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1、 基因的定位克隆1.千奇百怪的突变体这些突变体是怎么产生的呢？这些突变体是怎么产生的呢？突变体突变体:是某个性状发生可遗传变异的材料，或某个基因发生突变的材料。水水稻稻2 基因定位基因定位基因定位基因定位（mapping）：是用一定的方法将基因确定到染色体上的实际位是用一定的方法将基因确定到染色体上的实际位是用一定的方法将基因确定到染色体上的实际位是用一定的方法将基因确定到染色体上的实际位置。置。置。置。3一、连锁分析（一、连锁分析（Linkage analysisLinkage analysis）1 1）概念：）概念： 基因定位的连锁分析是根据基因在染色体上呈直线排列，不同基因相基因定位的连
2、锁分析是根据基因在染色体上呈直线排列，不同基因相互连锁成连锁群的原理，即应用被定位的基因与同一染色体上另一基因或互连锁成连锁群的原理，即应用被定位的基因与同一染色体上另一基因或遗传标记相连锁的特点进行定位。遗传标记相连锁的特点进行定位。42 2）重组值（）重组值（recombination fractionrecombination fraction） 是基因定位时两个基因间遗传图距的量度，即基因间的遗传距离。如果两个基因间有1%的重组值，其遗传图的距离为1厘摩。（centimorgancentimorgan，cMcM）交交换值换值(RF)(%)=重组型的配子数重组型的配子数/总配子数总配子数
3、100% 重组值越大，说明两基因间的距离越远，基因间的连锁强度越小；重组值重组值越大，说明两基因间的距离越远，基因间的连锁强度越小；重组值越小，说明基因间的距离越近，基因间的连锁强度越大。越小，说明基因间的距离越近，基因间的连锁强度越大。5 5 3）遗传标记（）遗传标记（genetic marker） 用连锁分析发法进行基因定位需要已知的用连锁分析发法进行基因定位需要已知的DNA序列作为遗传标记，这些标记按孟序列作为遗传标记，这些标记按孟德尔方式遗传，标记位点应是多态的。德尔方式遗传，标记位点应是多态的。 4）遗传多态性：是指在一个遗传座位上具有一个以上的等位基因，且各个等位基）遗传多态性：是
4、指在一个遗传座位上具有一个以上的等位基因，且各个等位基因在群体中出现的频率皆高于因在群体中出现的频率皆高于1%。6 6二、三点测交(three-pointtestcross)与染色体作图 为了进行基因定位，摩尔根和他的学生Sturtevant创造了三点测交方法，即将3个基因包括在同一次交配中。进行这种测交，一次实验就等于3次两点试验。 已知在果蝇中棘眼(ec)、截翅(ct)和横脉缺失(cv)这3个隐性突变基因都是X连锁的。把棘眼、截翅个体与横脉缺失个体交配,得到3个基因的杂合体ec ct +/+ + cv (ec、ct、cv的排列不代表它们在X染色体的真实顺序)，取其中3杂合体雌蝇再与3隐性体
5、ec ct cv/Y雄蝇测交，测交后代如下表。7 7序号表型实得数1ec ct +2125亲本型2+ + cv22073ec + cv273单交换I型4+ ct +2655ec + +217单交换II型6+ ct cv2237+ + +5双交换型8ec ct cv3合计5318ec ct +/ + + cv ec ct cv/Y测交后代数据8 8结果分析1、归类2、确定正确的基因顺序 用双交换型与亲本类型相比较，发现改变了位置的那个基因一定是处于中央的位置，因为双交换的特点是旁侧基因的相对位置不变，仅中间的基因发生变动。于是可以断定这3 个基因正确排列顺序是ec cv ct。亲本型ec ct
6、+ + cv双交换型+ + +ec ct cv9 9ec ct + + cvec + ct+ cv +ct ec + + cvec + + ct cvec cv ct+ + +ct + + ec cv10103、计算重组值，确定图距(1)、计算ctcv的重组值 忽视表中第一列(ec/+)的存在，将它们放在括弧中，比较第二、三列：(ec) ct +2125非重组(+) + cv2207(ec) + cv273非重组(+) ct +265(ec) + +217重组(+) ct cv223(+) + +5重组(ec) ct cv3ctcv间重组率=(217+223+5+3)/5318=0.084=8
7、.4%=8.4cM1111(3)、计算ecct的重组值 忽视表中第三列(+/cv)的存在，将它们放在括弧中，比较第一、二列：ec ct (+)2125非重组+ + (cv)2207ec + (cv)273重组+ ct (+)265ec + (+)217重组+ ct (cv)223+ + (+)5非重组ec ct (cv)3ecct间重组率=(273+265+217+223)/5318=18.4%=18.4cM1212(2)、计算eccv的重组值 忽视表中第二列(ct/+)的存在，将它们放在括弧中，比较第一、三列：ec (ct) +2125非重组+ (+) cv2207ec (+) cv273重
8、组+ (ct) +265ec (+) +217非重组+ (ct) cv223+ (+) +5重组ec (ct) cv3eccv间重组率=(273+265+5+3)/5318=10.2%=10.2cM13134、绘染色体图eccvct10.28.418.418.6在计算eccv和cvct的重组值时都利用了双交换值，可是计算ecct时没把它计在内，因为它们间双交换的结果并不出现重组。所以ecct之间的实际双交换值应当是重组值加2倍双交换值。即18.4%+20.1%=18.6%。当三点测交后代出现8种表型时,表明有双交换发生,此时需用2倍双交换值来作校正。若3个基因相距较近，往往不出现双交换类型,后
9、代只有6种表型,无需校正。标记标记1标记标记2目标基因目标基因1414 三、图位克隆 图位克隆（map-based cloning）又称定位克隆，该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行基因克隆的一种方法，其原理是根据功能基因在基因组中都有相对稳定的基因座，在利用分子标记技术对目的基因进行精确定位的基础上，使用与目的基因紧密连锁的分子标记筛选DNA文库，从而构建的基因区域的物理图谱，再利用此物理图谱通过染色体步行（chromosome walking）逼近目的基因或通过染色体登陆（chromosome landing）（Tanksley et al.，1995）的方法最终找到包含目的基
10、因的克隆，最后通过遗传转化和功能互补验证最终确定目的基因的碱基序列。15 图位克隆的特点是无需预先知道基因的DNA顺序，也无需预先知道其表达产物的有关信息，但应有以下两方面两方面的基本情况。 一是一是有一个根据目的基因的有无建立起来的遗传分离群体,即定位群体，如：F2、DH、BC、RI等。1616 二是二是开展以下几项工作：（1）首先找到与目的基因紧密连锁的分子标记；（2）用遗传作图和物理作图将目标基因定位在染色体上的特定位置；（3）构建含有大插入片段的基因组文库；（BAC或YAC）；（4）以与目的基因连锁的分子标记为探针筛选基因组文库；（5）用获得阳性克隆构建目的基因区域的重叠群；（6）通过
11、染色体步行、登陆或跳跃获得带有目的基因的大片段克隆；（7）通过亚克隆获得带有目的基因的小片段克隆；（8）通过遗传转化和功能互补验证最终确定目标基因的碱基序列1717M1M2构建遗传图谱构建物理图谱染 色 体 步 移 ： Chromosome Walking 筛选基因组文库序列分析与功能鉴定对于基因组还未测序的物种可通过染色体步移的方法进行定位，但是对于基因组还未测序的物种可通过染色体步移的方法进行定位，但是比较费时费力，而对于水稻、拟南芥等基因组测序工作已经完成的物比较费时费力，而对于水稻、拟南芥等基因组测序工作已经完成的物种，则不在利用染色体步移的方法进行定位，直接从构建遗传图谱到种，则不在
12、利用染色体步移的方法进行定位，直接从构建遗传图谱到构建物理图谱，最后确定目标基因的候选基因，再通过互补实验进行构建物理图谱，最后确定目标基因的候选基因，再通过互补实验进行验证。验证。1818四、分子标记n分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接的反映。n现在DNA分子标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。 19分子标记的种类 n一、基于分子杂交技术的分子标记技术一、基于分子杂交技术的分子标记技术：限制性片断长度多态性限制性片断长度多态性(Restriction Fragment
13、 Length Polymorphism(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLPRFLP) )n二、基于二、基于PCRPCR技术的分子标记技术：技术的分子标记技术：随机扩增多态性随机扩增多态性DNA (Random DNA (Random Amplified Polymorphism DNAAmplified Polymorphism DNA，RAPDRAPD ) )简单重复序列简单重复序列(Simple (Simple Sequence RepeatSequence Repeat，SSRSSR) )n三、基于限制性酶切和三、基于限制性酶切和
14、PCRPCR技术的技术的DNADNA标记标记 ：扩增片段长度多态性扩增片段长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphism(Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLPAFLP ) ) n四、基于四、基于DNADNA芯片技术的分子标记技术芯片技术的分子标记技术 ：核苷酸多态性核苷酸多态性(Single (Single Nucleotide PolymorphismNucleotide Polymorphism，SNPSNP) ) 20 SSR即微卫星DNA，是一类由几个（多为1-5个）碱基组成的基序（motif）
15、串联重复而成的DNA序列，其长度一般较短，广泛分布于基因组的不同位置，如（CA）n、（AT）n、（GGC）n等重复。不同遗传材料重复次数的可变性，导致了SSR长度的高度变异性，这一变异性正是SSR标记产生的基础。尽管微卫星DNA分布于整个基因组的不同位置，但其两端序列多是保守的单拷贝序列，因此可以根据这两端的序列设计一对特异引物，通过PCR技术将其间的核心微卫星DNA序列扩增出来，利用电泳分析技术就可获得其长度多态性，即SSR标记。 SSR21五、基因初步定位 目的基因的初步定位(mapping the target gene)是利用分子标记技术在一个目标性状的分离群体中把目的基因定位于染色体
16、的一定区域内。 初定位通常使用近等基因系法(near-isogenic lines, NILs)或群组分离分析法(bulk segregant analysis, BSA)。22n近等基因系是指只有目标性状基因有差异，其它性状基因相同的2个群体，可以通过连续回交的途径获得。n由于近等基因系需要连续的回交，所需的时间较长，因此Michelmore等(1991)提出了群组分离分析法（BSA法），将分离群体中研究的目标性状根据其类型(如抗病、感病)分成2组，将每组内一定数量的植株DNA 等量混合，形成两个池，这两个池仅在目标性状(如抗病性)上有差异。利用分子标记技术寻找两个池的扩增谱带的差异，这种多
17、态性极可能与目标基因连锁。再用所有的分离后代单株，验证该多态性是否真正与目标基因连锁及连锁距离的确定。23六、精细定位 在初步定位基础上，设计并筛选离亲本更近且在两亲本之间表现多态性的引物，然后利用F2群体中的突变体检测筛选到的亲本间多态性引物，逐步缩小范围，将目的基因定位到染色体上一个很小的物理区间内。24 举例说明：利用SSR标记进行水稻drawf1基因的定位25基本实验方法nF2定位群体构建n植物总DNA的提取nPCR反应n聚丙烯酰胺凝胶电泳n引物设计26F2群体构建2727引物设计常用软件及网站设计软件： primer3.0primer5.0（寻找酶切位点，设计引物）Webprimer
18、序列分析软件：DNAstar（分析序列特征，引物质量，编辑序列）2828基因的初步定位（BSA法）筛选亲本间多态性引物筛选池间多态性引物 小群体验证2929初步定位带型分析正常亲本突变亲本突变池正常池RM1（亲本之间有多态，池间无多态）30RM2(亲本和池之间均有多态）正常亲本突变亲本突变池正常池31 总结：如果亲本与池之间同时存在多态性的引物很有可能和目标基因连锁，因此再通过小群体进行验证（重组交换值应该小于50%），则可将目标基因定位到与其连锁的标记所在的染色体上。我们初步定位的结果是否准确呢？接下来就要用我们初步定位的结果是否准确呢？接下来就要用一些突变体进行验证，看一下我们所选定的标记
19、与目一些突变体进行验证，看一下我们所选定的标记与目标基因是否真正连锁标基因是否真正连锁32遗传距离=（单交换+双交换2）/（突变体总数 2） 100引物名称连锁植株数目单交换植株数目双交换植株数目RM1150191RM2158111RM316280RM4155150怎样判断目标基因与这些标记之间的位置关系及距离远近呢？怎样判断目标基因与这些标记之间的位置关系及距离远近呢？33 A P + - 5 10 18A P + - 6 11 12 16RM2RM334 交换率越高的标记离目标基因越远，反之离目标基因越近，即对应的交换株越多的标记离目标基因远，交换株越少的标记离目标基因越近。35RM1RM
20、2drawf1RM3RM43.8cM2.4cM2.4cM2.0cMCHR.6MarkerDist.(cM)目标基因所在区域的分子标记连锁图目标基因所在区域的分子标记连锁图3636精细定位扩大定位群体设计离目标基因更近的分子标记，并筛选在两亲本之间存在多态性的分子标记用筛选出的多态性标记引物检测定位群体，最终将目标基因锁定在一个较小的物理区间内37目标基因所在染色体上相应区段的跨叠BAC克隆群38七、候选基因的确定 方法（1）查阅相关资料，比较分析定位区间内基因的同源基因的功能，在其它物种是否引起相同或相似的表型，找到最有可能的候选基因；（2）进行mRNA水平的分析，看其表达在正常植株与突变体中
21、是否发生了改变，如长度变化，表达量变化等；（3）进行序列测定，比较该基因在正常植株内与突变体内核酸序列和氨基酸序列是否发生了改变；（4）进行互补实验验证候选基因是否为目标基因。39RT-PCR（1）提取正常植株与突变体的总RNA（2）RT-PCR（3）琼脂糖凝胶电泳分析，观察候选基因表达量是否不同及产物大小是否不同。候选基因mRNA水平分析长度发生变化表明什长度发生变化表明什么？么？表达量增加、或降低则表明表达量增加、或降低则表明什么？什么？40 序列测定RT-PCRPCR产物连接到T载体转化大肠杆菌送测序公司测序41互补实验n构建互补载体n遗传转化突变体n观察突变表型是否恢复42n引物设计nDNAstarnNCBInTIGRnGRAMENE相关软件及网站的使用简单介绍相关软件及网站的使用简单介绍43谢谢！谢谢！44
