒吸。 (12)(12)混合指示剂混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色
24、，在酸性溶液中呈红色。 氨基酸的分析什么是氨基酸?氨基酸的分类氨基酸的化学结构?氨基酸的两性电解质的特性氨基酸的结构氨基酸的结构氨氨基酸的一般显色反应氨氨基酸的一般显色反应 茚茚三三酮酮法法、吲吲哚哚醌醌法法和和邻邻苯苯二二甲甲醛醛法法。前前二二种种是是经经典典的的常常用用显显色色法法，后后一一种种是是近近年来发展起来的荧光显色法，具有灵敏度高的特点。年来发展起来的荧光显色法，具有灵敏度高的特点。1. 1. 茚三酮法茚三酮法原理原理: : 氨基酸或蛋白质能与茚三酮作用，生成蓝紫色化合物氨基酸或蛋白质能与茚三酮作用，生成蓝紫色化合物. .步骤：步骤：将点有样品的层析滤纸充分除尽溶剂，将点有样品的
25、层析滤纸充分除尽溶剂，用用5g/L5g/L茚三酮无水丙酮溶液喷雾，充分吹干，茚三酮无水丙酮溶液喷雾，充分吹干，6565,30min30min（空气中的氨可使背景泛红色），氨基酸斑点呈紫红色。（空气中的氨可使背景泛红色），氨基酸斑点呈紫红色。为了使各种氨基酸呈现不同颜色，可用下列方法：为了使各种氨基酸呈现不同颜色，可用下列方法：用用0.4g0.4g茚三酮，茚三酮，10g10g酚和酚和90g90g正丁醇的混合液显色。正丁醇的混合液显色。用用1g/L1g/L茚三酮无水丙酮溶液显色完毕后，再用盐酸蒸汽熏茚三酮无水丙酮溶液显色完毕后，再用盐酸蒸汽熏1min (HOW ?)1min (HOW ?)。为了使
26、显色稳定，可用下列方法：为了使显色稳定，可用下列方法： ( (何谓贮存液及工作液何谓贮存液及工作液? ?) )贮存液贮存液A A：醋酸镉：醋酸镉2g2g、冰醋酸、冰醋酸40mL40mL、蒸馏水、蒸馏水200mL 200mL 贮存液贮存液B B：茚三酮：茚三酮2g2g、丙酮、丙酮200mL200mL显色液：显色液：A/B=1.2:1 (A/B=1.2:1 (按需制备按需制备) )点点有有样样品品的的滤滤纸纸上上浸浸有有此此显显色色液液后后，放放置置于于盛盛有有一一小小杯杯浓浓硫硫酸酸的的密密闭闭玻玻璃璃容容器器中中2525，18h18h，或或较较高高温温度度下下适适当当缩缩短短时时间间。背背景景
27、色色浅浅，氨氨基基酸酸斑斑点点也也比比较较稳稳定定。拍拍照照记录记录! !2 2吲哚醌法吲哚醌法各种氨基酸与吲哚醌试剂能显示不同颜色，各种氨基酸与吲哚醌试剂能显示不同颜色，因此可借此辩认氨基酸。氨对吲哚醌显色没氨对吲哚醌显色没有妨碍，但其灵敏度较茚三酮法稍差有妨碍，但其灵敏度较茚三酮法稍差，显色不稳定，颜色只有在绝对干燥的环境中才能保存。3 3邻苯二甲醛法邻苯二甲醛法邻苯二甲醛在邻苯二甲醛在2-2-巯基乙醇存在下，在碱性溶液中与氨基酸作用产生荧光化合物，最适的巯基乙醇存在下，在碱性溶液中与氨基酸作用产生荧光化合物，最适的激发光和发射光波长分别为激发光和发射光波长分别为340nm340nm和45
28、5nm。在手提式紫外灯(254/365)254/365)下观察.* 邻苯二甲醛法是目前纸上层析、硅胶薄层层析荧光显色氨基酸最灵敏的方法之一，也可用于氨基酸溶液定量.氨基酸纸上层析灵敏度达氨基酸纸上层析灵敏度达0.50.5moLmoL，在硅胶薄层层析上为，在硅胶薄层层析上为0.050.050.20.2moL (moL (不严密不严密, ,因为各种氨基酸显现的荧光强度不同因为各种氨基酸显现的荧光强度不同, ,所以因指明是什么所以因指明是什么AA.AA.) )* 各种氨基酸显现的荧光强度不同，其相对荧光强度由大到小大致顺序如下：天门冬氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，精氨酸，组氨酸，亮氨酸，丝氨酸，缬氨酸，
29、谷氨酸，苏氨酸，甘氨酸，色氨酸，丙氨酸，苯丙氨酸，赖氨酸，酪氨酸，NH3，脯氨酸和半胱氨酸。说明在滤纸上显现氨基酸时，邻苯二甲醛浓度以0.1%为宜。显色时必须有一定的湿度，以便显色时必须有一定的湿度，以便氨基酸溶解，氨基酸溶解，提高分子碰撞机率，并使极性基团解离，促进反应趋于完全。湿度太低，显不出荧光。温度对显现的荧光延时有显著影响，温度高荧光延时短，温度低荧光延时长。个别氨基酸的显色反应个别氨基酸的显色反应利用个别氨基酸与某些试剂具有特殊的显色反应定性氨基酸利用个别氨基酸与某些试剂具有特殊的显色反应定性氨基酸可应用于纸层析和纸电泳显色。可应用于纸层析和纸电泳显色。 精氨酸，胱氨酸、半胱氨酸、
30、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸和羟精氨酸，胱氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸和羟赖氨酸、羟脯氨酸赖氨酸、羟脯氨酸, ,色氨酸、酪氨酸、酪氨酸、组氨酸。色氨酸、酪氨酸、酪氨酸、组氨酸。氨基酸定量氨基酸定量一、氨基酸的一般定量测定一、氨基酸的一般定量测定（一）甲醛滴定法（一）甲醛滴定法氨氨基基酸酸具具有有酸酸性性的的-COOH-COOH基基和和碱碱性性的的-NH-NH2 2基基。它它们们相相互互作作用用而而使使氨氨基基酸酸成成为为中中性性的的内内盐盐。当当加加入入甲甲醛醛溶溶液液时时，-NH-NH2 2基基与与甲甲醛醛结结合合，从从而而使使其其碱碱性性消消失失。这这样样就就可可以以用用标标准准强强碱
31、碱溶溶液液来来滴定滴定-COOH-COOH基，并用间接的方法测定氨基酸总量。基，并用间接的方法测定氨基酸总量。反应式如下：反应式如下： 3 3操作方法操作方法 吸吸取取含含氨氨基基酸酸约约20mg20mg的的样样品品溶溶液液于于100mL容量瓶中，加水至标线，混匀后吸取20.0mL置于200mL烧杯中，加水60mL，开动磁力搅拌器，用0.05mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至酸度计指示pH8.2，记录消耗氢氧化钠标准溶液mL数，供计算总酸含量供计算总酸含量。加入10.0mL甲醛溶液，混匀。再用上述氢氧化钠标准溶液继续滴定至pH9.2，记记录录消消耗耗氢氧化钠标准溶液毫升数氢氧化钠标准溶液毫升数(
32、V1)(V1)。同时取80mL蒸馏水置于另一200mL洁净烧瓶中，先用氢氧化钠标准溶液调至pH82，（此时不计碱消耗量），再加入10.0mL中性甲醛溶液，用0.05mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至pH9.2，记录消耗氢氧化钠标准溶液毫升数记录消耗氢氧化钠标准溶液毫升数(V2),(V2),作为试剂空白试验。4结果计算 氨基酸态氮氨基酸态氮质量分数（%）= f(V1-V2)式中：V1样品稀释液在加入甲醛后滴定至pH9.2时所消耗氢氧化钠溶液的体积； V2空白试验加入甲醛后滴定至pH9.2时所消耗的氢氧化钠标准溶液的体积5.说明本法准确快速，可用于各类样品游离氨基酸含量测定本法准确快速，可用于各类样
33、品游离氨基酸含量测定, ,浑浊和色深样液可不经处理而直接测定浑浊和色深样液可不经处理而直接测定, ,在发酵工业中常用此法测定发酵液中氨基氮含量的变化，来了解可被微生物利用的氮源在发酵工业中常用此法测定发酵液中氨基氮含量的变化，来了解可被微生物利用的氮源的量及利用情况，并以此作为控制发酵生产的指标之一。的量及利用情况，并以此作为控制发酵生产的指标之一。脯氨酸与甲醛作用时产生不稳定的化合物，使结果偏低；酪氨酸含有酚羧基，滴定时也脯氨酸与甲醛作用时产生不稳定的化合物，使结果偏低；酪氨酸含有酚羧基，滴定时也会消耗一些碱而致使结果偏高；溶液中若有铵存在也可与甲醛反应，往往使结果偏高会消耗一些碱而致使结果
34、偏高；溶液中若有铵存在也可与甲醛反应，往往使结果偏高茚三酮比色法茚三酮比色法 1 1原理原理氨氨基基酸酸在在碱碱性性溶溶液液中中能能与与茚茚三三酮酮作作用用，生生成成蓝蓝紫紫色色化化合合物物（脯脯氨氨酸酸反反应应成成黄黄色色），该该蓝蓝紫紫色色化化合合物物的的颜颜色色深深浅浅与与氨氨基基酸酸含含量量成成正正比比，其其最最大大吸吸收收波波长长为为570nm570nm，故故故故据据据据此此此此可可可可以以以以测测测测定定定定样品中样品中样品中样品中氨基酸含量氨基酸含量。2 2操作方法操作方法(1)(1)标准曲线绘制标准曲线绘制准准确确吸吸取取相相当当于于0 0、100100、200200、3003
35、00、400400、500500、600600g g氨氨基基酸酸( (单单或或混混合合氨氨基基酸酸) )标标准准溶溶液液，分分别别置置于于25mL25mL容容量量瓶瓶或或比比色色管管中中，各各加加水水补补充充至至容容积积为为4.0mL4.0mL，然然后后加加入入茚茚三三酮酮溶溶液液（20g/L20g/L）和和磷磷酸酸盐盐缓缓冲冲溶溶液液（pHpH为为8.048.04）各各1mL1mL，混混合合均均匀匀，于于水水浴浴上上加加热热15min15min，取取出出迅迅速速冷冷至至室室温温，加加水水至至标标线线，摇摇匀匀。静静置置15min15min后后，在在570nm570nm波波长长下下，以以试试剂
36、剂空空白白为为参参比比液液测定各溶液的测定各溶液的吸光度吸光度A A。绘制标准曲线。绘制标准曲线。(2)(2)样品测定样品测定吸吸取取澄澄清清的的样样品品溶溶液液1 14mL4mL，按按标标准准曲曲线线制制作作步步骤骤，在在相相同同条条件件下下测测定定吸吸光光度度A A值值，用用测得的测得的A A值在标准曲线上可查得对应的氨基酸微克数。值在标准曲线上可查得对应的氨基酸微克数。3 3结果计算结果计算4 4说明及注意事项说明及注意事项通通常常采采用用的的样样品品处处理理方方法法为为：准准确确称称取取粉粉碎碎样样品品5 510g10g或或吸吸取取样样液液样样品品5 510mL10mL，置置于于烧烧杯
37、杯中中，加加入入50mL50mL蒸蒸馏馏水水和和5g5g左左右右活活性性炭炭，加加热热煮煮沸沸，过过滤滤，用用303040mL40mL热热水水( (磷磷酸酸缓缓冲液效果如何呢冲液效果如何呢?)?)洗涤活性炭，收集滤液于洗涤活性炭，收集滤液于100mL100mL容量瓶中，加水至标线，摇匀备测。容量瓶中，加水至标线，摇匀备测。 茚茚三三酮酮受受阳阳光光、空空气气、温温度度、湿湿度度等等影影响响而而被被氧氧化化呈呈淡淡红红色色或或深深红红色色，使使用用前前须须进进行行纯化纯化. .茚三酮茚三酮 (四)邻苯二甲醛法(OPT法)1原理邻苯二甲醛邻苯二甲醛在2-巯基乙醇存在下，于碱性溶液中与氨基酸作用产生
38、荧光化合物荧光化合物，最适的激发光和发射光波长分别为340和455nm。可能产物为：各种氨基酸显现的荧光强度不同，各种氨基酸显现的荧光强度不同，其相对荧光强度由大到小大致顺序如下：天门冬氨酸，-赖氨酸，酪氨酸，NH3,半胱氨酸和脯氨酸，。本法可用于测定游离氨基酸的含量。灵敏度较茚三酮法约高灵敏度较茚三酮法约高100100倍以上，可测到倍以上，可测到0.10.11101104 4molmol氨基酸。如用于血清中氨基酸。如用于血清中- -氨基氮的测定，每次血清用量只需氨基氮的测定，每次血清用量只需5 51010L L。与另一种荧光试剂（萤光胺）一样，空白无荧光，只有与氨基酸结合才产生荧光。缺点是与
39、脯氨酸不产生荧光，邻苯二甲醛与半胱氨酸荧光值太低。荧光胺荧光胺已有用于氨基酸自动分析定量分析，但由于试剂昂贵及个别氨基酸反应不满意，目前还未普遍应用。二、个别氨基酸的定量测定、个别氨基酸的定量测定（二）色氨酸的测定（二）色氨酸的测定原原理理: :样样品品中中的的蛋蛋白白质质经经碱碱水水解解后后，游游离离的的色色氨氨酸酸与与甲甲醛醛和和含含铁铁离离子子的的三三氯氯乙乙酸酸溶溶液液作作用用，生生成成哈哈尔尔满满化化合合物物（norharmannorharman），具具有有特特征征荧荧光光值值，可可以进行定量测定。反应式如下：以进行定量测定。反应式如下：（一）赖氨酸的测定（一）赖氨酸的测定（二）色氨
40、酸的测定（二）色氨酸的测定（三）苯丙氨酸的测定（三）苯丙氨酸的测定（四）酪氨酸的测定（四）酪氨酸的测定（五）脯氨酸的测定（五）脯氨酸的测定1 1原理原理在丙酮溶剂中，脯氨酸与在丙酮溶剂中，脯氨酸与吲哚醌吲哚醌反应形成蓝色化合物，能用以测定蛋白质水解液中的脯反应形成蓝色化合物，能用以测定蛋白质水解液中的脯氨酸含量，在一定条件下（包括氨酸含量，在一定条件下（包括pHpH、缓冲液浓度和吲哚醌浓度），可以在其他氨基酸存、缓冲液浓度和吲哚醌浓度），可以在其他氨基酸存在下直接进行测定，不受羟脯氨酸的干扰。在下直接进行测定，不受羟脯氨酸的干扰。( (六六) )羟脯氨酸的测定羟脯氨酸的测定 （七）胱氨酸的测定
41、（七）胱氨酸的测定 （八）谷氨酸的测定（八）谷氨酸的测定1 1原理原理L-L-谷氨酸在大肠杆菌的谷氨酸在大肠杆菌的谷氨酸脱羧酶谷氨酸脱羧酶作用下脱羧释放出二氧化碳，由测压法测得二氧作用下脱羧释放出二氧化碳，由测压法测得二氧化碳放出量，计算出谷氨酸含量。化碳放出量，计算出谷氨酸含量。附附 8 8种氨基酸：种氨基酸： 亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、 色氨酸、色氨酸、 缬氨酸缬氨酸第七节第七节 氨基酸的分离及测定氨基酸的分离及测定一、薄层色谱法一、薄层色谱法1 1原理原理取取一一定定量量经经水水解解的的样样品品溶溶液液，滴滴在
42、在制制好好的的薄薄层层板板上上，在在溶溶剂剂系系统统中中进进行行双双向向上上行行法法展展开开，样样品品各各组组分分在在薄薄层层板板上上经经过过多多次次的的被被吸吸附附、解解吸吸、交交换换等等作作用用，同同一一物物质质具具有有相相同同的的R Rf f值值，不不同同成成分分则则有有不不同同的的R Rf f值值，因因而而各各种种氨氨基基酸酸可可达达到到彼彼此此分分离离的的目目的的。然然后后用用茚茚三三酮酮显显色色，与与标标准准氨氨基基酸酸进进行行对对比比，即即可可鉴鉴别别样样品品中中所所含含氨氨基基酸酸的的种种类类，从从显显色色斑斑点点颜颜色色的的深深浅浅可大致确定其含量。可大致确定其含量。D1D1
43、D2D2ABC如何进行如何进行TLCTLC刮样刮样法分离氨基酸法分离氨基酸2DTLC二、氨基酸自动分析仪法二、氨基酸自动分析仪法1 1原理原理氨氨基基酸酸的的组组分分分分析析，现现在在广广泛泛地地采采用用离离子子交交换换法法，并并由由自自动动化化的的仪仪器器来来完完成成。其其原原理理是是利利用用各各种种氨氨基基酸酸的的酸酸碱碱性性、极极性性和和分分子子量量大大小小不不同同等等性性质质，使使用用阳阳离离子子交交换换树树脂脂在在色色谱谱柱柱上上进进行行分分离离。当当样样液液加加入入色色谱谱柱柱顶顶端端后后，采采用用不不同同的的pHpH值值和和离离子子浓浓度度的的缓缓冲冲溶溶液液即即可可将将它它们们
44、依依次次洗洗脱脱下下来来，即即先先是是酸酸性性氨氨基基酸酸和和极极性性较较大大的的氨氨基基酸酸，其其次次是是非非极极性性的的芳芳香香性性氨氨基基酸酸，最最后后是是碱碱性性氨氨基基酸酸；摩摩尔尔质质量量小小的的比比摩摩尔尔质质量量大大的的先先被洗脱下来，洗脱下来的氨基酸可用茚三酮显色，从而定量各种氨基酸。被洗脱下来，洗脱下来的氨基酸可用茚三酮显色，从而定量各种氨基酸。定定量量测测定定的的依依据据是是氨氨基基酸酸和和茚茚三三酮酮反反应应生生成成蓝蓝紫紫色色化化合合物物（570nm570nm）的的颜颜色色深深浅浅与与各各有有关关氨氨基基酸酸的的含含量量成成正正比比。但但脯脯氨氨酸酸和和羟羟脯脯氨氨酸
45、酸则则生生成成黄黄棕棕色色化化合合物物（440nm440nm），故需在另外波长处定量测定。，故需在另外波长处定量测定。氨基酸自动分析仪3操作方法 样品处理：测定样品中各种游离氨基酸含量，测定样品中各种游离氨基酸含量，可以除去脂肪杂质后，直接上柱进行分析；测测定定蛋蛋白白质质的的氨氨基基酸酸组组成成时时样样品品必必须须经经酸酸水水解解（称取干燥的蛋白质样品数毫克，加入2mL5.7mol/L盐酸，置于110烘箱内水解24h，然后除去过量的盐酸，加缓冲溶液稀释到一定体积，摇匀），使蛋白质完全变成氨基酸后才能上柱进行分析。如果样品中含有糖和淀粉、脂肪、核酸、无机盐等杂质，必必须须将将样样品品预预先先除
46、除去去杂杂质质后后再进行酸水解处理。去杂质的方法如下：去糖和淀粉：去糖和淀粉：把样品用淀粉酶水解，然后用乙醇溶液洗涤，得蛋白质沉淀物。去去脂脂肪肪：先把干燥的样品经研碎后用丙酮或乙醚等有机溶剂离心或过滤抽提，得蛋白质沉淀物。去去核核酸酸：将样品在100g/L氯化钠溶液中，85加热6h，然后用热水洗涤，过滤后将固形物用丙酮干燥即可。去无机盐：去无机盐：样品经水解后含有大量无机盐时还必须用阳离子交换树脂进行去盐处理。样品分析：经过处理后的样品上柱进行分析。上柱的样品量根据所用自动分析仪的灵敏度来确定。一般为每种氨基酸0.1mol左右（水解样品干重为0.3mg左右）。测定必须在pH55.5、100下
47、进行，反应进行时间为1015min，生成的紫色物质在570nm波长下进行比色测定。而生成的黄色化合物在440nm波长下进行比色测定。* 显显色色反反应应用用的的茚茚三三酮酮试试剂剂，随随着着时时间间推推移移发发色色率率会会降降低低，故故在在较较长长时时间间测测样样过过程程中中应应随时采用已知浓度的氨基酸标准溶液上柱测定以检验其变化情况。随时采用已知浓度的氨基酸标准溶液上柱测定以检验其变化情况。* 采用反相色谱原理制造的氨基酸分析仪，可可使使蛋蛋白白质质水水解解出出的的1717种种氨氨基基酸酸在在12min12min内内完成分离，完成分离，且具有灵敏度高（最小检出量可达1pmol）、重现性好以及
48、一机多用等优点。三、气相色谱法三、气相色谱法1原理将将本本身身没没有有挥挥发发性性的的氨氨基基酸酸转转变变为为适适合合于于气气相相色色谱谱分分析析的的衍衍生生物物三三氟氟乙乙酰酰基基正正丁丁酯酯。它包括用正丁醇的酯化和用三氟乙酸酐（TFAA）的酰化两个步骤。将酰化好的氨基酸衍生物进行气相色谱分析。四、高效液相色谱法四、高效液相色谱法高效液相色谱法适于分析沸点高、分子量大、热稳定性差的物质和生物活性物质。由于大多数氨基酸无紫外吸收及荧光发射特性，而紫外吸收检测器（UVD）和荧光检测器（FD）又是HPLC仪的最常用配置。故故人人们们需需将将氨氨基基酸酸进进行行衍衍生生化化，使使其其可可以以利利用用
49、紫紫外外吸吸收或荧光检测器进行测定。收或荧光检测器进行测定。氨基酸的衍生可分为柱前衍生和柱后衍生。柱后衍生需额外的反应器和泵，柱后衍生需额外的反应器和泵，常用于氨基酸分析仪，如前文所提的茚三酮反应。此外，如荧光胺（如荧光胺（FluramFluram）、邻苯二甲醛（）、邻苯二甲醛（OPAOPA）也有被人采用。在氨基酸的在氨基酸的HPLCHPLC测定中，更多的还是采用柱前衍生法测定中，更多的还是采用柱前衍生法，这是因为比起柱后衍生法它的优点有：（1）固定相采用C18或其它疏水物，可分辨分子结构细小的差异；（2）反相洗脱，流动相为极性溶剂，如甲醇、乙二腈等，避免对荧光检测的干扰，可提高灵敏度及速度；
50、（3）一机多用。 AAsassaybyGC1 1原理原理将本身将本身没有挥发性的氨基酸转变没有挥发性的氨基酸转变为适合于气相色为适合于气相色谱分析的衍生物谱分析的衍生物三氟乙酰基氨基酸正丁酯三氟乙酰基氨基酸正丁酯。它包括用正丁醇的酯化和用三氟乙酸酐它包括用正丁醇的酯化和用三氟乙酸酐（TFAATFAA）的）的酰化化两个两个步步骤。将将酰化好的化好的氨氨基基酸衍生物酸衍生物进行行气气相色相色谱分析。分析。1.1.高效液相色谱法适于分析沸点高、分子量大、热稳定性高效液相色谱法适于分析沸点高、分子量大、热稳定性差的物质和生物活性物质。差的物质和生物活性物质。2. 2. 由于大多数氨基酸无紫外吸收及荧光
51、发射特性，而紫由于大多数氨基酸无紫外吸收及荧光发射特性，而紫外吸收检测器和荧光检测器是外吸收检测器和荧光检测器是HPLCHPLC仪的最常的检测器。仪的最常的检测器。故人们需将故人们需将氨基酸进行衍生化氨基酸进行衍生化，使其可以利用紫外吸收，使其可以利用紫外吸收或荧光检测器进行测定。或荧光检测器进行测定。3.3.氨基酸的衍生可分为氨基酸的衍生可分为柱前衍生和柱后衍生柱前衍生和柱后衍生。柱后衍生需。柱后衍生需额外的反应器和泵，常用于额外的反应器和泵，常用于氨基酸自动分析仪氨基酸自动分析仪，如前文，如前文所提的茚三酮反应。所提的茚三酮反应。4. 4. 在氨基酸的在氨基酸的HPLCHPLC测定中，更多
52、的还是采用柱前衍生法，测定中，更多的还是采用柱前衍生法，这是因为比起柱后衍生法它的优点有：（这是因为比起柱后衍生法它的优点有：（1 1）固定相采）固定相采用用C18(C18(反相色谱反相色谱) )，可分辨分子结构细小的差异；（，可分辨分子结构细小的差异；（2 2）流动相为极性溶剂，如甲醇、乙二腈等，避免对荧光检流动相为极性溶剂，如甲醇、乙二腈等，避免对荧光检测的干扰，可提高灵敏度及速度；（测的干扰，可提高灵敏度及速度；（3 3）一机多用。）一机多用。AAsassaybyHPLC蛋白蛋白质营养养价的分析方法价的分析方法1、氨基酸组成分析2、必需氨基酸组成及含量分析3、体外酶解分析：蛋白质的可消化性能4、微生物生长分析：检查比需氨基酸及蛋白质的质量5、动物实验法：喂养小鼠。Protein digestibility= N absorbed / N ingestedActual biological value= N retained/ N absorbedCoefficient of protein= N retained / N ingestedTHANKSFORYOURATTENTION！
