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1、背景介绍1背景介绍生物易被环境中过量的污染物或自然物质影响，这些影响可能表现在如下几个方面：1）生物群落中种群结构或者优势种群的改变；2）群落中种群多样化的改变；3）生物群体中死亡率增加，特别是早期发育的敏感期如卵和幼虫阶段；4）个体生理和行为的改变；5）个体形态学和组织学出现问题；6）个体的组织中积累污染物或者代谢物。2背景介绍生物指示物（Bioindicators）自上世纪70年代污染生态学中出现并一直沿用至今。最初只是将耐污的生物物种成为指示生物（Indicator species 或Bioindicators），随着污染生态学的野外研究和实验室毒性试验阶段，逐渐将生物指示物的应用范围扩
2、大至污染生态学的不同生物学组织层次，小至分子水平，大至生态系统结构与功能，包括发生在分子、生物化学、生理、病理组织、生物个体、种群、群落和生态系统等不同生物学组织水平上的生物学效应。3背景介绍生物监测技术诞生于20世纪初，由Cairns和Schalie最先提出“生物监测革命”口号，指出了其与农业“绿色革命”具有等同的战略意义。随着随着生产和科学技术的发展，人类逐步认识到监测常规环境指标已经不足以全面说明环境问题，更无法客观地反映环境质量状况，而生物监测具有理化监测所不能替代的作用和所不具备的特点，如能直接反映出环境质量对生态系统的影响；能综合反映环境质量状况；具有连续监测的功能，因此，日益受到
3、人们的广泛重视。4生物监测的定义生物环境协同进化相互依存生物监测（biological monitoring）在不同的文献资料中，定义略有区别。联合国环境规划署（UNEP）将其定义为测量活着的生物体对人为压力的灵敏度。美国国家环保局（EPA）则定义为使用活着的生物体来测定环境影响。可以将生物监测定义为测量活着的生物体对人为压力的灵敏度。这类敏感度可以由多种形式表现出来，包括细胞的生物化学、生理、生长或健康状况等的变化，个体及大规模发育与繁殖的变化，种群数量、群落及生态系统的变化等。5生物监测的特点6常用的监测技术方法7生物监测技术在水环境监测中的应用8生物指数法9种类多样性指数法种类多样性指数
4、法是应用数理统计法求得表示生物群落的种类和个体数量的数值，用以评价环境质量。它是定量反应生物群落结构（种类、数量）及群落中各种类组成比例变化的信息。常用的方法包括香农（Shangnog）-韦弗（Weaver）多样性指数，马吉莱夫（Margalef）多样性指数和连续比较指数。10生态毒理性试验生态毒理性试验又称生物测试，它是利用生物受到污染物质的毒害所产生的生理机能等变化测试污染状况的方法，分为静水式生物测试和流水式生物测试。生物测试法主要应用于对污染源的监测，采用此方法可以反映很多重要信息，如有害物质进入周围环境时其毒性如何或能否发生改变，接收系统受影响的程度如何，何种有害物质的致毒性最大以及
5、在何条件下毒性最强，对生物的生活史能产生什么影响。11生物残毒测定生物残毒测定又称水生生物法，它是利用生物含污量进行水体监测和评价。水体中重金属、有机农药和放射性物质有时含量较低，采用常规理化法分析比较困难，而许多水生生物往往对它们有较强的富集能力。因此，根据污染物在生物体内的残留量可推断出水体的污染程度。12微型生物群落监测方法（PFU）PFU（polyurethane foam unit）法是应用泡沫塑料块作为人工基质来收集水体中微型生物群落，测定该群落结构与功能的各种参数，以评价水质。用室内毒性试验方法，预报工业废水和化学品对受纳水体中微型生物群落的毒性强度，为制定其安全浓度和最高允许浓
6、度提出群落级别水平的基准。适用于采用原生动物、藻类对水质进行监测，是群落水平上、连续的生物监测。13硝化细菌测试法硝化细菌为专性化学能自养型细菌，它包括氨氧化菌和亚硝酸氧化菌两个亚群。硝化过程：氨氧化菌将氨氧化为亚硝酸；亚硝酸氧化为硝酸。鉴于硝化细菌对多种化学物质比较敏感，通过测定化学物质对硝化细菌硝化作用强度的影响，来表明化学物质毒性大小和对自然界中氮循环功能的影响程度，该方法检测污染物毒性具有简便、敏感、快速、廉价和定量等特性。14幼虫变态实验近年来对于以海洋无脊椎动物的胚胎和幼虫期毒性实验研究较为广泛，有关研究表明，浮游幼虫变态比现有生物个体水平的毒性实验指标更为敏感。海洋底栖无脊椎动物
7、幼虫的变态期是生活史的关键阶段，变态期幼体对污染物的敏感性要高于其他阶段，胚胎发生和幼虫发育不受影响的污染物浓度会阻碍其变态。幼虫的变态过程易于观察，易受环境污染干扰。与死亡率比较，能否在附着基表面顺利变态是监测污染物毒性更为敏感的指标。15发光细菌毒性检测法发光细菌试验是环境样品毒性检测的生物测试技术，并已被列入德国国家标准（DIN38412）和国际标准（ISO11348）。毒性是一项综合的生物学参数，它是衡量样品对活性生物体所产生的影响，不能以化学分析方法进行测定。发光细菌测试使用了具有发光特性的天然微生物，而毒性物质则将抑制发光，且毒性越强，光抑制越明显。发光细菌本身没有危害性，这一方法
8、经研究被证实具有快速、简便的特点，同时有很好的灵敏度和可靠性。16生态毒理学方法细胞分裂时染色体要进行复制，在复制过程中如果受到外界诱变因子的作用，会产生一些游离染色体片段或染色单体，形成包膜，变成大小不等的小球体，这就是微核。1982年，Hooftman等最早将微核试验用于鱼类，并首次证明了化学诱变剂甲基磺酸乙酯（EMS）能够诱导泥荫鱼（Umbrapygman）外周血红细胞微核的形成。近年来，微核试验被许多国内外的学者用于化合物遗传毒性的评估和环境监测。17单细胞凝胶电泳法（SCGE）单细胞凝胶电泳法（SCGE），即彗星试验5，是一种通过监测DNA链损伤来判别遗传毒性的技术。SCGE法比微核
9、试验更有益，因为环境中的遗传毒物浓度一般很低，而彗星试验检测低浓度遗传毒物具有高度灵敏性，所研究的细胞不需要处于有丝分裂期，且需要的细胞量少。目前它已被用于检测哺乳动物、蚯蚓、一些高等植物、鱼类、两栖动物以及海洋无脊椎动物的细胞。用彗星试验检测DNA损伤能够监测水体中PCP污染。18SOS显色法SOS显色法是国内在20世纪80年代发展起来的一种遗传毒性检测新方法，具有快速、准确、灵敏及假阳性率低的特点，被广泛用于遗传毒性的测定中。其原理是：在DNA分子受到外因引起大范围损伤、其复制又受到抑制的情况下，会导致一种容易发生错误的修复。所有这些在遗传毒物处理后大肠杆菌中出现的一系列反应统称为SOS应
10、答。19生物标志物法生物标志物：在亚个体和个体水平上既可以测定污染物暴露水平，也可以测定污染物效应的生理和生化指标。生物标志物是生物体受到严重损害之前，在不同生物学水平（分子、细胞、个体等）上因受环境污染物影响而异常化的信号指标。它可以对严重毒性伤害提供早期警报。20生物生物标志物的体系志物的体系引自：王海黎，199921水体重金属水体重金属污染染较关注的较关注的生物标记生物标记 乙酰胆碱酯酶（乙酰胆碱酯酶（AChEAChE） 抗氧化防御系统抗氧化防御系统 腺苷三磷酸（腺苷三磷酸（ATPaseATPase） DNADNA损伤损伤 金属硫蛋白（金属硫蛋白（MTsMTs）诱导）诱导22由由遗传毒物
11、引起的毒物引起的DNA修修饰译自：SHUGART.L.R, 2000目前的主要检测手段有：DNA断链检测（彗星试验、碱性解链实验、非程序DNA合成试验）、微核试验、DNA加合物试验、DNA甲基化水平等。23生物标志物的一些测定方法32P-后标记法该方法是分析DNA加合物的方法。主要包括以下几个步骤：1）DNA酶解成脱氧核苷-3-磷酸；2）加入核酸酶，使正常单核苷酸的3端去磷酸化，而加合的单核苷酸可抑制该作用；3）用32PATP和多聚核苷酸酶标记加合物核苷酸；4）分别经过高分辨率的薄层层析进行分离分析，使加合物和正常核酸分离，并用放射自显影绘制加合物显影图。优点：灵敏度高，需要的DNA少，且不需
12、要事先知道结合物的组成。24抗原-抗体芯片主要分为重组抗原芯片和天然抗原芯片。1）重组抗原芯片是将一些特定的蛋白固定在芯片表面，与待测标本孵育，捕获自身抗体，再与已经标记的二抗结合。2）天然芯片是指通过固定在芯片上的蛋白为天然抗原，即通过裂解细胞后将蛋白用2-DE分离，再将液相转变为固相作为芯片。生物标志物的一些测定方法25生物标志物的一些测定方法色谱/质谱法质谱与毛细管气相色谱（CGC）的联用是目前灵敏度最高的技术之一。然而多数被修饰的碱基、核苷酸沸点较高，采用CGC法时必须先将其衍生化。另外，近年来采用快原子轰击（FAB）法将DNA加合物离子化，并将质谱与液相色谱分离技术结合使用，同时毛细
13、管区带电泳（CZE）与质谱联用检测DNA加合物技术也得到了发展。26免疫学方法酶免疫监测（enzyme immunoassay, EIA）是根据抗原抗体反应具有高度的特异性，以酶作为标记物，与已知抗体结合，但不影响其免疫学特性，然后将酶标记物的抗体作为标准试剂来鉴定未知的抗原。酶联免疫吸附测试（enzyme linked immunosorbent assay, ELIAS）是目前最常用的监测方法。它是根据EIA的原理而发展的一种固相免疫技术，其试剂盒基于竞争吸附方法，可分别供实验室和野外测试。生物标志物的一些测定方法27间接ELISA操作步骤及原理固相抗原酶标底物（二抗）一抗包被抗原包被抗原
14、洗洗涤加被加被检标本本加入加入酶结合物合物洗洗涤加加显色色剂和和终止止剂28PCR技术PCR技术即聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction），是在体外合成特异性DNA片段的方法，可以快速扩增目的基因DNA或RNA片段，是对基因克隆，分子杂交和序列分析等分子生物学方法的丰富和发展。其目前在环境监测中的应用主要有以下几个方面：1）环境中病原微生物的检测；2）进入自然环境中的基因工程菌的检测；3）环境微生物基因克隆中PCR技术的应用等。29PCR技术应用原理在污染压力下的DNA序列损伤或基因变异污染压力下的某生物DNA对目标基因设计引物PCR琼脂糖凝胶检测污染压力下的某生物
15、DNA随机引物PCR琼脂糖凝胶检测30细胞凋亡检测法细胞凋亡也称为程序性细胞死亡（programmed cell death, PCD），细胞凋亡是构成生命体的细胞生理反应的一种基本现象，它在生物体的防御内外伤害、内稳态的维持以及胚胎发育过程中起着举足轻重的作用。环境水体中外来污染物可能会对细胞凋亡产生影响。细胞凋亡鉴定方法：见DNA LADDER试剂盒说明书31细胞凋亡是在生理的一些弱刺激下导致的受基因调控的主动连续的程式化反应，它具有形态和生化方面的特征性变化。其形态方面的变化主要表现为细胞体积缩小，核质浓缩，细胞核裂解，核膜内陷形成凋亡小体，凋亡细胞周围无炎症特征；在生化方面的变化主要为细胞DNA的有序降解，DNA发生有规律断裂，在琼脂糖凝胶电泳中呈现连续阶梯状条带。32谢谢33
