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1、 主讲：郑萍主讲：郑萍 高级工程师，高级工程师， 执业药师执业药师化学化工学院化学化工学院1 液液相相色色谱谱分分析析是是在在经经典典的的液液体体柱柱色色谱谱基基础础上上，引引入入了了气气相相色色谱谱的的理理论论；在在技技术术上上采采用用了了高高压压泵泵、高高效效固固定定相相和和高高灵灵敏敏度度检检测测器器，实实现现了了分分析析速速度度快快、分分离离效效率率高高和和操操作作自自动动化化，这这种种柱柱色色谱谱技技术被称做高效液相色谱法。术被称做高效液相色谱法。2慢慢中等中等快快色谱分离色谱分离色谱分离色谱分离Temporal course淋洗液淋洗液3 叶绿素的柱色谱叶绿素的柱色谱4三组分混合物
2、的分离三组分混合物的分离5在在C18C18柱中，三组分混合物流出色谱柱中，三组分混合物流出色谱柱的顺序为：萘，联二苯、蒽。柱的顺序为：萘，联二苯、蒽。 当试样混合物进入色谱柱后，就在固定相和流动当试样混合物进入色谱柱后，就在固定相和流动相之间不断地进行分配平衡。不同的化合物，分子相之间不断地进行分配平衡。不同的化合物，分子结构不同，存在理化性质的差异，所以在两相中存结构不同，存在理化性质的差异，所以在两相中存在的浓度也各不相同。固定相中存在量多的化合物，在的浓度也各不相同。固定相中存在量多的化合物，冲洗出柱子的时间就长，反之则短。这与分配系数冲洗出柱子的时间就长，反之则短。这与分配系数有关：有
3、关： K K = = 化合物在固定相中的浓度化合物在固定相中的浓度C C固固 化合物在流动相中的浓度化合物在流动相中的浓度C C流流 K K值小，先流出柱子，值小，先流出柱子，K K值大的，保留作用强，后值大的，保留作用强，后流出柱子。流出柱子。67 键合相键合相-反相色谱反相色谱81. 概 述色谱法：色谱法：(chromatography)(chromatography)： 以试样组分在固定相和流动相间的溶解、以试样组分在固定相和流动相间的溶解、吸附、分配、离子交换或其他亲和作用的差吸附、分配、离子交换或其他亲和作用的差异为依据而建立起来的各种分离分析方法称异为依据而建立起来的各种分离分析方
4、法称色谱法。色谱法。几个概念几个概念色谱柱：进行色谱分离用的细长管。色谱柱：进行色谱分离用的细长管。固定相：管内保持固定相：管内保持固定、起分离固定、起分离作用的填充物。作用的填充物。流动相：流经固定相的空隙或表面的冲洗剂。流动相：流经固定相的空隙或表面的冲洗剂。91-4 1-4 高效液相色谱法的特点高效液相色谱法的特点一一 高压高压 液液相相色色谱谱以以液液体体作作为为流流动动相相（称称为为载载液液），液液体体流流经经色色谱谱柱柱时时，受受到到的的阻阻力力较较大大，为为了了能能迅迅速速地地通通过过色色谱谱柱柱，必必须须对对载载液液施施加加高高压压。在在现现代代液液体体色色谱谱中中供供液液压压
5、力力和和进进样样压压力力都都很很高高，一一般般可可达达到到150300kgcm2，甚甚至至可可达达700kcm2以上。以上。10二二 高速高速 高效液相色谱所需的分析时间较之经高效液相色谱所需的分析时间较之经典液体色谱快得多，一般可达典液体色谱快得多，一般可达l10mLmin， 个别可高达个别可高达100mLmin以上，这以上，这已近似于气相色谱的流速。已近似于气相色谱的流速。 三三 高效高效 气相色谱的分离效能很高，高效液相气相色谱的分离效能很高，高效液相色谱的柱效则更高，一般约可达色谱的柱效则更高，一般约可达 60000理理论塔板米论塔板米；11四四 高灵敏度高灵敏度 紫紫外外检检测测器器
6、的的最最小小检测测量量可可达达毫毫微微克克数数量量级级(10-9 g)；荧荧光光检检测测器器的的灵灵敏敏度度可可达达10-11g。高高效效液液相相色色谱谱的的高高灵灵敏敏度度还还表表现现在在所所需需试试样样很很少少；微微升升数数量量级级的的样样品品就就足足以以进行全分析。进行全分析。 121-5 1-5 高效液相色谱流程和设备高效液相色谱流程和设备 高效液相色谱仪一般可分为高效液相色谱仪一般可分为5 5个主要部分：个主要部分：高压输液系统，进样系统，分离系统和检测系高压输液系统，进样系统，分离系统和检测系统。统。此外还配有此外还配有辅助装置辅助装置：如梯度淋洗，自动：如梯度淋洗，自动进样及进样
7、及数据处理数据处理等。其工作过程如下：等。其工作过程如下： 首先高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进首先高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器送入色谱柱，然后从控制器的出口流出。样器送入色谱柱，然后从控制器的出口流出。当注入欲分离的样品时，流经进样器贮液器的当注入欲分离的样品时，流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分离，然后流动相将样品同时带入色谱柱进行分离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器送出依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器送出的信号记录下来，由此得到液相色谱图。的信号记录下来，由此得到液相色谱图。 1314样品吸收度测定吸收池示图15紫外检测器工作原理紫外检测器工作原理1
8、617 开始分析开始分析开始分析开始分析 废废液液样样品品 淋洗液淋洗液 至分离柱至分离柱进样阀进样阀 样样品品 装装装装样样样样 废废液液 淋洗液淋洗液至分离柱至分离柱 定量定量环进样环进样（）（）（）（） 样样品品环环18液相色谱动画演示液相色谱动画演示19二、色谱图二、色谱图（chromatogramchromatogramchromatogramchromatogram） 试样中各组分经色谱柱分离后，按先后次序试样中各组分经色谱柱分离后，按先后次序经过检测器时，检测器就将流动相中各组分浓度经过检测器时，检测器就将流动相中各组分浓度变化转变为相应的电信号，由记录仪所记录下的变化转变为相应
9、的电信号，由记录仪所记录下的信号信号时间曲线或信号时间曲线或信号流动相体积曲线，流动相体积曲线，称为色谱流出曲线，或色谱图。如图称为色谱流出曲线，或色谱图。如图12-212-2常用术语：常用术语：1. 1. 基线基线 : : 在操作条件下，仅有在操作条件下，仅有纯流动相纯流动相进入进入检测器时的流出曲线。检测器时的流出曲线。202. 2. 色谱峰色谱峰: : 当组分随流动相进入检测当组分随流动相进入检测器时，其响应信号大小随时间变化所形器时，其响应信号大小随时间变化所形成的峰形曲线。正常的色谱峰呈正态分成的峰形曲线。正常的色谱峰呈正态分布布。3 3 3 3. .峰高与峰面积峰高与峰面积峰高：色
10、谱峰顶点与峰底之间的垂直距峰高：色谱峰顶点与峰底之间的垂直距离称为峰高离称为峰高(peak height)(peak height)。用。用h h表示。表示。峰面积：峰与峰底之间的面积称为峰面峰面积：峰与峰底之间的面积称为峰面积积(peak area)(peak area)，用，用A A表示。表示。2121 保保 留留 值值 一、保留时间（一、保留时间（tR） 从从进进样样开开始始到到柱柱后后出出现现样样品品的的浓浓度度极极大大值所需的时间为保留时间，用值所需的时间为保留时间，用tR表示。表示。222-2 2-2 色谱柱的分离效率及柱效能的评价色谱柱的分离效率及柱效能的评价 一、塔板理论一、塔
11、板理论 塔板理论认为，一根柱子可以分为塔板理论认为，一根柱子可以分为n段，段，在每段内组分在两相间很快达到平衡，把每在每段内组分在两相间很快达到平衡，把每一段称为一块理论塔板。设柱长为一段称为一块理论塔板。设柱长为L，理论塔，理论塔板高度为板高度为H，则，则 H=L/n式中式中n为理论塔板数。为理论塔板数。23 色色谱谱柱柱的的分分离离效效率率（简简称称柱柱效效），可定量地用理论塔板数可定量地用理论塔板数N来表示。来表示。 理论塔板数一理论塔板数一N还与柱长有关，当还与柱长有关，当比较两不同长度的色谱柱的柱效时，比较两不同长度的色谱柱的柱效时，应当比较它们在相同柱长下的应当比较它们在相同柱长下
12、的V值。值。24 可可用用半半峰峰高高处处的的峰峰宽宽(半半峰峰宽宽）和和保保留留时时间间的关系来表示理论塔板数的关系来表示理论塔板数N，这时关系式为：，这时关系式为： N554 ( tR / Wt1/2 ) 2 2式中式中： Wt1/2 -半峰宽半峰宽例例如如，从从图图2-3，测测得得tR=105mm、 Wt1/2 =4mm，求求得得N=3789，若若此此柱柱长长为为250mm,折折成成每每米米的的理理论论塔板数约为塔板数约为15200. 252-3 分离度及影响因素分离度及影响因素一一 分离度（分辨率分离度（分辨率) 研究色谱中有关分离问题时，首先就研究色谱中有关分离问题时，首先就是要能定
13、量地确定相邻两峰的分离程度。是要能定量地确定相邻两峰的分离程度。 从从图图8-3可可以以看看出出，为为了了获获得得较较好好的的分分离离，就就必必须须使使最最大大峰峰值值之之间间的的距距离离增增加加，峰宽减小。峰宽减小。2627 一一般般用用Rs来来定定量量表表达达相相邻邻两两峰峰的的分分离离程程度度，所所以以Rs是是色色谱谱中中两两个个组组分分分分离离好好坏坏程度的标志。要求程度的标志。要求RS1.5 tR1 tR2 Rs = 1/2(W1+W2) 式中式中 tR1、tR2 分别为两组分的保留时间，分别为两组分的保留时间， W1 、W2为色谱峰的峰底宽度为色谱峰的峰底宽度 . 285 5 高效
14、液相色谱的定性和定量分析高效液相色谱的定性和定量分析 5-1 5-1 定性分析定性分析 在液相色谱中保留值定性的方法主要是用在液相色谱中保留值定性的方法主要是用直接与已知标准物对照的方法。当未知峰的直接与已知标准物对照的方法。当未知峰的保留值（保留值（t Rt R或或V R V R ）与某一已知标准）与某一已知标准物完全相同时，则未知峰可能与此已知标准物完全相同时，则未知峰可能与此已知标准物是同一物质，特别是在改变色谱柱或改变物是同一物质，特别是在改变色谱柱或改变洗脱液的组成时，未知峰的保留值与已知标洗脱液的组成时，未知峰的保留值与已知标准物的保留值仍能完全相同，则可以基本上准物的保留值仍能完
15、全相同，则可以基本上认定未知峰与标准物是同一物质。认定未知峰与标准物是同一物质。 295-2 5-2 定量分析定量分析 HPLC色谱定量的基本方法有色谱定量的基本方法有内标内标法、外标法等。法、外标法等。 外标法外标法标准曲线法标准曲线法 是是一一种种简简便便、快快速速的的绝绝对对定定量量方方法法（归归一一化化法法则则是是相相对对定定量量方方法法）。首首先先用用欲欲测测组组分分的的标标准准样样品品绘绘制制标标准工作曲线准工作曲线。30具体作法是具体作法是： 用用标标准准样样品品配配制制成成不不同同浓浓度度的的标标准准系系列列，在在与与欲欲测测组组分分相相同同的的色色谱谱条条件件下下，等等体体积
16、积准准确确量量进进样样，测测量量各各峰峰的的峰峰面面积积或或峰峰高高，用用峰峰面面积积或或峰峰高高对对样样品品浓浓度度绘绘制制标标准准工工作作曲曲线线，此此标标准准工工作作曲曲线线应应是是通通过过原原点点的的直直线线。若若标标准准工工作作曲曲线线不不通通过过原原点点，说说明明测测定定方方法法存存在在系系统统误误差差。标标准准工工作作曲曲线线的的斜斜率即为绝对校正因子。率即为绝对校正因子。31 目前已普及于几乎所有重要的分析学科目前已普及于几乎所有重要的分析学科领域和许多科研生产部门，高效液相色谱能领域和许多科研生产部门，高效液相色谱能较理想地分离和分析与生物医学有关的大分较理想地分离和分析与生
17、物医学有关的大分子和离子型物质，易变质的天然产物，各种子和离子型物质，易变质的天然产物，各种高分子化合物和不稳定化合物。高分子化合物和不稳定化合物。 例如例如：蛋白质、核酸、氨基酸、多糖、颜蛋白质、核酸、氨基酸、多糖、颜料极性类脂肪化合物、药物、染料、表面料极性类脂肪化合物、药物、染料、表面活性剂、农药、甾族化合物、多环芳烃、活性剂、农药、甾族化合物、多环芳烃、合成聚合物、瞟吟、维生素、除锈剂、防合成聚合物、瞟吟、维生素、除锈剂、防老剂等等。老剂等等。 32 高高效效液液相相色色谱谱，特特别别适适用用于于分分离离沸沸点点高高和和热热稳稳定定性性差差的的物物质质，目目前前已已广广泛泛用用于于化化工工、食食品品、医医药药、生生化化、卫卫生生、环环境境保保护护和和高高能能化化合合物物等等生生产和科研工作中产和科研工作中。 33 3435363738紫杉醇的分析紫杉醇的分析3940农药的分析农药的分析4142
