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1、生物技术专业核心课程生物技术专业核心课程生物技术专业核心课程生物技术专业核心课程基基基基 因因因因 工工工工 程程程程6 6 目的基因的克隆与分离鉴定目的基因的克隆与分离鉴定目的基因的克隆与分离鉴定目的基因的克隆与分离鉴定目的基因的克隆目的基因的克隆目的基因的克隆目的基因的克隆目的基因的分离鉴定目的基因的分离鉴定目的基因的分离鉴定目的基因的分离鉴定v基因克隆与基因分离基因克隆与基因分离1 1、克隆、克隆个体水平上的克隆个体水平上的克隆细胞水平上的克隆细胞水平上的克隆分子水平上的克隆分子水平上的克隆2 2、基因克隆、基因克隆分子水平上的克隆，将某一段分子水平上的克隆，将某一段DNADNA或一个基
2、因插入到或一个基因插入到 一个载体分子上，并导入特定的宿主细胞中，形成寄一个载体分子上，并导入特定的宿主细胞中，形成寄 主主/ /载体单元，称为一个载体单元，称为一个克隆。克隆。3 3、基因分离、基因分离从复杂的基因组中分离出单个具特定功能或特性的基从复杂的基因组中分离出单个具特定功能或特性的基 因或因或DNADNA片段。片段。该基因的功能或序列并不一定要了解。该基因的功能或序列并不一定要了解。vv基因工程或基因工程或DNADNA重组技术的前提条件是从生物重组技术的前提条件是从生物体基因组中分离克隆目的基因。体基因组中分离克隆目的基因。确定其表达调控机制和生物学功能；确定其表达调控机制和生物学
3、功能；建立高效表达系统，构建具有经济价值的基因工程菌建立高效表达系统，构建具有经济价值的基因工程菌（细胞）；（细胞）；将目的基因在体外进行必要的结构功能修饰；将目的基因在体外进行必要的结构功能修饰；然后转入受体细胞内改良生物体的遗传性状，包括人然后转入受体细胞内改良生物体的遗传性状，包括人体基因治疗。体基因治疗。vv一般来说，目的基因的克隆战略分为两大类：一般来说，目的基因的克隆战略分为两大类：一般来说，目的基因的克隆战略分为两大类：一般来说，目的基因的克隆战略分为两大类：另一类是利用另一类是利用另一类是利用另一类是利用PCRPCR扩增技术甚至扩增技术甚至扩增技术甚至扩增技术甚至化学合成法化学
4、合成法化学合成法化学合成法体外直接合体外直接合体外直接合体外直接合成目的基因，然后将之克隆表达。成目的基因，然后将之克隆表达。成目的基因，然后将之克隆表达。成目的基因，然后将之克隆表达。一类是构建感兴趣的生物个体的一类是构建感兴趣的生物个体的一类是构建感兴趣的生物个体的一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库，基因文库，基因文库，基因文库，即将某生物即将某生物即将某生物即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的筛选模型从基体的全基因组分段克隆，然后建立合适的筛选模型从基体的全基因组分段克隆，然后建立合适的筛选模型从基体的全基因组分段克隆，然后建立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重
5、组克隆；因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆；因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆；因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆；第一节 目的基因的克隆C PCRC PCR法法法法B B cDNAcDNA法法法法A A 鸟枪法鸟枪法鸟枪法鸟枪法D D 化学合成法化学合成法化学合成法化学合成法E E 基因文库的构建基因文库的构建基因文库的构建基因文库的构建一、一、 鸟枪法鸟枪法鸟枪法克隆目的基因的基本战略鸟枪法克隆目的基因的基本战略鸟枪法操作的改进鸟枪法操作的改进鸟枪法克隆目的基因的局限性鸟枪法克隆目的基因的局限性( (一一) )鸟枪法克隆目的基因的基本战略鸟枪法克隆目的基因的基本战略鸟枪法（鸟枪法（s
6、hot-gun approach)shot-gun approach)：随机克隆供体细胞随机克隆供体细胞的全基因组的全基因组DNADNA片段，然后通过快速有效的筛选程片段，然后通过快速有效的筛选程序从众多克隆中分离出含有目的基因的目的重组子，序从众多克隆中分离出含有目的基因的目的重组子，进而获得目的基因。进而获得目的基因。鸟枪法适用于原核细菌目的基因的克隆分离鸟枪法适用于原核细菌目的基因的克隆分离。1.1.染色体染色体DNADNA的切断的切断 超声波处理：超声波处理：片段长度均一，大小可控，平头末端；片段长度均一，大小可控，平头末端； 全酶切：全酶切：片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有片段
7、长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能使目的基因断开，大小不可控；可能使目的基因断开，大小不可控； 部分酶切：部分酶切：片段长度可控，含有粘性末端，目的基片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整。因完整。 2.2.2.2.与载体连接与载体连接与载体连接与载体连接 如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择多拷贝筛选，则选择多拷贝筛选，则选择多拷贝筛选，则选择多拷贝克隆载体；克隆载体；克隆载体；克隆载体；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则
8、选择如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择表表表表达型载体；达型载体；达型载体；达型载体；3.3.3.3.转化受体细胞转化受体细胞转化受体细胞转化受体细胞 如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择能如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择能如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择能如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择能 使目的基因表达的受体细胞；使目的基因表达的受体细胞；使目的基因表达的受体细胞；使目的基因表达的受体细胞；4.4.筛选含有目的基因的目的重组子筛选含有目的基因的目的重
9、组子筛选含有目的基因的目的重组子筛选含有目的基因的目的重组子 菌落原位杂交法、基因产物功能检测法（筛选模型的菌落原位杂交法、基因产物功能检测法（筛选模型的菌落原位杂交法、基因产物功能检测法（筛选模型的菌落原位杂交法、基因产物功能检测法（筛选模型的 建立）建立）建立）建立） 如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法 筛选，则选择大肠杆菌作为的受体细胞。筛选，则选择大肠杆菌作为的受体细胞。筛选，则选择大肠杆菌作为的受体细胞。筛选，则选择大肠杆菌作为的受体细
10、胞。问题问题问题问题鸟枪法获得的克隆群体庞大鸟枪法获得的克隆群体庞大以人的基因组为例，如果载体承受外源以人的基因组为例，如果载体承受外源DNADNA片段片段的能力为的能力为1-3kb1-3kb；那么；那么, ,人类基因组人类基因组DNADNA需被切割成需被切割成几十万个大小不等的片段；几十万个大小不等的片段；每个片段都分别插入到一个载体分子上，这样就每个片段都分别插入到一个载体分子上，这样就会形成由几十万个不同的重组分子组成的克隆群体；会形成由几十万个不同的重组分子组成的克隆群体；要想从如此巨大的克隆群体中筛选带有目的基因要想从如此巨大的克隆群体中筛选带有目的基因的克隆，显然是非常费事的。的克
11、隆，显然是非常费事的。( (二二) ) 鸟枪法操作的改进鸟枪法操作的改进如果已知目的基因两端的酶切位点，可用该酶处理如果已知目的基因两端的酶切位点，可用该酶处理染色体染色体DNADNA，然后与载体拼接，这样可以保证目的基然后与载体拼接，这样可以保证目的基因的完整性，从而提高重组子中因的完整性，从而提高重组子中目的重组子目的重组子的出现频的出现频率。率。 使用特征性限制性内切酶切开染色体使用特征性限制性内切酶切开染色体DNADNA 使用这一改进方法的前提条件是：使用这一改进方法的前提条件是：目的基因的酶切目的基因的酶切图谱已知。图谱已知。例如，已知某目的基因位于例如，已知某目的基因位于1.8 1
12、.8 kbkb的的SalSalI I片段中，将染色体片段中，将染色体DNADNA用用SalSalI I切开，琼脂糖凝胶电泳分离；切开，琼脂糖凝胶电泳分离；在连接前将在连接前将DNADNA片段进行分级分离片段进行分级分离 2.0 kb1.6 kb1.8 kb用刀片切下相当于用刀片切下相当于1.6 - 2.01.6 - 2.0 kbkb大小大小区域内的凝胶块，从此凝胶块中回收区域内的凝胶块，从此凝胶块中回收DNADNA片段，然后与载体进行拼接。片段，然后与载体进行拼接。vv凝胶凝胶DNADNA片段片段回收技术回收技术 冻融法冻融法滤纸法滤纸法吸附法吸附法低融点凝胶法低融点凝胶法溶解法溶解法vv凝胶
13、凝胶凝胶凝胶DNADNA片段片段片段片段回收程序回收程序回收程序回收程序 1.1.1.1.切胶回收于离心管中；切胶回收于离心管中；切胶回收于离心管中；切胶回收于离心管中； 2.2.2.2.加入等体积的加入等体积的加入等体积的加入等体积的溶液溶液溶液溶液I I I I； 3.50-603.50-603.50-603.50-60水浴加热约水浴加热约水浴加热约水浴加热约10101010分钟至胶融分钟至胶融分钟至胶融分钟至胶融解解解解； 4.4.4.4.加入到加入到加入到加入到DNADNADNADNA纯化柱内，室温放置纯化柱内，室温放置纯化柱内，室温放置纯化柱内，室温放置1 1 1 1分钟分钟分钟分钟
14、； 5 5 5 5. . . .离心离心离心离心1 1 1 1分钟，倒弃收集管内的液体分钟，倒弃收集管内的液体分钟，倒弃收集管内的液体分钟，倒弃收集管内的液体； 6 6 6 6. . . .加入加入加入加入700700700700微升微升微升微升溶液溶液溶液溶液IIIIIIII，室温放置室温放置室温放置室温放置1 1 1 1分钟分钟分钟分钟； 7 7 7 7. . . .离心离心离心离心1 1 1 1分钟，洗去杂质分钟，洗去杂质分钟，洗去杂质分钟，洗去杂质； 8 8 8 8. . . .加入加入加入加入500500500500微升微升微升微升溶液溶液溶液溶液IIIIIIII，最高速离心最高速离
15、心最高速离心最高速离心1 1 1 1分钟分钟分钟分钟； 9 9 9 9. . . .将将将将DNADNADNADNA纯化柱置于纯化柱置于纯化柱置于纯化柱置于1.51.51.51.5mlmlmlml离心管上，加入离心管上，加入离心管上，加入离心管上，加入30303030ulululul溶液溶液溶液溶液IIIIIIIIIIII至管内柱面上，放置至管内柱面上，放置至管内柱面上，放置至管内柱面上，放置1 1 1 1分钟分钟分钟分钟； 10101010. . . .高速离心高速离心高速离心高速离心1 1 1 1分钟，所得液体即为高纯度分钟，所得液体即为高纯度分钟，所得液体即为高纯度分钟，所得液体即为高纯
16、度DNADNADNADNA。( (三三) )鸟枪法克隆目的基因的局限性鸟枪法克隆目的基因的局限性工作量较大，需要了解目的基因的背景知识工作量较大，需要了解目的基因的背景知识不能获得最小长度的目的基因不能获得最小长度的目的基因不能除去真核生物目的基因的内含子结构不能除去真核生物目的基因的内含子结构二、二、cDNA法法cDNAcDNA法克隆目的基因的基本战略法克隆目的基因的基本战略cDNAcDNA法分离目的基因的基本程序法分离目的基因的基本程序cDNAcDNA法克隆目的基因的局限性法克隆目的基因的局限性( (一一) ) cDNAcDNA法克隆目的基因的基本战略法克隆目的基因的基本战略mRNAmRN
17、A1.c1.cDNADNA第一链的合成第一链的合成 55ppp5ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAOHOH3 355ppp5ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAOH3OH3TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTp5p555ppp5ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAOH3OH3TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTp5p5cDNAcDNA第一链第一链引物引物退火退火逆转录酶逆转录酶dNTPsdNTPs2.c2.cDNADNA第二链的合成第二链的合成
18、煮沸煮沸NaOHNaOH自身引导法：获得的双链自身引导法：获得的双链cDNAcDNA 55端会有几对碱基缺失端会有几对碱基缺失55ppp5ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAOHOH 33TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTpp 55TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTpp 55AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAOHOH 33AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTOHOH 33KlenowKlenowdNTPsdNTPsS1
19、S1TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTpp 55DNApolDNApol dNTPsdNTPsRNaesHRNaesH置换合成法：获得的双链置换合成法：获得的双链cDNAcDNA 55端也会有几对碱基缺失端也会有几对碱基缺失55ppp5ppp5G G AAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAA OHOH33TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT pp55S1S155 AAAAAAAAAAAAAAOHOH 33TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTpp 5533T4-DNA T4-DNA ligaseligase55AAA
20、AAAAAAAAAAApAAAAAAAAAAAAAAp 33TTTTTTTTTTTTTTOHTTTTTTTTTTTTTTOH 5555AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 33TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 55dCTPdCTPTdTTdT引导合成法：获得的双链引导合成法：获得的双链cDNAcDNA 能保留完整的能保留完整的55端序列端序列55ppp5ppp5G G AAAAAAAAAAOHOH33TTTTTTTTTTpp5533HOHO55ppp5ppp5G G AAAAAAAAAACCCCCCCCCCCCCCOHOH3333 HOHOCCCCC
21、CCCCCCCCCTTTTTTTTTTpp5533 HOHOCCCCCCCCCCCCCCTTTTTTTTTTpp5555 ppGGGGGGGGGGGGGG33 HOHOCCCCCCCCCCCCCCTTTTTTTTTTpp5555 ppGGGGGGGGGGGGGGAAAAAAAAAAOHOH33NaOHNaOH退火退火KlenowKlenowdNTPsdNTPs3.3.双链双链c cDNADNA的克隆的克隆 双链平头的双链平头的cDNAcDNA与载体的连接：与载体的连接： 平头末端直接与载体连接，但插入的片段无法回收平头末端直接与载体连接，但插入的片段无法回收 平头两端分别接同聚物尾，最好是平头
22、两端分别接同聚物尾，最好是ATAT同聚物尾同聚物尾，这，这样重组分子可通过加热局部变性和样重组分子可通过加热局部变性和S1S1核酸酶处理回核酸酶处理回收插入片段收插入片段加装人工接头引入酶切口，以便插入片段回收加装人工接头引入酶切口，以便插入片段回收 ( (二二) ) cDNAcDNA法克隆目的基因的局限性法克隆目的基因的局限性并非所有的并非所有的mRNAmRNA分子都具有分子都具有polyApolyA结构结构 细菌或原核生物的细菌或原核生物的mRNAmRNA半衰期很短半衰期很短mRNAmRNA在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感，在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感，分离纯化困难分离纯化困难仅限于克
23、隆蛋白质编码基因仅限于克隆蛋白质编码基因 三三 PCR法法使用使用PCRPCR法克隆目的基因的前提条件是：法克隆目的基因的前提条件是：已知待扩增目已知待扩增目的基因或的基因或DNADNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必需的双引物反应必需的双引物。( (一一)PCR)PCR法定向扩增目的基因的基本原理法定向扩增目的基因的基本原理PCRPCR（PolymerasePolymerase Chain Reaction Chain Reaction）法，法，又称为聚合酶又称为聚合酶链链反应或反应或PCRPCR扩增技术，是一种高效快速的体外扩增技术，是一种
24、高效快速的体外DNADNA聚合程聚合程序。序。5555目的基因目的基因变性变性加热加热5555引物引物退火退火5555底物底物聚合聚合55加热加热变性变性5555555555555555555555555555555555555555555555555555555退火退火 引物引物底物聚合聚合加热加热变性变性引物引物退火退火底物聚合聚合1 1223 355 由由TaqTaq DNA DNA聚合酶扩增的聚合酶扩增的PCRPCR产物中，其产物中，其33末端总是会带有末端总是会带有一个非模板依赖型的突出碱基，而且这个碱基几乎总是一个非模板依赖型的突出碱基，而且这个碱基几乎总是AA，因为因为TaqTa
25、q DNA DNA聚合酶对聚合酶对dATPdATP具有优先聚合活性。由于该突出碱基的存具有优先聚合活性。由于该突出碱基的存在，克隆时即可以采取在，克隆时即可以采取TdTTdT末端加同聚尾的方法与载体拼接，也末端加同聚尾的方法与载体拼接，也可以使用专门的可以使用专门的T T载体克隆。载体克隆。 ( (二二) PCR) PCR克隆目的基因的基本程序克隆目的基因的基本程序5555AAAAT TT T5555PCRPCR扩增产物扩增产物T T 载体载体T7T7lacZlacZMCSMCSorioriApAprr四四 化学合成法化学合成法化学合成法的基本战略化学合成法的基本战略化学合成的单元操作化学合成
26、的单元操作DNADNA化学合成的用途化学合成的用途一、化学合成一、化学合成DNADNA的发展的发展二、化学合成寡核苷酸片段的主要方法二、化学合成寡核苷酸片段的主要方法磷酸二酯法磷酸二酯法磷酸三酯法磷酸三酯法亚磷酸三酯法亚磷酸三酯法固相合成法固相合成法自动化法自动化法(Chemical Synthesis of the Gene )三、化学合成三、化学合成DNADNA（寡核苷酸）的应用寡核苷酸）的应用v作为合成基因的元件作为合成基因的元件v作为测序的引物作为测序的引物v作为核酸分析杂交的探针作为核酸分析杂交的探针v用于基因定点诱变研究用于基因定点诱变研究v作为作为PCRPCR反应的引物反应的引物
27、v作为重组作为重组DNADNA连接等的构件连接等的构件( (一一) )化学合成法的基本战略化学合成法的基本战略全基因合成全基因合成化学合成目的基因的前提条件是基因的化学合成目的基因的前提条件是基因的DNADNA序列已知，有三种战略：序列已知，有三种战略：1.1.小片段粘接法：小片段粘接法： 混合退火混合退火根据目的基因全序列，分别合成根据目的基因全序列，分别合成12-1512-15碱基长的单链碱基长的单链DNADNA小片段小片段T4-DNAT4-DNA连接酶连接连接酶连接连接入合适的载体连接入合适的载体 2.2.补钉延长法：补钉延长法： 混合退火混合退火根据目的基因根据目的基因两条互补链两条互
28、补链全序列，分别合成全序列，分别合成12-1512-15碱基长的单链碱基长的单链DNADNA小片段以及小片段以及20-3020-30碱基长的单链碱基长的单链DNADNA中片段中片段T4-DNAT4-DNA连接酶连接连接酶连接克隆入合适的载体克隆入合适的载体 KlenowKlenow酶聚合酶聚合3.3.大片段酶促法：大片段酶促法： 混合退火混合退火根据目的基因根据目的基因的的全序列，分别合成全序列，分别合成40-5040-50碱基长的单链碱基长的单链DNADNA片段片段T4-DNAT4-DNA连接酶连接连接酶连接克隆入合适的载体克隆入合适的载体 KlenowKlenow酶聚合酶聚合( (二二)
29、)化学合成的单元操作化学合成的单元操作vv化学合成化学合成DNADNA的实质是按照序列要求将脱氧核苷酸单体一个的实质是按照序列要求将脱氧核苷酸单体一个个接上去，每接一个单体就是一个循环反应，包括：个接上去，每接一个单体就是一个循环反应，包括：基团保护、基团保护、缩合、氧化、去保护缩合、氧化、去保护等步骤；等步骤；vv从反应机理上来讲，从反应机理上来讲，DNADNA化学合成有化学合成有磷酸二酯法、磷酸三酯法、磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸液三酯法；亚磷酸液三酯法；具体操作过程又有具体操作过程又有液相合成液相合成和和固相合成固相合成两种形两种形式；式；vv前前者者操操作作繁繁琐琐，基基本本上上已已
30、淘淘汰汰；后后者者反反应应中中间间物物的的分分离离程程序序简简便便，DNADNA合成仪就是根据固相亚磷酸液三酯法原理设计的。合成仪就是根据固相亚磷酸液三酯法原理设计的。化学合成的单元操作化学合成的单元操作OHGHHHHOCH2ODMTPOMeNCHMeMeCHMeMeHDMTDMT： 二甲氧基三苯甲基二甲氧基三苯甲基激活激活缩合缩合氧化氧化脱取代基脱取代基玻璃珠玻璃珠连接臂连接臂OHGHHHHOCH2ODMTPOMeOHAHHHHOCH2OO( (三三) DNA) DNA化学合成的用途化学合成的用途合成天然基因合成天然基因修饰改造基因修饰改造基因 设计新型基因设计新型基因 制备探针、引物、接头
31、制备探针、引物、接头 如生长激素释放抑制素基因、脑啡肽基因、胰岛素基因、如生长激素释放抑制素基因、脑啡肽基因、胰岛素基因、干扰素基因等。干扰素基因等。如组织型纤溶酶原激活剂基因、尿激酶原基因等。如组织型纤溶酶原激活剂基因、尿激酶原基因等。 全基因合成的问题全基因合成的问题上述三种方法各有利弊：化学合成上述三种方法各有利弊：化学合成DNADNA的的单片段愈单片段愈短，收率就愈高，但由于化学合成的份额较大，成本短，收率就愈高，但由于化学合成的份额较大，成本较高；较高；在大片段酶促法合成目的基因时，虽然化学合成的在大片段酶促法合成目的基因时，虽然化学合成的份额相对较小，成本较低，但大片段化学合成的收
32、率份额相对较小，成本较低，但大片段化学合成的收率极低，例如，每聚合一个单体的产物收率为极低，例如，每聚合一个单体的产物收率为95%95%，则则合成合成5050个碱基长的个碱基长的DNADNA单链大片段的总收率只有单链大片段的总收率只有7.7%7.7%第一节 目的基因的克隆三、三、三、三、PCRPCR法法法法二、二、二、二、cDNAcDNA法法法法一、鸟枪法一、鸟枪法一、鸟枪法一、鸟枪法四、化学合成法四、化学合成法四、化学合成法四、化学合成法五、基因文库的构建五、基因文库的构建五、基因文库的构建五、基因文库的构建五、基因（组）文库的构建五、基因（组）文库的构建基因文库的基本概念基因文库的基本概念
33、基因文库的构建程序基因文库的构建程序( (一一一一) ) 基因文库的基本概念基因文库的基本概念基因文库的基本概念基因文库的基本概念vv基因库与基因文库基因库与基因文库基因库（基因库（gene poolgene pool）特定生物体全基因组的集合（天然存在）特定生物体全基因组的集合（天然存在） 基因文库（基因文库（gene library or gene bankgene library or gene bank）将特定生物个体的全部将特定生物个体的全部DNADNA片段连接入载体片段连接入载体DNADNA分子上，并分子上，并导入受体细菌或细胞中，经扩增产生的包含该生物全部基因导入受体细菌或细胞中
34、，经扩增产生的包含该生物全部基因组序列的克隆群体。（人工构建）组序列的克隆群体。（人工构建）基因组文库基因组文库（含有全部基因）（含有全部基因） cDNAcDNA文库文库（含有特定时期或组织中蛋白质编码基因）（含有特定时期或组织中蛋白质编码基因） 根据构建方法的不同，基因文库分为：根据构建方法的不同，基因文库分为： vv基因文库构建的基本战略基因文库构建的基本战略用鸟枪法构建基因组文库，用鸟枪法构建基因组文库，材料来自染色体材料来自染色体DNADNA。用用cDNAcDNA法构建法构建cDNAcDNA文库，文库，材料来自材料来自mRNAmRNA。vv 在在高高度度分分化化的的生生物物体体中中，不
35、不同同组组织织和和细细胞胞在在不不同同时时段段的的mRNAmRNA种种类类不不同同（即即基基因因的的表表达达谱谱不不同同），因因此此同同种种生生物物体体的的cDNAcDNA文文库库一一般般还还有有组组织织细细胞胞的的界界定定，如如肝肝组组织织cDNAcDNA文文库库或或胚胚胎胎组组织织cDNAcDNA文文库库等等。很很显显然然， cDNAcDNA文文库库的的信信息息量量远远小小于于基基因组文库。因组文库。1.1.重组克隆的总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力；重组克隆的总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力；2.2.载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分隔克隆；载体的装载量最好大于基因的长度，
36、避免基因被分隔克隆；3.3.克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以利克隆排序；克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以利克隆排序；4.4.克隆片段易于从载体分子上完整卸下；克隆片段易于从载体分子上完整卸下；5.5.重组克隆能稳定保存、扩增、筛选；重组克隆能稳定保存、扩增、筛选；6.6.具有较高的完备性。具有较高的完备性。vv基因文库的质量标准基因文库的质量标准基因文库的完备性是指：基因文库的完备性是指：在构建的基因文库中任一基因存在的概在构建的基因文库中任一基因存在的概率，它与基因文库最低所含克隆数率，它与基因文库最低所含克隆数N N之间的关系可用下式表示：之间的关系可用下式表示：N
37、 = N = lnln ( 1 P ) / ( 1 P ) / lnln ( 1 f ) ( 1 f )其中：其中： P = P = 任一基因被克隆（或存在于基因文库中）的概率任一基因被克隆（或存在于基因文库中）的概率f = f = 克隆片段的平均大小克隆片段的平均大小/ /生物基因组的大小生物基因组的大小 基因文库的完备性基因文库的完备性FF例如，人的单倍体例如，人的单倍体例如，人的单倍体例如，人的单倍体DNADNADNADNA总长为总长为总长为总长为2.92.92.92.9x10x10x10x109 99 9bpbpbpbp，基因文库中基因文库中基因文库中基因文库中克隆片段的平均大小为克隆
38、片段的平均大小为克隆片段的平均大小为克隆片段的平均大小为15151515kb,kb,kb,kb,则构建一个完备性为则构建一个完备性为则构建一个完备性为则构建一个完备性为0.90.90.90.9的基因文库至少需要的基因文库至少需要的基因文库至少需要的基因文库至少需要45454545万万万万个克隆；个克隆；个克隆；个克隆；FF而当完备性提高到而当完备性提高到而当完备性提高到而当完备性提高到0.99990.99990.99990.9999时时时时, , , ,基因文库至少需要基因文库至少需要基因文库至少需要基因文库至少需要180180180180万万万万个克隆。个克隆。个克隆。个克隆。（二）基因文库
39、的构建程序（二）基因文库的构建程序（二）基因文库的构建程序（二）基因文库的构建程序1.1.基因组基因组DNADNA的制备的制备为了最大限度地保证基因在克隆过程中的完整性，为了最大限度地保证基因在克隆过程中的完整性， 用于基因用于基因组组文库构建的文库构建的DNADNA在分离纯化操作中应尽量避免过度的断裂；在分离纯化操作中应尽量避免过度的断裂；AAAAAAAA制备的制备的DNADNA分子量越大，经切割处理后样品中含有不规则末分子量越大，经切割处理后样品中含有不规则末端的端的DNADNA片段的比率就越低，重组率和完备性也就越高。片段的比率就越低，重组率和完备性也就越高。2. 2. 基因组基因组DN
40、ADNA的切割的切割用于基因组用于基因组文库构建的文库构建的DNADNA片段的切割一般采用超声波处理片段的切割一般采用超声波处理 和限制性内切酶部分酶切两种方法，其目的是：和限制性内切酶部分酶切两种方法，其目的是： 第一，保证第一，保证DNADNA片段之间存在部分重叠区片段之间存在部分重叠区 第二，保证第二，保证DNADNA片段大小均一片段大小均一超声波处理后的超声波处理后的DNADNA片段呈平头末端，需加装片段呈平头末端，需加装人工接头；人工接头；部分酶切法一般选用部分酶切法一般选用四对碱基识别序列四对碱基识别序列的限制性内切酶的限制性内切酶，如如：Sau3A Sau3A I I或或MboM
41、bo I I等，这样等，这样DNADNA酶解片段的大小可控；酶解片段的大小可控；连接前，上述处理的连接前，上述处理的DNADNA片段必须根据载体的装载量进行片段必须根据载体的装载量进行分级分级分离，分离，以杜绝不相干的以杜绝不相干的DNADNA片段随机连为一体！片段随机连为一体！3. 3. 载体和受体的选择载体和受体的选择出于压缩重组克隆的数量，用于基因组出于压缩重组克隆的数量，用于基因组文库构建的文库构建的载体通常载体通常 选选装载量较大的装载量较大的 -DNA-DNA或考斯质粒；或考斯质粒；对于大型基因组（如动、植物和人类）需使用对于大型基因组（如动、植物和人类）需使用YACYAC或或BA
42、CBAC载体；载体；由于绝大多数真核生物的由于绝大多数真核生物的mRNAmRNA小于小于10 10 kbkb，因此用于因此用于cDNAcDNA 文库构建的载体通常选质粒。文库构建的载体通常选质粒。 -DNA-DNA上述几种载体的最大装载量如下：上述几种载体的最大装载量如下：上述几种载体的最大装载量如下：上述几种载体的最大装载量如下：质粒质粒质粒质粒考斯质粒考斯质粒考斯质粒考斯质粒1515 kbkb2525 kbkb4545 kbkbBACBAC300300 kbkbYACYAC400400 kbkbvv用于基因文库构建的受体则根据载体使用用于基因文库构建的受体则根据载体使用用于基因文库构建的受
43、体则根据载体使用用于基因文库构建的受体则根据载体使用大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌或或或或酵母菌酵母菌酵母菌酵母菌4. 4. 基因文库构建的技术性问题基因文库构建的技术性问题vv在基因组在基因组文库的构建过程中，文库的构建过程中，最应引起重视的问题是：最应引起重视的问题是：避免外源避免外源DNADNA片段之间的连接！片段之间的连接！vv为了避免上述情况的发生，为了避免上述情况的发生，可采取下列措施的组合：可采取下列措施的组合： 将待连接的将待连接的DNADNA片段根据载体的装载量分级分离片段根据载体的装载量分级分离用碱性磷酸单酯酶除去用碱性磷酸单酯酶除去DNADNA片段的末端磷酸基团片段的末
44、端磷酸基团 用用TdTTdT酶在酶在DNADNA片段的末端上增补同聚尾末端片段的末端上增补同聚尾末端 第二节第二节 基因的分离基因的分离一、基于基因功能的基因分离技术一、基于基因功能的基因分离技术二、基于二、基于DNA插入作用的基因分离技术插入作用的基因分离技术三、基于基因图谱的基因分离技术三、基于基因图谱的基因分离技术一、基于基因功能的基因分离技术一、基于基因功能的基因分离技术1、已知目的基因的氨基酸序列、已知目的基因的氨基酸序列2、根据基因的同源性分离目的基因、根据基因的同源性分离目的基因3、根据、根据mRNA的特异性分离目的基因的特异性分离目的基因1 1、已知目的基因的氨基酸序列、已知目
45、的基因的氨基酸序列（功能克隆）（功能克隆）将纯化的蛋白质进行氨基酸测序，根据某些蛋白将纯化的蛋白质进行氨基酸测序，根据某些蛋白质的氨基酸保守性合成寡核苷酸探针从质的氨基酸保守性合成寡核苷酸探针从cDNAcDNA库或基库或基因组文库中筛选编码基因；因组文库中筛选编码基因；将相应的编码蛋白制成相应抗体探针将相应的编码蛋白制成相应抗体探针, ,从从cDNAcDNA载载体表达库中筛选相应克隆。体表达库中筛选相应克隆。根据某些蛋白质的氨基酸保守性设计特异引物，根据某些蛋白质的氨基酸保守性设计特异引物，PCRPCR扩增出目的基因；扩增出目的基因；vv某段连续氨基酸序列的简并探针的序列设计某段连续氨基酸序列
46、的简并探针的序列设计CysCys Met Asp Met Asp GluGlu Met Lys Met Lys ArgArg AsnAsn Ile IleTGT TGT ATG ATG GAC GAC GAA GAA ATG ATG AAA AAA AGA AGA AAC AAC ATAATA C C T T G G G G G G T T T TC CTGTGT TATGATGGAGAC CGAGAA AATGATGAAAA此外还可以参考各种生物体的此外还可以参考各种生物体的ESTEST数据库进行倾向性简并序列设计数据库进行倾向性简并序列设计总探针类型：总探针类型：2222=16密集铺板（密
47、集铺板（1-101-10万）万）杂杂交交挖挖取取铺铺板板铺铺板板目的重组克隆目的重组克隆vv文库筛选文库筛选 氨基酸序列氨基酸序列核苷酸序列核苷酸序列PCR特异蛋白质特异蛋白质 目的基因目的基因 抗体抗体 基因文库筛选基因文库筛选评价评价优点优点 - 在单基因性状的基因分离方面仍为在单基因性状的基因分离方面仍为常用常用策略策略缺点缺点 - 特异蛋白质确定、鉴定及其纯化困难特异蛋白质确定、鉴定及其纯化困难* - 难以分离微量表达基因难以分离微量表达基因 - 无法研究无无法研究无蛋白质蛋白质产物的基因产物的基因 - 难以进行多基因控制性状的基因分离难以进行多基因控制性状的基因分离根据近缘物种间或进
48、化关系较近的物种间功根据近缘物种间或进化关系较近的物种间功能相关的基因间核苷酸序列的保守性，设计能相关的基因间核苷酸序列的保守性，设计探针，从基因文库中筛选并鉴定目的基因。探针，从基因文库中筛选并鉴定目的基因。2 2、根据基因的同源性分离目的基因、根据基因的同源性分离目的基因v文库筛选法文库筛选法保守序列保守序列保守序列保守序列F5个个MYB转录因子基因的比对结果转录因子基因的比对结果A. cDNA的合成的合成vcDNAcDNA末端快速扩增末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends, RACE) 以以mRNA为模板，用依赖于为模板，用依赖于RNA的的DNA聚
49、合聚合酶酶(反转录酶反转录酶)来催化合成来催化合成cDNA。目前商品化反。目前商品化反转录酶有禽类成髓细胞病毒转录酶有禽类成髓细胞病毒(AMV)逆转录酶和逆转录酶和鼠白血病病毒鼠白血病病毒(MLV)反转录酶。反转录酶。B. 同源片段的克隆同源片段的克隆简并引物的设计简并引物的设计利用利用DNAman、DNAstar等软件对等软件对GENbank中已公中已公布的欲克隆的同源基因的氨基酸和核苷酸序列进行同布的欲克隆的同源基因的氨基酸和核苷酸序列进行同源分析，然后，根据基因的保守区设计合成一对简并源分析，然后，根据基因的保守区设计合成一对简并引物。引物。简并引物简并引物:是指编码单个氨基酸的所有不同
50、碱基可能是指编码单个氨基酸的所有不同碱基可能性的不同序列的混合物。性的不同序列的混合物。v为为了了增增加加特特异异性性,可可以以参参考考密密码码子子使使用用表表,根根据据不不同同生生物的碱基使用偏好物的碱基使用偏好,减少简并性。减少简并性。Gene1:TTC TAT CAC GAG TGC TGGPhe Tyr His Glu Cys TrpTTT TAT CAT GAA TGT TGGGene2:Degenerate Primer: 5-TT(T/C) TAT CA(T/C) GA(A/G) TG(T/C) TGG-3氨基酸序列氨基酸序列: :为了增加特异性为了增加特异性，可以参考密码子使用
51、表可以参考密码子使用表，根据不根据不同生物的碱基使用偏好同生物的碱基使用偏好，减少简并性。减少简并性。简并简并PCR扩增同源片段扩增同源片段琼脂糖凝胶电泳对琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定；用洁净的刀产物进行鉴定；用洁净的刀片在长紫外灯下切下含有目的片在长紫外灯下切下含有目的DNA片段的琼脂糖凝胶，片段的琼脂糖凝胶，放入放入1.5ml的微量离心管中；的微量离心管中；PCR产物回收试剂盒回收产物回收试剂盒回收目的片段。目的片段。将回收的将回收的PCR产物连接至产物连接至pMD18-T载体上，转化大载体上，转化大肠杆菌感受态，克隆目的片段，并测序鉴定。肠杆菌感受态，克隆目的片段，并测序鉴定。C.
52、 cDNA 3末端序列的克隆末端序列的克隆3RACE引物的设计引物的设计 根据已获得的基因的同源片段，设计基因特异的根据已获得的基因的同源片段，设计基因特异的巢式引物巢式引物(nested PCR primer)。GSP1和和GSP2，巢式，巢式PCR扩增扩增cDNA 3末端序列末端序列。RNA的提取及的提取及cDNA的合成的合成方法同前，但反转录引物不同方法同前，但反转录引物不同(带有接头序列带有接头序列)：QT: 5-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG(T)18-3可利用此接头序列设计两条接头引物可利用此接头序列设计两条接头引物Q1和和Q2。Q1Q2巢
53、式巢式PCR扩增扩增3-端端cDNA以以QT引物反转录获得引物反转录获得cDNA为模板，分别用基因为模板，分别用基因特异引物特异引物GSP1与通用引物与通用引物Q1进行第一轮进行第一轮PCR；将第一轮将第一轮PCR产物稀释产物稀释100倍作为模板，分别用基倍作为模板，分别用基因特异引物因特异引物GSP2与通用引物与通用引物Q2进行第二轮巢式进行第二轮巢式PCR；0.8%的琼脂糖凝胶电泳，回收的琼脂糖凝胶电泳，回收PCR产物并连接至产物并连接至T载体，转化大肠杆菌载体，转化大肠杆菌DH-5，利用，利用-互补及菌落互补及菌落PCR筛选阳性克隆，并送测序公司测序。筛选阳性克隆，并送测序公司测序。图
54、ZmABC1-10 基因全长cDNA克隆D. cDNA 5末端序列的克隆末端序列的克隆5RACE引物的设计引物的设计根据已获得的基因的同源片段，设计基因特异的巢式根据已获得的基因的同源片段，设计基因特异的巢式引物（引物（nested PCR primer）。）。GSP1和和GSP2，巢式，巢式PCR扩增扩增cDNA 5末端序列。末端序列。1）TaKaRa公司公司RACE原理原理添加接头序列添加接头序列以以RNaseH分解掉分解掉cDNA-RNA杂交体中杂交体中RNA；利用一利用一5端磷酸化的特异性引物对端磷酸化的特异性引物对mRNA进行反进行反转录形成转录形成5端磷酸化的端磷酸化的cDNA第一
55、链；第一链；在在T4RNA连接酶的作用下将单链连接酶的作用下将单链cDNA环化或首环化或首尾相连；尾相连；用两对基因特异性引物：用两对基因特异性引物：A1、S1及及A2、S2分别分别进行二次进行二次PCR扩增得到所需目的片段扩增得到所需目的片段2） Clontech公司的公司的SMART 5 -RACE的原理的原理以以Oligo(dT)30MN作作为为锁锁定定引引物物在在反反转转录录酶酶M-MLV作用下，反转录合成标准第一链作用下，反转录合成标准第一链cDNA；利利用用该该反反转转录录酶酶具具有有的的末末端端转转移移酶酶活活性性，在在反反转转录录达达到到第第一一链链的的3末末端端时时自自动动加
56、加上上3-5个个(dC)残残基基，退退火火后后(dC)残残基基与与含含有有SMART寡寡核核苷苷酸酸序序列列Oliogo(dG)通通用用接接头头引引物物配配对对后后，转转换换为为以以SMART序列为模板继续延伸而连上通用接头序列为模板继续延伸而连上通用接头；然然后后用用一一个个含含有有部部分分接接头头序序列列的的通通用用引引物物UPM（Universal Primer）作作为为上上游游引引物物，用用一一个个 基基 因因 特特 异异 引引 物物 （ Gene Specific Primer，GSP）作作为为下下游游引引物物，PCR扩扩增增目目的的基基因因5末末端端的的cDNA片段片段3）Invi
57、trogen的的 GeneRACER 5 -RACE的原理的原理5 mRNA CAP3 Poly A tailFull-length mRNAm7 G-P-P-PAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAP/Truncated mRNAP/Non-mRNACIPm7 G-P-P-PAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA去磷酸化反应去磷酸化反应:利利用用碱碱性性磷磷酸酸酶酶(如如牛牛小小肠肠碱碱性性磷磷酸酸酶酶，CIP)处处理理，水水解解掉掉RNA 5末末端端的的磷磷酸酸。但但CIP不不能能破破坏坏mRNA5末末端端的帽子结构的帽子结构；去帽反应：去帽反应：利利 用用 烟烟 草草
58、 焦焦 磷磷 酸酸 酶酶 Tobacco Acid Pyrophosphatase （TAP）消化掉）消化掉mRNA5末端的帽子结构末端的帽子结构；m7 G-P-P-PAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAP/TAP 接头连接：接头连接：将将经经去去磷磷酸酸化化和和去去帽帽处处理理的的RNA转转入入另另一一PCR管管中中，加加入入RNA接接头头片片段段，在在RNA Ligase 作作用用下下，将将RNA Oligo接接头连接于去帽的头连接于去帽的mRNA5末端末端；AAAAAAAAAAAARNA LigaseRNA OligoAAAAAAAAAAAAP/ 反转录：反转录： 在反转录酶
59、的作用下，利用在反转录酶的作用下，利用Oligo(dT)反转录获得反转录获得cDNA;RTAAAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTTTAAAAAAAAAAAARNA OligoTTTTTTTTTTTTT 巢式巢式PCR： 利利用用接接头头的的通通用用引引物物UP（Universal Primer）和和基基因因特特异异引物，巢式引物，巢式PCR获得基因获得基因5片段。片段。UPGSP5cDNA 巢式巢式PCR扩增全长扩增全长cDNA：根根据据已已获获得得目目的的基基因因的的3序序列列和和5序序列列，设设计计基基因因特特异异的的巢式引物巢式引物5GSP和和3GSP，巢式，巢式PCR扩增扩增c
60、DNA全长全长序列。序列。TTTTTTTTTTTTT5GSP3GSPPCR差别杂交差别杂交 Differential hybridization扣除杂交扣除杂交 Substractive hybridization抑制性消减杂交抑制性消减杂交Suppression substractive hybrid差别显示差别显示 Differential display基因芯片技术基因芯片技术 Gene chips3 3、根据、根据mRNAmRNA的特异性分离目的基因的特异性分离目的基因v差别杂交差别杂交(Differential hybridization)又叫差别筛选又叫差别筛选(Different
61、ial screening)，适用于分离经特殊处理而被，适用于分离经特殊处理而被诱发表达的诱发表达的mRNA之之cDNA克隆。克隆。v差别杂交差别杂交的技术基础十分简单，它不需要任何有关的技术基础十分简单，它不需要任何有关目的基因的核苷酸序列信息，但重要的是要拥有两种目的基因的核苷酸序列信息，但重要的是要拥有两种不同的细胞群体。不同的细胞群体。3.1 3.1 差别杂交差别杂交1 1）差别杂交的操作程序）差别杂交的操作程序mRMAmRMAcDNA探针探针cDNA探针探针cDNAcDNA文库文库表达目的基因表达目的基因mRNA的细胞的细胞不表达目的基因不表达目的基因 mRNA的细胞的细胞原初平板原
62、初平板影印影印影印影印2 2）差别杂交的局限性）差别杂交的局限性差别杂交的灵敏度比较低，特别是对于那些低丰差别杂交的灵敏度比较低，特别是对于那些低丰度的度的mRNA而言，这个缺点就显得更为突出。而言，这个缺点就显得更为突出。差别杂交需要筛选大量的杂交滤膜，鉴定大量的差别杂交需要筛选大量的杂交滤膜，鉴定大量的噬菌斑或克隆片段，因此成本较高、工作量较大。噬菌斑或克隆片段，因此成本较高、工作量较大。由于两套平行转移的滤膜之间，由于两套平行转移的滤膜之间，DNA的保有量往的保有量往往会有差别，导致杂交信号的强度不一致，从而降往会有差别，导致杂交信号的强度不一致，从而降低了此法的可重复性。低了此法的可重
63、复性。不表达目的基因不表达目的基因的总的总mRNA表达目的基因表达目的基因的总的总mRNAcDNA杂交杂交DNA-RNA杂交分子杂交分子游离的单链游离的单链mRNA分子分子3.2 3.2 扣除扣除( (消减消减) )杂交杂交(Subtractive hybridization)差异分离程序差异分离程序 利用两组细胞利用两组细胞mRNAmRNA种类的差异，分离克隆差异种类的差异，分离克隆差异mRNAmRNA所对应的所对应的cDNAcDNA，因而这种程序较适用于分离克隆因而这种程序较适用于分离克隆新基因新基因 例如：例如：正常的大鼠正常的大鼠FR3T3FR3T3成纤维细胞成纤维细胞中，有些新基因中
64、，有些新基因是不能自发表达的，需在多瘤病毒感染之后方可转录。是不能自发表达的，需在多瘤病毒感染之后方可转录。任务是：任务是：分离克隆这些新基因，进而研究其生物学功能。分离克隆这些新基因，进而研究其生物学功能。 多瘤病毒感染的多瘤病毒感染的FR3T3FR3T3细胞细胞正常的正常的FR3T3FR3T3细胞细胞总总mRNAmRNA总总mRNAmRNAcDNAcDNA双链cDNA单链单链cDNAcDNA提取提取mRNAmRNA合成合成cDNAcDNA合成第二链合成第二链克隆克隆提取提取mRNAmRNA共价交联共价交联上柱上柱原位杂交原位杂交病毒诱导表达的基因病毒诱导表达的基因cDNAcDNA克隆克隆3
65、.3 3.3 抑制性消减杂交抑制性消减杂交(Suppression Subtractive Hybridization, SSH)FFSSHSSHSSHSSH的核心技术是抑制性的核心技术是抑制性的核心技术是抑制性的核心技术是抑制性PCRPCRPCRPCR，它是一种将检测子，它是一种将检测子，它是一种将检测子，它是一种将检测子cDNAcDNAcDNAcDNA单链标准化步骤和消减杂交步骤融为一体的技术；单链标准化步骤和消减杂交步骤融为一体的技术；单链标准化步骤和消减杂交步骤融为一体的技术；单链标准化步骤和消减杂交步骤融为一体的技术；FF抑制性抑制性抑制性抑制性PCRPCRPCRPCR是利用链内复性
66、优先于链间复性的原理，是是利用链内复性优先于链间复性的原理，是是利用链内复性优先于链间复性的原理，是是利用链内复性优先于链间复性的原理，是非目标序列片段两端的长反向重复序列在复性时产生非目标序列片段两端的长反向重复序列在复性时产生非目标序列片段两端的长反向重复序列在复性时产生非目标序列片段两端的长反向重复序列在复性时产生“ “锅柄样锅柄样锅柄样锅柄样” ”结构或结构或结构或结构或“ “发夹结构发夹结构发夹结构发夹结构” ”而无法与引物配对，而无法与引物配对，而无法与引物配对，而无法与引物配对，从而选择性地抑制了非目标序列的扩增。从而选择性地抑制了非目标序列的扩增。从而选择性地抑制了非目标序列的
67、扩增。从而选择性地抑制了非目标序列的扩增。(In excess)总总mRNA（B）总总mRNA（A）cDNAcDNA电泳，电泳，显影显影比较差异条带比较差异条带RT-PCR（加入已标记的加入已标记的dCTP)3.4 差别显示差别显示(Differential display)基因芯片基因芯片(gene chip)基因芯片又称为基因芯片又称为DNADNA微阵列微阵列(DNA microarray)，它是，它是指通过微电子技术和微加工技术将大量特定序列的探针指通过微电子技术和微加工技术将大量特定序列的探针有序地固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，有序地固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交
68、，通过杂交信号的强弱检测靶分子的一种检测工具。通过杂交信号的强弱检测靶分子的一种检测工具。基因芯片技术上的特点是具有基因芯片技术上的特点是具有高度可行性、多样性、高度可行性、多样性、微型化微型化和和自动化自动化四大特点。四大特点。激光共聚焦荧光扫描显微镜检测杂交信号激光共聚焦荧光扫描显微镜检测杂交信号 二、基于二、基于DNA插入作用的基因分离技术插入作用的基因分离技术1 1、原理：、原理：由于插入的由于插入的DNADNA序列相当于人为地给目的基因加上一个序序列相当于人为地给目的基因加上一个序列标签，因此用此列标签，因此用此DNADNA插入突变分离基因的技术又称为插入突变分离基因的技术又称为DN
69、A标签法标签法(DNA tagging).(DNA tagging).当一段特定的当一段特定的DNA序列插入到基因组中某一个基因的内序列插入到基因组中某一个基因的内部或其邻近位点时，便会诱发该基因发生突变，并最终导部或其邻近位点时，便会诱发该基因发生突变，并最终导致表型变化，形成突变体。如果此段致表型变化，形成突变体。如果此段DNA插入序列是已知插入序列是已知的，则可作为的，则可作为DNA杂交的分子探针，从突变体基因组杂交的分子探针，从突变体基因组DNA文库中筛选到突变基因。再以突变基因为探针，从其原始文库中筛选到突变基因。再以突变基因为探针，从其原始个体的基因组个体的基因组DNADNA文库中
70、筛选目的基因。文库中筛选目的基因。v利用转座子的转座作用使被插入的目的基因突变利用转座子的转座作用使被插入的目的基因突变 失去活性，而转座子的删除作用又可使目的基因失去活性，而转座子的删除作用又可使目的基因 复活。复活。2 2、转座子标签法（、转座子标签法（TransposonTransposon tagging) tagging)v根癌农杆菌中的根癌农杆菌中的TiTi质粒上的质粒上的T-DNAT-DNA区可转移入特区可转移入特定的宿主细胞中，并整合到基因组定的宿主细胞中，并整合到基因组DNADNA上，从而可上，从而可作为特定的标签序列。作为特定的标签序列。3 3、T-DNAT-DNA标签法（
71、标签法（T-DNA tagging)T-DNA tagging)三、基于基因图谱的基因分离技术三、基于基因图谱的基因分离技术v图位克隆图位克隆( (map-based cloningmap-based cloning) )又称定位克隆又称定位克隆( (positionalpositionalCloningCloning) )，19861986年首先由剑桥大学的年首先由剑桥大学的Alan CoulsonAlan Coulson提出提出。v用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的，无需预先知道基因的进行的，无需预先知道基因的DNA序列，也无
72、需预先知序列，也无需预先知道其表达产物的有关信息。道其表达产物的有关信息。1 1、原理：、原理： 在在利利用用分分子子标标记记技技术术对对目目的的基基因因进进行行精精确确定定位位的的基基础础上上，使使用用与与目目的的基基因因紧紧密密连连锁锁的的分分子子标标记记筛筛选选DNADNA文文库库，从从而而构构建建目目的的基基因因区区域域的的物物理理图图谱谱，再再利利用用此此物物理理图图谱谱通通过过染染色色体体步步行行逼逼近近目目的的基基因因或或通通过过染染色色体体登登陆陆的的方方法法最最终终找找到到包包含含该该目目的的基基因因的的克克隆隆，最最后后通通过遗传转化和功能互补验证最终确定目的基因的碱基序列
73、。过遗传转化和功能互补验证最终确定目的基因的碱基序列。 构建遗传分离群体：构建遗传分离群体：F F2 2、BCBC、DHDH、RILRIL找到与目标基因紧密连锁的分子标记；找到与目标基因紧密连锁的分子标记；用遗传作图和物理作图将目标基因定位在染色体的特定位置；用遗传作图和物理作图将目标基因定位在染色体的特定位置；构建含有大插入片段的基因组文库构建含有大插入片段的基因组文库(BAC(BAC或或YACYAC库库) )；以与目标基因连锁的分子标记为探针筛选基因组文库；以与目标基因连锁的分子标记为探针筛选基因组文库；用获得阳性克隆构建目的基因区域的跨叠群；用获得阳性克隆构建目的基因区域的跨叠群；通过染
74、色体步行、登陆获得含有目标基因的大片段克隆；通过染色体步行、登陆获得含有目标基因的大片段克隆；通过亚克隆获得带有目的基因的小片段克隆；通过亚克隆获得带有目的基因的小片段克隆；通过遗传转化和功能互补验证最终确定目标基因的碱基序列。通过遗传转化和功能互补验证最终确定目标基因的碱基序列。2 2、图位克隆图位克隆基本程序基本程序高密度的分子标记图谱高密度的分子标记图谱3 3、要求：、要求：与目的基因紧密连锁的分子标记与目的基因紧密连锁的分子标记高质量的基因组高质量的基因组DNADNA文库文库v连锁分析需要依赖特定的序列作为连锁分析需要依赖特定的序列作为连锁标记，连锁标记，即即标记序列与待研基因之间存在
75、连锁关系，而满足与标记序列与待研基因之间存在连锁关系，而满足与待研基因相连锁的标记实在太少，所以连锁分析对待研基因相连锁的标记实在太少，所以连锁分析对克隆大多数基因存在着一定的困难。克隆大多数基因存在着一定的困难。RFLPRFLP的出现使多态性基因标记存在于整个基因组内，的出现使多态性基因标记存在于整个基因组内，解决了连锁分析中难以克服的困难。解决了连锁分析中难以克服的困难。 19801980年年WymanWyman等科学家首次建立了限制酶切片段长度等科学家首次建立了限制酶切片段长度多态性多态性RFLPRFLP( (restrictionrestriction fragment length
76、polymorphism fragment length polymorphism) )，使对任何一种表型相关的基因的定位成为可能使对任何一种表型相关的基因的定位成为可能。v其它常用是分子标记其它常用是分子标记 随机扩增多态性随机扩增多态性DNA DNA ( (Random Amplified Ploymorphic DNA, RAPD ) )由由WilliamsWilliams等于等于19901990年创立。此技术建立于年创立。此技术建立于PCRPCR基础之上，基础之上，使用一系列具有使用一系列具有1010个左右碱基的随机引物，对基因组的个左右碱基的随机引物，对基因组的DNADNA进行进行P
77、CRPCR扩增，以检测其多态性；扩增，以检测其多态性；由于整个基因组中存在众多由于整个基因组中存在众多反向重复序列，反向重复序列，因此，单一引物因此，单一引物可与反向重复序列结合，使重复序列之间的区域得以扩增其多可与反向重复序列结合，使重复序列之间的区域得以扩增其多态性；态性；引物结合位点引物结合位点DNADNA序列的改变，以及两扩增点之间序列的改变，以及两扩增点之间DNADNA碱基的碱基的缺失、插入或置换均可导致扩增片段数目和长度的差异，从而缺失、插入或置换均可导致扩增片段数目和长度的差异，从而表现出多态性；表现出多态性；简单重复序列简单重复序列（Simple sequence repeat
78、s，简称，简称SSR）在生物基因组中，均存在着许多由在生物基因组中，均存在着许多由2-52-5个碱基对组成的个碱基对组成的简单重复序列，或称微卫星简单重复序列，或称微卫星DNADNA(Microsatellite Repeat)、如如( (GA)n,(AC)n,(GAA)nGA)n,(AC)n,(GAA)n（其中（其中n n为重复次数）等；为重复次数）等；微卫星微卫星DNADNA其两端的序列其两端的序列高度保守，高度保守，可设计双引物进行可设计双引物进行PCRPCR扩增，揭示其多态性。扩增，揭示其多态性。 SSR标记扩增片段长度多态性扩增片段长度多态性（Amplified Fragment L
79、ength Polymorphism，AFLP）由由ZabeauZabeau和和VosVos于于19931993年发明。扩增片段长度多态性，年发明。扩增片段长度多态性，又称选择性限制片段扩增先将又称选择性限制片段扩增先将DNADNA用内切酶酶解，然后用内切酶酶解，然后接上接头，根据接头的序列和酶切位点设计引物接上接头，根据接头的序列和酶切位点设计引物, ,进行进行特异性特异性PCRPCR扩增；扩增；该技术结合了该技术结合了RFLPRFLP的稳定性和的稳定性和PCRPCR技术的简便高效性，技术的简便高效性，同时又能克服同时又能克服RFLPRFLP带型少、信息量小以及带型少、信息量小以及RAPDR
80、APD技术不稳技术不稳定的缺点，是一种十分理想和高效的遗传标记。定的缺点，是一种十分理想和高效的遗传标记。AFLP 标记High percentage of polymorphic bandsNo prior sequence knowledge requiredHighly reproducible AFLP fingerprints Genome surveySaturation of target geneSTSSTS由由OlsonOlson于于19891989年开发成功。年开发成功。STSSTS是指基因组中长度是指基因组中长度为为200-500bp,200-500bp,且核苷酸顺序已知
81、的单拷贝序列且核苷酸顺序已知的单拷贝序列, ,通过通过PCRPCR可将其专一扩增出来，电泳显示扩增产物多态性；可将其专一扩增出来，电泳显示扩增产物多态性；序列标志位点序列标志位点 (Sequence Tagged Sites，STS)STSSTS通过设计特定的引物，使其与基因组通过设计特定的引物，使其与基因组DNADNA序列中特定序列中特定结合位点结合，从而可用来扩增基因组中特定区域，分析结合位点结合，从而可用来扩增基因组中特定区域，分析其多态性；其多态性；其最大优点是：产生信息非常可靠。其最大优点是：产生信息非常可靠。SNPSNP标记是美国学者标记是美国学者Lander E.Lander E
82、.于于19961996年提出的第三代年提出的第三代DNADNA遗传标记。遗传标记。SNPSNP是指同一位点的不同等位基因之间仅是指同一位点的不同等位基因之间仅有个别核苷酸的差异或只有小的插入、缺失等。从分子有个别核苷酸的差异或只有小的插入、缺失等。从分子水平上对单个核苷酸的差异进行检测，水平上对单个核苷酸的差异进行检测，SNPSNP标记可帮助标记可帮助区分两个个体遗传物质的差异；区分两个个体遗传物质的差异；单单核苷酸多态性核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)SNPSNP的分布密集，在人类基因组中被认为有的分布密集，在人类基因组中被认为有30030
83、0万个以万个以上的上的SNPSNP遗传标记遗传标记, ,这可能达到了人类基因组多态位点数这可能达到了人类基因组多态位点数目的极限，因此被认为是应用前景最好的遗传标记物目的极限，因此被认为是应用前景最好的遗传标记物。以含有最靠近目的基因的分子标记的基因组以含有最靠近目的基因的分子标记的基因组DNADNA克隆作为起始克隆，选末端序列作为探针克隆作为起始克隆，选末端序列作为探针, ,从基因从基因组组DNADNA文库中筛选出与起始克隆具有重叠序列的新文库中筛选出与起始克隆具有重叠序列的新克隆，依此向目的基因方向移动克隆，依此向目的基因方向移动, ,最终将含目的基最终将含目的基因的克隆筛选出来。因的克隆
84、筛选出来。4 4、染色体步移、染色体步移 (Chromosome walking)：本章要点本章要点1. 概念概念基因基因文文库库鸟枪法鸟枪法4) 使用使用PCR法克隆目的基因的前提条件法克隆目的基因的前提条件2. 简答简答1)鸟枪法克隆目的基因的局限性鸟枪法克隆目的基因的局限性基因库基因库2) cDNA第二链的合成方法第二链的合成方法 3) cDNA法克隆目的基因的局限性法克隆目的基因的局限性基因文库的完备性基因文库的完备性简并引物简并引物基因芯片基因芯片7) 基因文库的质量标准基因文库的质量标准8) 在基因组文库的构建过程中，在基因组文库的构建过程中，避免外源避免外源DNA 片段之间的连接的措施片段之间的连接的措施5) 化学合成法的三种基本战略化学合成法的三种基本战略6) DNA化学合成的用途化学合成的用途
