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1、瞬态荧光光谱瞬态荧光光谱曾燕曾燕2主要内容主要内容荧光光谱的基本原理荧光光谱的基本原理1 稳态稳态/瞬态荧光光谱仪（瞬态荧光光谱仪（FLS 920）243荧光光谱的基本原理荧光光谱的基本原理4荧光定义荧光定义荧光荧光是一种是一种光致光致冷发光冷发光现象。当某种常温物质现象。当某种常温物质经某种波长的入射光（通常是经某种波长的入射光（通常是紫外线紫外线或或X X射线射线）照射，吸收光能后进入激发态，并且立即退激照射，吸收光能后进入激发态，并且立即退激发并发出出射光（通常波长比入射光的的波长发并发出出射光（通常波长比入射光的的波长长，在长，在可见光可见光波波段）段），而且一旦停止入射光，而且一旦停
2、止入射光，发光现象也随之立即消失。具有这种性质的出发光现象也随之立即消失。具有这种性质的出射光就被称之为荧光。射光就被称之为荧光。5退激发途径退激发途径辐射跃迁荧光磷光内转换外转换系间窜越振动弛豫无辐射跃迁退激发途径退激发途径6雅布隆斯基分子能级图雅布隆斯基分子能级图S2S1S0T1吸吸收收发发射射荧荧光光发发射射磷磷光光系间窜越内转换振动弛豫能量l l 2l l 1l l 3 外转换l l 2T2内转换振动弛豫7激发谱激发谱 固定发射波长固定发射波长(一般将其固定于发射波段中感兴趣的峰位一般将其固定于发射波段中感兴趣的峰位)，扫描，扫描出的化合物的出的化合物的发射光强发射光强(荧光荧光/磷光
3、磷光) 与与入射光波长入射光波长的关系曲线。的关系曲线。主要光谱参量主要光谱参量发射谱发射谱 固定激发波长固定激发波长(一般将其固定于激发波段中感兴趣的峰位一般将其固定于激发波段中感兴趣的峰位)，扫描，扫描出的化合物的出的化合物的发射光强发射光强(荧光荧光/磷光磷光) 与与入射光波长入射光波长的关系曲线。的关系曲线。吸收谱吸收谱 化合物的化合物的吸收光强吸收光强与与入射光波长入射光波长的关系曲线的关系曲线 。 8荧光寿命荧光寿命荧光寿命荧光寿命是荧光强度衰减为初始时的是荧光强度衰减为初始时的1/e1/e所需要的时间，所需要的时间，常用常用 表示。表示。如荧光强度的衰减符合指数衰减的规律如荧光强
4、度的衰减符合指数衰减的规律: : I It t I I0 0e e-kt-kt 其中其中I I0 0是激发时最大荧光强度，是激发时最大荧光强度，I It t是时间是时间t t时的荧光强度，时的荧光强度，k k是衰减常是衰减常数。假定在时间数。假定在时间 时测得的时测得的I It t为为I I0 0的的1/e1/e，则，则 是我们定义的是我们定义的荧光寿命荧光寿命。9事事实实上上，在在瞬瞬间间激激发发后后的的某某个个时时间间，荧荧光光强强度度达达到到最最大大值值，然然后后荧荧光光强强度度将将按按指指数数规规律律下下降降。从从最最大大荧荧光光强强度度值值后后任任一一强强度度值值下下降降到到其其1/
5、e1/e所所需需的的时时间都应等于间都应等于 。 荧光寿命荧光寿命10处处于于激激发发态态的的分分子子，除除了了通通过过发发射射荧荧光光回回到到基基态态以以外外，还还会会通通过过一一些些其其它它过过程程( (如如淬淬灭灭和和能能量量转转移移) )回回到到基基态态，其其结结果果是是加加快快了了激激发发态态分子回到基态的过程，结果是荧光寿命降低。分子回到基态的过程，结果是荧光寿命降低。寿寿命命 和和这这些些过过程程的的速速率率常常数数有有关关，总总的的退退激激过过程程的的速速率率常常数数k k可可以以用各种退激过程的速率常数之和来表示用各种退激过程的速率常数之和来表示: :k k k kF F+
6、+ k ki ik ki i表示各种非辐射过程的衰减速率常数。表示各种非辐射过程的衰减速率常数。则总的则总的寿命寿命 为为: : 1/k1/k 1/(k1/(kF F+ + k ki i) )荧光寿命荧光寿命11稳态稳态/瞬态荧光光谱仪（瞬态荧光光谱仪（FLS 920）12功能功能稳态测量量：激：激发光光谱(荧/磷光磷光强强度度激激发波波长)、发射光射光谱(荧/磷光磷光强强度度发射波射波长)、同步、同步扫描描谱(固定波固定波长差、固定能量差、可差、固定能量差、可变角角)。适合各适合各类液体和固体液体和固体样品的品的测试。瞬瞬态测量量：荧光光(磷光磷光)寿命。寿命。13结构结构14结构结构15光
7、路图光路图16荧光寿命测试原理荧光寿命测试原理时间相关相关单光子光子计数法，数法，简称称“单光子光子计数数(SPC)法法”，其，其基本原理是，脉冲光源激基本原理是，脉冲光源激发样品后，品后，样品品发出出荧光光子信号，光光子信号，每次脉冲后只每次脉冲后只记录某特定波某特定波长单个光子出个光子出现的的时间t，经过多多次次计数，数，测得得荧光光子出光光子出现的几率分布的几率分布P(t)，此，此P(t)曲曲线就相就相当于激当于激发停止后停止后荧光光强强度随度随时间衰减的衰减的I(t)曲曲线。这好比一束好比一束光光(许多光子多光子)通通过一个小孔形成的衍射一个小孔形成的衍射图与与单个光子一个一个光子一个一个地通个地通过小孔小孔长时间的累的累计可得完全相同的衍射可得完全相同的衍射图的原理是的原理是一一样的。的。时间相关相关单光子光子计数数原理是原理是FLS920测量量荧光寿命的工作基光寿命的工作基础。17参见“FLS920-Brochure-曾燕”第20页
