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1、爪蟾卵子成熟过程爪蟾卵子成熟过程MPF的发现早在1960s，YoshioMasui发现成熟蛙卵的提取物能促进未成熟卵的胚胞破裂(GerminalVesicleBreakdown，GVBD)，后来Sunkara将不同时期Hela细胞的提取液注射到蛙卵母细胞中，发现G1和S期的抽取物不能不能诱导GVBD，而G2和M期的则具有具有促进胚胞破裂的功能，它将这种诱导物质称为有丝分裂因子(MF)。后来在CHO细胞，酵母和粘菌中也提取出相同性质的MF。这类物质被统称为MPF。l1960sLelandHartwell，1970sPaulNurse以芽殖酵母和裂殖酵母为实验材料，利用温度敏感突变株，发现许多与细
2、胞分裂有关的基因（celldivisioncyclegene，cdc）。l如：裂殖酵母cdc2、芽殖酵母cdc28 突变型在限制温度下无法分裂；Wee1 突变型提早分裂，cdc25 突变型细胞体积增大而不分裂；cdc2 和cdc28 都编码一个34KD的蛋白激酶（p34cdc2，p34cdc28），且属于同源物，均能促进细胞周期的进行，在调节G1/S转化中起作用。但这两种激酶只有结合相关蛋白后，才表现激酶活性。wee1 和cdc25 分别表现为抑制抑制和促进促进 CDC2的活性。FissionyeastFissionyeast裂殖酵母细胞周期裂殖酵母细胞周期buddingyeastbuddin
3、gyeast芽殖酵母细胞周期芽殖酵母细胞周期CdcCdc25&Wee1mutant25&Wee1mutantCdc25表达不足，细胞长得过长而不分裂；Wee1表达不足，细胞很小就开始分裂了。l1980sTimothyHunt发现海胆的卵裂过程中两种蛋白质的含量随细胞周期振荡，命名为周期蛋白(cyclinA和B)。后来发现各类动物来源的细胞周期蛋白mRNA均能诱导蛙卵的成熟。l1988年Lohka将非洲爪蟾的MPF纯化。经鉴定MPF由32KD和45KD两种蛋白组成，是一种丝氨酸/苏氨酸激酶。l进一步的研究发现MPF=CDC2+clyclinBMPF=CDC2+CyclinBLeland H. H
4、artwell R. Timothy (Tim) Hunt Sir Paul M. Nurse 2001年 10月 8日 美 国 人 LelandHartwell、 英 国 人 Paul Nurse、TimothyHunt因对细胞周期调控机理的研究而获诺贝尔生理医学奖。二、二、二、二、CDKCDKlCDC2与细胞周期蛋白结合才具有激酶的活性，故名细胞周期蛋白依细胞周期蛋白依赖性激酶赖性激酶(cyclin-dependentkinase，CDK)。lCDC2又被称为CDK1，可将特定蛋白磷酸化，促进细胞周期运行，又称作细胞周期引擎细胞周期引擎。如将核纤层蛋白磷酸化导致核纤层解体、核膜消失；将H1
5、磷酸化导致染色体的凝缩等。l在动物中已知7种CDK。均含有一段相似的激酶结构域，这一区域有一段保守序列，即PSTAIRE，与周期蛋白的结合有关。CKI对细胞周期起负调控作用，阻止Cyclin-Cdk复合物的装配或活性；而将细胞阻止在不同的检验点。如DNA受损后，细胞将停留于G1Checkpoint让DNA修复或者凋亡。CDI包括INK4家族和CIP/KIP家族：-Ink4（Inhibitorofcdk4）：P16ink4a,P15ink4b，P18ink4c，P19ink4d。特异性抑制cdk4cyclinD1，cdk6cyclinD1。-Kip（Kinaseinhibitionprotein
6、）：P21cip1(cyclininhibitionprotein1）P27kip1、P57kip2，抑制大多数CDK的激酶活性。P21cip1还能与DNA聚合酶的辅助因子PCNA(proliferatingcellnuclearantigen)结合，直接抑制DNA的合成。三、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子三、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子三、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子三、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子（CDKinhibitorCDKinhibitor，CKICKI）P21cip1抑制抑制CDK和和PCNATwosuchcheckpoints:1.OneinlateG1:proventse
7、ntryintoSphase;2.OneinlateG2:proventsentryintomitosis;P53:generegulatoryprotein.DNAdamageactivatesp53byanindirectmechanism.P21(CKIprotein)bindstoG1/S-CdkandS-Cdkandinhibitstheiractivities,therebyhelpingtoblockentryintoSphase.Mdm2actsasaubiquitinligasethattargetsp53fordestructionbyproteasomes.Phosphr
8、ylatedp53reduceitsbindingtoMdm2.vDNAdamagecheckpoint:Cell-cycleprogressionisblockedbyDNAdamageandp53四、细胞周期蛋白（四、细胞周期蛋白（四、细胞周期蛋白（四、细胞周期蛋白（cyclincyclin）l特点：在细胞周期中呈周期性变化。含有一段约100个氨基酸的保守序列，称为周期蛋白框周期蛋白框，介导周期蛋白与CDK结合。l作用：激活CDK，决定CDK何时、何处、将何种底物磷酸化，从而推动细胞周期的前进。l已知30余种，在脊椎动物中为A1-2、B1-3、C、D1-3、E1-2、F、G、H等。l分为4
9、类：G1型、G1/S型、S型、M型。lG1期：期：在生长因子的刺激下，cyclinD表达，并与CDK4、CDK6结合，使下游的蛋白质如Rb磷酸化，Rb释放出转录因子E2F，促进许多基因的转录，如编码cyclinE、A和CDK1的基因。lG1-S期：期：cyclinE与CDK2结合，促进细胞进入S期。CyclinE的抗体能使细胞停滞于G1期。l在在G2-M期：期：cyclinA、cyclinB与CDK1结合，CDK1使底物蛋白磷酸化、如将组蛋白H1磷酸化导致染色体凝缩，核纤层蛋白磷酸化使核膜解体。五、五、五、五、Cyclin-CdkCyclin-Cdk 复合物的多样性及细胞周期调控复合物的多样性
10、及细胞周期调控复合物的多样性及细胞周期调控复合物的多样性及细胞周期调控不同类型的不同类型的不同类型的不同类型的CDK/CDK/cyclincyclin复合体复合体复合体复合体* 包括包括D1-3，各亚型各亚型 cyclin D 在不同细胞中在不同细胞中的表达量不同，但具有相同的功效。的表达量不同，但具有相同的功效。lcell cycle regulationlM期CDK的激活起始于分裂期cyclin的积累。其浓度决定于降解的速度；但在大多数细胞的有丝分裂周期中，cyclin的积累是因为在G2-M期cyclin基因转录的增强。l结合cyclinB的CDK1被Wee1将Thr14和Tyr15磷酸化
11、而不具有活性，使CDK/cyclin不断积累。l在M期，Wee1的活性下降，CDC25使CDK去磷酸化，去除了CDK活化的障碍。lCDK的激活需要Thr161的磷酸化，它是在CDK激酶（CDKactivatingkinase，CAK）的作用下完成的。 MM期期期期 CDK CDK 的激活的激活的激活的激活CDK activatingCDK activating1、Wee/Mik-14、15-磷酸化2、Cdc25c-14、15-去磷酸化3、CAK-16磷酸化vTheactivationofM-phasecyclin-Cdkcomplexes(M-Cdks)triggersentryintomit
12、osisTheactivationofM-Cdk在中期当MPF活性达到最高时，激活后期促进因子APC（anaphasepromotingcomplex），将泛素连接在cyclinB上，cyclinB被蛋白酶体（proteasome）降解，完成一个细胞周期。分裂期周期蛋白N端有一段序列与其降解有关，称降解盒(destructionbox)。当MPF活性达到最高时，通过泛素连接酶催化泛素与cyclin结合，cyclin随之被26S蛋白酶体水解。G1周期蛋白也通过类似的途径降解，但其N端没有降解盒，C端有一段PEST序列与其降解有关。泛素由76个氨基酸组成，高度保守。共价结合泛素的蛋白质能被蛋白酶体
13、识别和降解，这是细胞内短寿命蛋白和一些异常蛋白降解的普遍途径。26S蛋白酶体是一个大型的蛋白酶，可将泛素化的蛋白质分解成短肽。 MM期期期期 周期蛋白与周期蛋白与周期蛋白与周期蛋白与M/M/后期转化后期转化后期转化后期转化CyclinB的降解途径的降解途径l在蛋白质的泛素化过程中，E1（ubiquitin-activatingenzyme，泛素激活酶）水解ATP获取能量，通过其活性位置的半胱氨酸残基与泛素的羧基末端形成高能硫酯键而激活泛素，然后E1将泛素交给E2（ubiquitin-conjugatingenzyme，泛素结合酶），最后在E3（ubiquitin-ligase，泛素连接酶泛素连
14、接酶）的作用下将泛素转移到靶蛋白上。l参与细胞周期调控的泛素连接酶至少有两类：-其中SCF（skp1-cullin-F-boxprotein，三个蛋白构成的复合体）负责将泛素连接到G1/S期周期蛋白和某些CKI上；-APC负责将泛素连接到M期周期蛋白上。DestructionBoxinCyclins泛素激活酶泛素结合酶泛素连接酶vThecell-cyclecontrolsystemdependsoncyclicalproteolysis-ThecontrolofproteolysisbySCFandAPCduringthecellcycle.(A)Thephosphorylationofata
15、rgetprotein(CKI),allowstheCKItoberecognizedbySCF(constitutiveactive),E1andE2(twoadditionalproteins),SCFservesasaubiquitinligase.TheubiquitylatedCKIisthenimmediatelyrecognizedanddegradedinaproteasome.SCFmediatethedestructionofG1-cyclins,Cdkinhibitor,andothercellcycleproteins.(B)M-cyclinubiquitylation
16、isperformedbyAPC.InG1andSphaseInmetaphase/anaphaseM-cyclinsv Mitotic Mitotic Cyclin-CdkCyclin-Cdk（MPFMPF）复合物的活化与功能复合物的活化与功能复合物的活化与功能复合物的活化与功能活化活化-随Cyclin浓度变化而变化-激酶与磷酸酶的调节，活化的MPF可使更多的MPF活化。功能功能：启动细胞从G2期进入M期的相关事件MPF随随Cyclin浓度变化而变化浓度变化而变化活化的活化的MPF可使更多的可使更多的MPF活化活化激酶与磷酸酶的调节激酶与磷酸酶的调节MPF功能功能MitoticCyclin-
17、Cdk复合物激活复合物激活AnaphasePormotinComplex(APC)，调控纺锤体装调控纺锤体装配检验点配检验点-APC介导选择性降解的靶蛋白与Ubiquitin结合（通过泛素依赖性途径降解）。-APC主要介导两类蛋白降解:AnaphaseInhibitors和MitoticCyclin。前者维持姐妹染色单体粘连，抑制后期启动；后者的降解意味着有丝分裂即将结束，即染色体开始去凝集，核膜重建。-Mad2蛋白位于动粒上，在染色体结合有丝分裂纺锤体前将不断从动粒上释放而抑制APC的活性。所以只有所有染色体都与纺锤体结合后，APC才有活性，才启动细胞向后期转换。vThespindle-at
18、tachmentcheckpoint:Unattachedchromosomesblocksister-chromatidseparationvThesisterchromatidseparationistriggeredbyproteolysisThetriggeringofsister-chromatidseparationbytheAPC.APC:anaphase-promotingcomplexThedestructionofSecurinallows separasetocleavethecohesincomplex.Securin(后期抑制因子后期抑制因子 )separasecoh
19、esin泛素依赖性途径降解细胞周期调控模型总细胞周期调控模型总结结vThesummaryofcell-cyclecontrolsystem六、细胞周期检验点（六、细胞周期检验点（六、细胞周期检验点（六、细胞周期检验点（check pointcheck point）l细胞要分裂，必须正确复制DNA和达到一定的体积，在获得足够物质支持分裂以前，细胞不可能进行分裂。细胞周期的运行，是在一系列称为检验点检验点的严格检控下进行的，当DNA发生损伤，复制不完全或纺锤体形成不正常，周期将被阻断。l细胞周期检验点是细胞周期调控的一种机制，主要是确保周期每一时相事件的有序、全部完成并与外界环境因素相联系。l细胞
20、周期检验点由感受异常事件的感受器、信号传导通路和效应器构成。l检验点主要包括：-G1/S检验点：控制细胞由静止状态的G1进入DNA合成期，相关的事件包括：DNA是否损伤？细胞外环境是否适宜？细胞体积是否足够大？在酵母中称start点，在哺乳动物中称R点（restrictionpoint）。-S期检验点：DNA复制是否完成？-G2/M检验点：是决定细胞一分为二的控制点，相关的事件包括：DNA是否损伤？细胞体积是否足够大？-中-后期检验点：纺锤体组装检验点，任何一个着丝点没有正确连接到纺锤体上，都会抑制APC的活性，引起细胞周期中断。FourcheckpointsFourcheckpoints细胞
21、周期检验点及其作用细胞周期检验点及其作用G1Cyclin-Cdk复合物对复合物对Rb蛋白磷酸化而调控蛋白磷酸化而调控G1检验点检验点vThemechanismscotrollingS-phaseinitiationinanimalcells.vTheRbproteinactsasabrakeinmammalianG1cellsvThecontrolofG1progressionandS-phaseinitiationisoftendisruptedincancercells,leadingtounrestrainedcell-cycleentryandcellproliferation.lAT
22、M（ataxiatelangiectasia-mutatedgene）：是与DNA损伤检验有关的一个重要基因。最早发现于毛细血管扩张性共济失调症患者，人类中大约有1%的人是ATM缺失的杂合子，表现出对电离辐射敏感和易患癌症。lATM编码一个蛋白激酶，结合在损伤的DNA上，能将某些蛋白磷酸化，中断细胞周期。其信号通路有两条：激活Chk1（checkpointkinase）,使CDC25的Ser216磷酸化失去活性，抑制M-CDK的活性，中断细胞周期。激活Chk2，使P53被磷酸化而激活，然后P53作为转录因子，导致P21的表达，P21抑制G1-S期CDK的活性，中断细胞周期。七、生长因子对细胞增
23、殖的影响七、生长因子对细胞增殖的影响七、生长因子对细胞增殖的影响七、生长因子对细胞增殖的影响l单细胞生物的增殖取决于营养，多细胞生物细胞的增值取决于机体是否需要。这种需要是通过细胞通信来实现的。l生长因子：是与细胞增殖有关的信号物质，已知几十种，多数能促进细胞增殖，又称有丝分裂原（mitogen），如表皮生长因子（EGF）、神经生长因子（NGF）。l生长因子不是由特定腺体产生，主要通过旁分泌作用于邻近细胞。各种生长因子分子量大小不同。l信号通路：ras途径，cAMP途径、磷脂酰肌醇途径。如通过ras途径，激活MAPK，MAPK进入细胞核内，激活c-myc，myc作为转录因子促进cyclinD、SCF、E2F等G1-S有关的基因表达，细胞进入G1期。
