第三章液相色谱法

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1、第三章第三章 液相色谱法液相色谱法南京工业大学生物与制药工程学院南京工业大学生物与制药工程学院国家生化工程技术研究中心国家生化工程技术研究中心余定华余定华 博士，副教授，硕士生导师博士，副教授，硕士生导师High Performance Liquid ChromatographyHPLC23液相色谱仪（液相色谱仪（2 2）4液相色谱仪（液相色谱仪（3 3）5北京瑞利北京瑞利6 3 - 1概述概述 高效液相色谱是在高效液相色谱是在气相色谱和经典色谱气相色谱和经典色谱的的基础上发展起来的。现代液相色谱和经典液相基础上发展起来的。现代液相色谱和经典液相色谱没有本质的区别。不同点仅仅是现代液相色谱没有

2、本质的区别。不同点仅仅是现代液相色谱比经典液相色谱有较高的色谱比经典液相色谱有较高的效率效率 和实现了和实现了自自动化动化 操作。操作。 高效液相色谱法是继气相色谱之后，高效液相色谱法是继气相色谱之后，70年代初年代初期发展起来的一种以液体做流动相的新色谱技术期发展起来的一种以液体做流动相的新色谱技术.7 7高效液相色谱高效液相色谱经典色谱经典色谱8 经典的液相色谱法，流动相在常压下输送，经典的液相色谱法，流动相在常压下输送，所用的固定相柱效低，分析周期长。而现代液相所用的固定相柱效低，分析周期长。而现代液相色谱法色谱法引用了气相色谱的理论引用了气相色谱的理论，流动相改为高压流动相改为高压输送

3、输送（最高输送压力可达（最高输送压力可达4.5 107Pa）;色谱柱是色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。可对流出物进行连续检测。 因此，高效液相色谱具有分析速度快、分因此，高效液相色谱具有分析速度快、分离效能高、自动化等特点。所以人们称它为离效能高、自动化等特点。所以人们称它为高压、高压、高速、高效或现代液相色谱法。高速、高效或现代液相色谱法。

4、9 和气相色谱一样，液相色谱分离系统也由两和气相色谱一样，液相色谱分离系统也由两相相固定相和流动相组成固定相和流动相组成。 液相色谱的固定相可以是液相色谱的固定相可以是吸附剂、化学键合吸附剂、化学键合固定相固定相（或在惰性载体表面涂上一层液膜）、（或在惰性载体表面涂上一层液膜）、离离子交换树脂或多孔性凝胶；子交换树脂或多孔性凝胶；流动相是各种溶剂流动相是各种溶剂。 被分离混合物由流动相液体推动进入色谱柱。被分离混合物由流动相液体推动进入色谱柱。根据各组分在固定相及流动相中的根据各组分在固定相及流动相中的吸附能力、分吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异进配系数、离子交换作用或分子

5、尺寸大小的差异进行分离。行分离。 3 - 1概述概述一一、液相色谱分离原理及分类、液相色谱分离原理及分类10 液相液相色谱分离的实质是样品分子（以下称色谱分离的实质是样品分子（以下称溶质）与溶溶质）与溶剂（即流动相或洗脱液）以及固定相分剂（即流动相或洗脱液）以及固定相分子间的作用，作用力的大小，决定色谱过程的保留子间的作用，作用力的大小，决定色谱过程的保留行为。行为。 3- 13- 1概述概述 根据分离机制不同，液相色谱可分为：根据分离机制不同，液相色谱可分为：液固吸附色谱、液液分配色谱、化合键合色谱、液固吸附色谱、液液分配色谱、化合键合色谱、离子交换色谱以及分子排阻色谱等类型。离子交换色谱以

6、及分子排阻色谱等类型。11二、液相色谱与气相色谱的比较二、液相色谱与气相色谱的比较 液相色谱所用液相色谱所用基本概念：保留值、塔板数、塔基本概念：保留值、塔板数、塔板高度、分离度、选择性等与气相色谱一致。板高度、分离度、选择性等与气相色谱一致。液相液相色谱所用色谱所用基本理论：塔板理论与速率方程也与气相基本理论：塔板理论与速率方程也与气相色谱基本一致。色谱基本一致。但由于在液相色谱中以但由于在液相色谱中以液体液体代替气代替气相色谱中的相色谱中的气体气体作为流动相，而液体和气体的性质作为流动相，而液体和气体的性质不相同；此外，液相色谱所用的不相同；此外，液相色谱所用的仪器设备和操作条仪器设备和操

7、作条件件也与气相色谱不同，所以，液相色谱与气相色谱也与气相色谱不同，所以，液相色谱与气相色谱有一定差别，主要有以下几方面：有一定差别，主要有以下几方面：12 气相色谱仅能分析在操作温度下能气化而不气相色谱仅能分析在操作温度下能气化而不分解的物质。对高沸点化合物、非挥发性物质、分解的物质。对高沸点化合物、非挥发性物质、热不稳定化合物、离子型化合物及高聚物的分离、热不稳定化合物、离子型化合物及高聚物的分离、分析较为困难。致使其应用受到一定程度的限制，分析较为困难。致使其应用受到一定程度的限制，据统计只有大约据统计只有大约20%的有机物能用气相色谱分析的有机物能用气相色谱分析； 液相色谱则不受样品挥

8、发度和热稳定性的限制，液相色谱则不受样品挥发度和热稳定性的限制，它非常适合分子量较大、难气化、不易挥发或对它非常适合分子量较大、难气化、不易挥发或对热敏感的物质、离子型化合物及高聚物的分离分热敏感的物质、离子型化合物及高聚物的分离分析，大约析，大约占有机物的占有机物的70 80%。 二、液相色谱与气相色谱的比较二、液相色谱与气相色谱的比较（1）应用范围不同）应用范围不同13 因为：因为： 气相色谱的流动相载气是色谱惰性的，不参与气相色谱的流动相载气是色谱惰性的，不参与分配平衡过程，与样品分子无亲和作用，样品分分配平衡过程，与样品分子无亲和作用，样品分子只与固定相相互作用。子只与固定相相互作用。

9、而而在液相色谱中流动相在液相色谱中流动相液体也与固定相争夺样品分子，为提高选择性增液体也与固定相争夺样品分子，为提高选择性增加了一个因素加了一个因素。也可选用不同比例的两种或两种也可选用不同比例的两种或两种以上的液体作流动相，增大分离的选择性。以上的液体作流动相，增大分离的选择性。 二、液相色谱与气相色谱的比较二、液相色谱与气相色谱的比较（2 2）液相色谱能完成难度较高的分离工作）液相色谱能完成难度较高的分离工作14液相色谱固定相类型多液相色谱固定相类型多, ,如如离子交换色谱离子交换色谱和排阻色谱和排阻色谱等，作为分析时选择余地等，作为分析时选择余地大；而气相色谱并不可能的。大；而气相色谱并

10、不可能的。 液相色谱通常在室温下操作，较低的温液相色谱通常在室温下操作，较低的温度，一般有利于色谱分离条件的选择。度，一般有利于色谱分离条件的选择。二、液相色谱与气相色谱的比较二、液相色谱与气相色谱的比较15（3 3）由于液体的扩散系数比气体的小）由于液体的扩散系数比气体的小10105 5倍，因倍，因此，溶质在液相中的传质速率慢，此，溶质在液相中的传质速率慢，柱外效应就柱外效应就显得特别重要显得特别重要；而在气相色谱中，柱外区域扩；而在气相色谱中，柱外区域扩张可以忽略不计。张可以忽略不计。（4 4）液相色谱中制备样品简单，回收样品也比）液相色谱中制备样品简单，回收样品也比较容易，而且回收是定量

11、的，较容易，而且回收是定量的，适合于大量制备适合于大量制备。 液相色谱尚缺乏通用的检测器，仪液相色谱尚缺乏通用的检测器，仪器比较复杂，价格昂贵。在实际应用中，这两器比较复杂，价格昂贵。在实际应用中，这两种色谱技术是互相补充的。种色谱技术是互相补充的。二、液相色谱与气相色谱的比较二、液相色谱与气相色谱的比较16 综上所述，高效液相色谱法具有综上所述，高效液相色谱法具有高柱效、高高柱效、高选择性、分析速度快、灵敏度高、重复性好、应选择性、分析速度快、灵敏度高、重复性好、应用范围广等优点。用范围广等优点。该法已成为现代分析技术的重该法已成为现代分析技术的重要手段之一，目前在化学、化工、医药、生化、要

12、手段之一，目前在化学、化工、医药、生化、环保、农业等科学领域获得广泛的应用。环保、农业等科学领域获得广泛的应用。 3- 1概述概述173 32 2 高效液相色谱仪高效液相色谱仪183 32 2 高效液相色谱仪高效液相色谱仪 高效液相色谱仪的结构示意见图，一般可分高效液相色谱仪的结构示意见图，一般可分为为4 4个主要部分：个主要部分：高压输液系统，进样系统，分离高压输液系统，进样系统，分离系统和检测系统。系统和检测系统。此外还配有辅助装置：如梯度此外还配有辅助装置：如梯度淋洗，自动进样及数据处理等。其工作过程如下：淋洗，自动进样及数据处理等。其工作过程如下：首先高压泵将贮液器中流动相经过进样器送

13、入色首先高压泵将贮液器中流动相经过进样器送入色谱柱，然后从控制器的出口流出。当注入待分离谱柱，然后从控制器的出口流出。当注入待分离的样品时，流经进样器贮液器的流动相将样品同的样品时，流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分离，然后依先后顺序进入检时带入色谱柱进行分离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器送出的信号记录下来，由测器，记录仪将检测器送出的信号记录下来，由此得到液相色谱图。此得到液相色谱图。 19贮液器贮液器高压泵高压泵检测器检测器梯度淋梯度淋洗装置洗装置色谱柱色谱柱压力表压力表进样器进样器馏分馏分收集器收集器高压输液系统，进样系统，高压输液系统，进样系统，分离系统和检

14、测系统分离系统和检测系统20高压输液系统，进样系统，分离系统和检测系统高压输液系统，进样系统，分离系统和检测系统2122 由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流动相阻力很大，为使流动相较快流动，因此对流动相阻力很大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输液系统。它是仪器最重要的部必须配备有高压输液系统。它是仪器最重要的部件：由储液罐、件：由储液罐、高压输液泵高压输液泵*、过滤器、压力脉过滤器、压力脉动阻力器等组成。动阻力器等组成。 对高压输液泵的要求：对高压输液泵的要求：密封性好，输出流密封性好，输出流量恒定，压力平稳，可调范围宽，便于迅速更换量恒定，压

15、力平稳，可调范围宽，便于迅速更换溶剂及耐腐蚀等要求。溶剂及耐腐蚀等要求。1.1.高压输液系统高压输液系统 3 32 2 高效液相色谱仪高效液相色谱仪23 常用的输液泵分为常用的输液泵分为恒流泵和恒压泵恒流泵和恒压泵两种。两种。32 高效液相色谱仪高效液相色谱仪恒流泵恒流泵特点是在一定操作条件下，特点是在一定操作条件下，输出流量保持输出流量保持恒定恒定而与色谱柱引起阻力变化无关；而与色谱柱引起阻力变化无关；恒压泵恒压泵是指能保持是指能保持输出压力恒定，输出压力恒定，但其流量则随但其流量则随色谱系统阻力而变化，故保留时间的重现性差色谱系统阻力而变化，故保留时间的重现性差它们各有优缺点。目前恒流泵比

16、恒压泵优越，使用较普遍它们各有优缺点。目前恒流泵比恒压泵优越，使用较普遍恒流泵分机械注射泵和恒流泵分机械注射泵和机械往复泵机械往复泵*两种两种24高压输液泵：高压输液泵：主要部件之一，压力：主要部件之一，压力：150450105 Pa。为为了了获获得得高高柱柱效效而而使使用用粒粒度度很很小小的的固固定定相相（10m），液液体体的的流流动动相相高高速速通通过过时时，将将产产生生很很高高的的压压力力，因因此此高高压压、高高速速是是高高效效液液相相色色谱谱的特点之一。的特点之一。252进样系统进样系统 高效液相色谱柱比气相色谱柱短得高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多（约多（约5-30cm5-30cm）

17、，所以柱外展宽（又称），所以柱外展宽（又称柱外效应）较突出。柱外展宽是指色谱柱外效应）较突出。柱外展宽是指色谱柱外的因素所引起的峰展宽，主要包括柱外的因素所引起的峰展宽，主要包括进样系统、连接管道及检测器中存在死进样系统、连接管道及检测器中存在死体积体积。进样系统是引起柱前展宽的主要。进样系统是引起柱前展宽的主要因素，因此因素，因此高效液相色谱法中对进样技高效液相色谱法中对进样技术要求较严。术要求较严。 26 流路中为高压力工作状态，流路中为高压力工作状态， 通常使用耐高压的六通阀进样装置，通常使用耐高压的六通阀进样装置， 其结构如图所示：其结构如图所示：27准备状态准备状态进样状态进样状态流

18、动相入口流动相入口色谱柱入口色谱柱入口样品出口样品出口样品入口样品入口流动相入口流动相入口色谱柱入口色谱柱入口样品环样品环283 3 分离系统分离系统色谱柱色谱柱 色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与柱管与固定相固定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的其他金属。玻璃管耐压有及内衬光滑的聚合材料的其他金属。玻璃管耐压有限，故金属管用得较多。一般色谱柱长限，故金属管用得较多。一般色谱柱长530cm，内径为内径为45mm。 一般在分离前备有一个一般在分离前备有一个前置柱前置柱，前置柱内填充物和，前置

19、柱内填充物和分离柱完全一样，这样可使淋洗溶剂由于经过前置分离柱完全一样，这样可使淋洗溶剂由于经过前置柱为其中的固定相饱和，使它在流过分离柱时不再柱为其中的固定相饱和，使它在流过分离柱时不再洗脱其中固定相，保证分离技术的性能不受影响。洗脱其中固定相，保证分离技术的性能不受影响。29 柱子装填得好坏对柱效影响很大。对于细柱子装填得好坏对柱效影响很大。对于细粒度的填料（粒度的填料（20m）一般采用匀浆填充法）一般采用匀浆填充法装柱，先将填料调成匀浆，然后在高压泵作用装柱，先将填料调成匀浆，然后在高压泵作用下，快速将其压入装有洗脱液的色谱柱内，经下，快速将其压入装有洗脱液的色谱柱内，经冲洗后，即可备用

20、。冲洗后，即可备用。 对色谱柱的要求：柱效高，选择性好，分对色谱柱的要求：柱效高，选择性好，分析速度快等。析速度快等。 3031使用色谱柱注意事项：使用色谱柱注意事项：1 1 溶剂要脱气，溶剂和样品应过滤，溶剂要脱气，溶剂和样品应过滤， 防止堵塞。防止堵塞。2 2 加前置柱。加前置柱。3 3 更换流动相要渐变。更换流动相要渐变。4 4 用后要保护好。用后要保护好。324检测系统检测系统 HPLC与与GC一样，要求检测器灵敏度高，重现一样，要求检测器灵敏度高，重现性好，定量准确，对温度和流速的变化不敏感，应性好，定量准确，对温度和流速的变化不敏感，应用范围广，线性范围宽等优点用范围广，线性范围宽

21、等优点 检测器分为两大类：一类是检测器分为两大类：一类是溶质性检测器溶质性检测器，它它仅对被分离组分的物理或化学特性有响应，属于这仅对被分离组分的物理或化学特性有响应，属于这类检测器的有类检测器的有紫外、荧光、电化学检测器紫外、荧光、电化学检测器等。等。 另一类是另一类是总体检测器总体检测器，它对试样和洗脱液总的它对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应，属于这类检测器的有物理或化学性质有响应，属于这类检测器的有示示差差折光，电导检测器折光，电导检测器等。现将常用的检测器介绍如下等。现将常用的检测器介绍如下:33HPLCHPLC中应用最广泛的检测器。它的原理基于待测中应用最广泛的检测器。它的原理

22、基于待测组分对特定波长的紫外或可见光的选择性吸收，组分对特定波长的紫外或可见光的选择性吸收，试样浓度与吸光度的关系服从朗伯试样浓度与吸光度的关系服从朗伯- -比尔定律。比尔定律。高效液相色谱检测器：高效液相色谱检测器：（1 1） 紫外光度检测器（紫外光度检测器（UVUV）优点：灵敏度高，选择性好，对流量和温度的变优点：灵敏度高，选择性好，对流量和温度的变化不敏感，适用于梯度淋洗，线性范围宽，适用化不敏感，适用于梯度淋洗，线性范围宽，适用于痕量分析。最小检测量于痕量分析。最小检测量1010-9-9g gmLmL-1-1。34高效液相色谱检测器：高效液相色谱检测器：（1） 紫外光度检测器紫外光度检

23、测器（UV）缺点：只适用于检测能吸收紫外、可见光的物质，缺点：只适用于检测能吸收紫外、可见光的物质，流动相选择受限制。要求流动相在测定波长下无流动相选择受限制。要求流动相在测定波长下无吸收。吸收。35光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器光光电电二二极极管管阵阵列列检检测测器器：1024个个二二极极管管阵阵列列，各各检检测测特特定定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。36 检测器是一种通用型检测器。它的作用原检测器是一种通用型检测器。它的作用原理是理是纯流动相与包含样品的流动相之间的折射率纯流动相与包含样品的流动相之间的折射率不同不同，

24、检测器把这种差值检测出来，给出信号，检测器把这种差值检测出来，给出信号，信号的大小与样品含量成正比。信号的大小与样品含量成正比。 纯流动相与待测组分的折射率相差越大，纯流动相与待测组分的折射率相差越大，检测器灵敏度越高，灵敏度可达检测器灵敏度越高，灵敏度可达1010-7-7g gcmcm-3-3。 通用性强，不破坏样品，线性范围宽。主通用性强，不破坏样品，线性范围宽。主要缺点是灵敏度低，不适宜痕量分析。对温度变要缺点是灵敏度低，不适宜痕量分析。对温度变化敏感，并且不能用于梯度淋洗。化敏感，并且不能用于梯度淋洗。（3 3）荧光检测器）荧光检测器（4 4）电导检测器）电导检测器 （2 2）示差折光

25、率检测器）示差折光率检测器37 它包括脱气、梯度淋洗、恒温、自动进它包括脱气、梯度淋洗、恒温、自动进样、馏分收集以及数据处理等装置。其中梯度淋样、馏分收集以及数据处理等装置。其中梯度淋洗装置是高压液相色谱仪中尤为重要的附属装置洗装置是高压液相色谱仪中尤为重要的附属装置 . . HPLCHPLC梯度淋洗与梯度淋洗与GCGC中的程序升温一样。中的程序升温一样。 对于某些复杂样品，组分的对于某些复杂样品，组分的kk范围很宽，用范围很宽，用一种强度的溶剂淋洗时不能得到很好的分离，采一种强度的溶剂淋洗时不能得到很好的分离，采用梯度淋洗。用梯度淋洗。就是组成流动相的两种或两种以上就是组成流动相的两种或两种

26、以上不同的溶剂按一定程序改变配比、极性、不同的溶剂按一定程序改变配比、极性、pHpH、离、离子强度、通过流动相极性的变化来改变待分离样子强度、通过流动相极性的变化来改变待分离样品的选择因子和品的选择因子和t tR R，提高分离效果和分析速度。，提高分离效果和分析速度。5、附属系统、附属系统38梯度淋洗装置梯度淋洗装置外梯度外梯度: : 利用两台高压输液泵，利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。混合后进入色谱柱。内梯度内梯度: : 一台高压泵一台高压泵, , 通过比通过比例调节阀例调节阀, ,将两种或

27、多种不将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。抽入高压泵中混合。上节课内容回顾上节课内容回顾液相色谱特点液相色谱仪的组成高压输液系统高压输液系统进样系统进样系统分离系统分离系统检测系统检测系统403-3 高效液相色谱的固定相和流动相高效液相色谱的固定相和流动相 （）固定相（）固定相 高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类，可高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类，可分为分为刚性固体和硬胶刚性固体和硬胶两大类。两大类。刚性固体刚性固体以以二氧化硅二氧化硅为基质，可承受为基质，可承受7.01081.0109Pa的高压，可制成的高压，可制成直径、形状、孔隙度不

28、同的颗粒。如果在二氧化硅直径、形状、孔隙度不同的颗粒。如果在二氧化硅表面键合各种官能团，就是表面键合各种官能团，就是键合固定相键合固定相，可扩大应，可扩大应用范围，它是目前最广泛使用的一种固定相。用范围，它是目前最广泛使用的一种固定相。硬胶硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚苯乙主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。可承受压力上限为烯与二乙烯苯基交联而成。可承受压力上限为3.5108Pa。 固定相按孔隙深度分类，可分为表面多孔型和固定相按孔隙深度分类，可分为表面多孔型和全多孔型固定相两类全多孔型固定相两类。 411.表面多孔型固定相表面多孔型固定相 它的基

29、体是实心玻璃珠，在玻璃球外面它的基体是实心玻璃珠，在玻璃球外面覆盖一层多孔活性材料，如硅胶、氧化铝、覆盖一层多孔活性材料，如硅胶、氧化铝、离子交换剂、分子筛、聚酸胺等。离子交换剂、分子筛、聚酸胺等。 这类固定相的多孔层厚度小、孔浅，相这类固定相的多孔层厚度小、孔浅，相对死体积小，出峰迅速、柱效亦高；颗粒较对死体积小，出峰迅速、柱效亦高；颗粒较大，渗透性好，装柱容易，梯度淋洗时能迅大，渗透性好，装柱容易，梯度淋洗时能迅速达平衡，较适合做常规分析。由于多孔层速达平衡，较适合做常规分析。由于多孔层厚度薄，最大允许量受限制。厚度薄，最大允许量受限制。 422 2全多孔型固定相全多孔型固定相 它由直径为

30、它由直径为10m的硅胶微粒凝聚而成。的硅胶微粒凝聚而成。 这类固定相由于颗粒很细（这类固定相由于颗粒很细（510m），孔），孔仍然较浅，传质速率快，易实现高效、高速。仍然较浅，传质速率快，易实现高效、高速。特别适合复杂混合物分离及痕量分析特别适合复杂混合物分离及痕量分析.43（二）流动相（二）流动相 由由于于高高效效液液相相色色谱谱中中流流动动相相是是液液体体，它它对对组组分分有有亲亲和和力力，并并参参与与固固定定相相对对组组分分的的竞竞争争。因因此此，正正确确选选择择流流动动相相直直接接影影响响组组分分的的分分离离度度。对对流流动动相相溶溶剂的要求是：剂的要求是： （1 1）溶溶剂剂对对于于

31、待待测测样样品品，必必须须具具有有合合适适的的极极性性和良好的选择性。和良好的选择性。 （2 2）溶剂要与检测器匹配。）溶剂要与检测器匹配。对于紫外吸收检测对于紫外吸收检测器，应注意选用检测器波长比溶剂的紫外器，应注意选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长截止波长要长。要长。所谓溶剂的紫外截止波长指当小于截止波长所谓溶剂的紫外截止波长指当小于截止波长的辐射通过溶剂时，溶剂对此辐射产生强烈吸收，的辐射通过溶剂时，溶剂对此辐射产生强烈吸收，此时溶剂被看作是光学不透明的，它严重干扰组分此时溶剂被看作是光学不透明的，它严重干扰组分的吸收测量。表中列出了一些常用溶剂的紫外截止的吸收测量。表中列出了一些常用溶

32、剂的紫外截止波长。波长。44 对于折光率检测器，要求选择与组分折光率对于折光率检测器，要求选择与组分折光率有较大差别的溶剂作流动相，以达最高灵敏度。有较大差别的溶剂作流动相，以达最高灵敏度。45（3）高高纯纯度度。由由于于高高效效液液相相色色谱谱灵灵敏敏度度高高，对对流流动动相相溶溶剂剂的的纯纯度度也也要要求求高高。不不纯纯的的溶溶剂剂会会引引起起基基线线不不稳稳，或或产产生生“伪伪峰峰”。痕痕量量杂杂质质的的存存在在，将将使使截截止波长值增加止波长值增加50100 nm。（4）化化学学稳稳定定性性好好。不不能能选选与与样样品品发发生生反反应应或或聚聚合的溶剂。合的溶剂。(5)低粘度。低粘度。

33、若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、乙醇、乙腈利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、乙醇、乙腈等。但粘度过于低的溶剂也不宜采用，例戊烷、乙等。但粘度过于低的溶剂也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它们易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响醚等，它们易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离分离. 46流动相及流动相的极性流动相及流动相的极性 （1）可可显显著著改改变变组组分分分分离离状状况况的的流流动动相相选选择择在在液液相相色色谱谱中中显显得得特特别别重重要要。 液液相相色色谱谱的的流流动动相又称为：淋洗液，洗脱剂。相又称为：淋洗液，洗脱剂。 （

34、2）亲亲水水性性固固定定液液常常采采用用疏疏水水性性流流动动相相，即即流流动动相相的的极极性性小小于于固固定定相相的的极极性性，称称为为正正相相液液液液色谱法色谱法，极性柱也称正相柱。，极性柱也称正相柱。 （3）若若流流动动相相的的极极性性大大于于固固定定液液的的极极性性，则则称称为为反反相相液液液液色色谱谱，非非极极性性柱柱也也称称为为反反相相柱柱。组组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。 47流动相组成流动相组成 流动相按组成不同可分为单组分和多组分；流动相按组成不同可分为单组分和多组分； 按极性可分为极性、弱极性、非极性；按极性可分为极性、弱极性、非极

35、性； 按使用方式有固定组成淋洗和梯度淋洗。按使用方式有固定组成淋洗和梯度淋洗。常用溶剂常用溶剂: : 己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。 采采用用二二元元或或多多元元组组合合溶溶剂剂作作为为流流动动相相可可以以灵灵活活调调节节流流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。481. 吸吸附附色色谱谱（液液-固固吸吸附附色色谱谱）：以以固固体体吸吸附附剂剂为为固固定定相相，如如硅硅胶胶、氧氧化化铝铝等等，较较常常使使用用的的是是510m的的硅硅胶胶吸吸附附剂剂。流动相可以是各种不同

36、极性的一元或多元溶剂。流动相可以是各种不同极性的一元或多元溶剂。2. 分分配配色色谱谱（液液-液液分分配配色色谱谱）：早早期期通通过过在在载载体体上上涂涂渍渍一一薄薄层层固固定定液液制制备备固固定定相相, 现现多多为为化化学学键键合合固固定定相相，即即用用化学反应的方法通过化学键将固定液结合在载体表面。化学反应的方法通过化学键将固定液结合在载体表面。3-4高效液相色谱法的主要类型及选择高效液相色谱法的主要类型及选择HPLC根据分离机理的不同分为几种类型：根据分离机理的不同分为几种类型：49高效液相色谱法的主要分离类型高效液相色谱法的主要分离类型3. 离离子子交交换换色色谱谱：固固定定相相为为离

37、离子子交交换换树树脂脂，流流动动相相为为无无机机酸酸或或无无机机碱碱的的水水溶溶液液。各各种种离离子子根根据据它它们们与与树树脂脂上的交换基团的交换能力的不同而得到分离。上的交换基团的交换能力的不同而得到分离。4. 凝凝胶胶色色谱谱（空空间间排排阻阻色色谱谱）：以以凝凝胶胶为为固固定定相相。凝凝胶胶是是一一种种经经过过交交联联的的、具具有有立立体体网网状状结结构构和和不不同同孔孔径径的的多多聚聚体体的的通通称称。如如葡葡聚聚糖糖凝凝胶胶、琼琼脂脂糖糖等等软软质质凝凝胶胶；多孔硅胶、聚苯乙烯凝胶等硬质凝胶；多孔硅胶、聚苯乙烯凝胶等硬质凝胶；503-4 高效液相色谱法的主要类型及选择高效液相色谱法

38、的主要类型及选择一、液一液分配色谱法（一、液一液分配色谱法（LLPC） 在液在液-液色谱中，流动相和固定相都是液体液色谱中，流动相和固定相都是液体,它能它能适用于各种样品类型的分离和分析适用于各种样品类型的分离和分析，无论是极性的，无论是极性的和非极性的，水溶性和油溶性的，离子型的和非离和非极性的，水溶性和油溶性的，离子型的和非离子型的化合物。子型的化合物。1分离原理分离原理 液液分配色谱的分离原理基本与液液萃取相同，液液分配色谱的分离原理基本与液液萃取相同，都是根据物质在两种互不相溶的液体中溶解度的不都是根据物质在两种互不相溶的液体中溶解度的不同，具有不同的分配系数。同，具有不同的分配系数。

39、所不同的是液液色谱的所不同的是液液色谱的分配是在柱中进行的，使这种分配平衡可反复多次分配是在柱中进行的，使这种分配平衡可反复多次进行，造成各组分的差速迁移，提高了分离效率，进行，造成各组分的差速迁移，提高了分离效率，从而能分离各种复杂组分。从而能分离各种复杂组分。 51 2、固定相、固定相 由由于于液液液液色色谱谱中中流流动动相相参参与与选选择择竞竞争争，因因此此，对对固固定定相相选选择择较较简简单单。只只需需使使用用几几种种极极性性不不同同的的固固定定液液即即可可解解决决分分离离问问题题。例例如如，最最常常用用的的强强极极性性固固定定液液，一一氧氧二二丙丙腈腈，中中等等极极性性的的聚聚乙乙二

40、二醇醇，非非极极性的性的角鲨烷角鲨烷等。等。 为了更好解决固定液在载体上流失问题。产生为了更好解决固定液在载体上流失问题。产生了了化学键合固定相化学键合固定相。它是将各种不同有机基团通过。它是将各种不同有机基团通过化学反应键合到载体表面的一种方法。它代替了固化学反应键合到载体表面的一种方法。它代替了固定液的机械涂渍，因此它的产生对液相色谱法迅速定液的机械涂渍，因此它的产生对液相色谱法迅速发展起着重大作用，发展起着重大作用，可以认为它的出现是液相色谱可以认为它的出现是液相色谱法的一个重大突破法的一个重大突破。它是目前应用最广泛的一种固它是目前应用最广泛的一种固定相。据统计，定相。据统计，约有约有

41、3/4以上的分离问题是在化学键以上的分离问题是在化学键合固定相上进行的。详细介绍见后。合固定相上进行的。详细介绍见后。 523流动相流动相 在液液色谱中为了避免固定液的流失。对流在液液色谱中为了避免固定液的流失。对流动相的一个基本要求是流动相尽可能不与固定相动相的一个基本要求是流动相尽可能不与固定相互溶，而且流动相与固定相的极性差别越显著越互溶，而且流动相与固定相的极性差别越显著越好。根据所使用的流动相和固定相的极性程度，好。根据所使用的流动相和固定相的极性程度，将其分为将其分为正相分配色谱正相分配色谱和和反相分配色谱反相分配色谱。 如果采用如果采用流动相的极性小于固定相的极性流动相的极性小于

42、固定相的极性，称称为为正相分配色谱正相分配色谱，它适用于极性化合物的分离。它适用于极性化合物的分离。其其流出顺序是极性小的先流出，极性大的后流出。流出顺序是极性小的先流出，极性大的后流出。 如果采用如果采用流动相的极性大于固定相的极性流动相的极性大于固定相的极性，称，称为为反相分配色谱反相分配色谱。它适用于非极性化合物的分离，。它适用于非极性化合物的分离，其其流出顺序与正相色谱恰好相反。流出顺序与正相色谱恰好相反。 53二、化学键合相色谱法（二、化学键合相色谱法（CBPC） 采采用用化化学学键键合合相相的的液液相相色色谱谱称称为为化化学学键合相色谱法，简称键合相色谱。键合相色谱法，简称键合相色

43、谱。 由由于于键键合合固固定定相相非非常常稳稳定定，在在使使用用中中不不易易流流失失，适适用用于于梯梯度度淋淋洗洗，特特别别适适用用于于分分离离容容量量因因子子k值值范范围围宽宽的的样样品品。由由于于键键合合到到载载体体表表面面的的官官能能团团可可以以是是各各种种极极性性的，因此它适用于种类繁多样品的分离。的，因此它适用于种类繁多样品的分离。541键合固定相类型键合固定相类型 用用来来制制备备键键合合固固定定相相的的载载体体，几几乎乎都都用用硅硅胶胶。利利用用硅硅胶胶表表面面的的硅硅醇醇基基(Si一一OH)与与有有机机分分子子可可成成键键,即即可可得得到到各各种种性性能能的的固固定定相相。一一

44、般般可可分分三三类类（1）疏疏水水基基团团 如如不不同同链链长长的的烷烷烃烃（C8和和C18）和苯基等和苯基等（2）极性基团极性基团 如氨丙基，氰基、醚和醇等。如氨丙基，氰基、醚和醇等。（3）离离子子交交换换基基团团 如如作作为为阴阴离离子子交交换换基基团团的的胺胺基，季胺盐；作为阳离子交换基团的磺酸基等基，季胺盐；作为阳离子交换基团的磺酸基等.552反相健合相色谱法反相健合相色谱法 此此法法的的固固定定相相是是采采用用极极性性较较小小的的键键合合固固定定相相，如如硅硅胶胶一一C18H37、硅硅胶胶一一苯苯基基等等；流流动动相相是是采采用用极极性性较较强强的的溶溶剂剂，如如甲甲醇醇水水、乙乙腈

45、腈一一水水、水水和和无机盐的缓冲溶液等。无机盐的缓冲溶液等。 它它多多用用于于分分离离多多环环芳芳烃烃等等低低极极性性化化合合物物；若若采采用用含含一一定定比比例例的的甲甲醇醇或或乙乙腈腈的的水水溶溶液液为为流流动动相相，也也可可用用于于分分离离极极性性化化合合物物；若若采采用用水水和和无无机机盐盐的的缓缓冲冲液液为为流流动动相相，则则可可分分离离一一些些易易离离解解的的样样品品，如如有有机机酸酸、有有机机碱碱、酚酚类类等等。反反相相键键合合相相色色谱谱法法具有柱效高，能获得无拖尾色谱峰的优点。具有柱效高，能获得无拖尾色谱峰的优点。 563.正相键合相色谱法正相键合相色谱法 此此法法是是以以极

46、极性性的的有有机机基基团团，CN、NH2双双羟羟基基等等键键合合在在硅硅胶胶表表面面作作为为固固定定相相；而而以以非非极极性性或或极极性性小小的的溶溶剂剂（如如烃烃类类）中中加加入入适适量量的的极极性性溶溶剂剂（如如氯氯仿仿、醇醇、乙乙腈腈等等）为为流流动动相相，分分离离极极性性化化合合物物。此此时时，组组分分的的分分配配比比k值值随随其其极极性性的的增增加加而而增增大大，但但随随流流动动相相极极性的增加而降低。性的增加而降低。 这这种种色色谱谱方方法法主主要要用用于于分分离离异异构构体体、极极性性不不同同的的化化合合物物，特特别别适适用用于于分分离离不不同同类类型型的化合物。的化合物。574

47、.离子性键合相色谱法离子性键合相色谱法 当当以以薄薄壳壳型型或或全全多多孔孔微微粒粒型型硅硅胶胶为为基基质质，化化学学键键合合各各种种离离子子交交换换基基团团，如如一一SO3H 一一CH2NH2、C00H等等时时，就就形形成成了了离离子子性性键键合合相相色色谱谱的的固固定定相相；流流动动相相一一般般采采用用缓冲溶液。其缓冲溶液。其分离原理与离子交换色谱类同。分离原理与离子交换色谱类同。 以上讨论了各种类型化学键合相色谱法，归纳键合相以上讨论了各种类型化学键合相色谱法，归纳键合相色谱的最大优点是：色谱的最大优点是：通过改变流动相的组成和种类，可通过改变流动相的组成和种类，可有效地分离各种类型化合

48、物（非极性、极性和离子型）有效地分离各种类型化合物（非极性、极性和离子型）。此外，由于键合到载体上的基团不易流失，特别适用于此外，由于键合到载体上的基团不易流失，特别适用于梯度淋洗。据统计，在高效液相色谱法中，约有梯度淋洗。据统计，在高效液相色谱法中，约有80的的分离问题是用键合相色谱法解决。此法的最大缺点是不分离问题是用键合相色谱法解决。此法的最大缺点是不能用于酸、碱度过大或存在氧化剂的缓冲溶液作流动相能用于酸、碱度过大或存在氧化剂的缓冲溶液作流动相的体系。的体系。58 59三、液一固吸附色谱法三、液一固吸附色谱法(LSAC) 液一固吸附色谱是以固体吸附剂作为固定液一固吸附色谱是以固体吸附剂

49、作为固定相，吸附剂通常是些多孔的固体颗粒物质，在它相，吸附剂通常是些多孔的固体颗粒物质，在它们的表面存在吸附中心。们的表面存在吸附中心。液固色谱实质是根据物液固色谱实质是根据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分离的质在固定相上的吸附作用不同来进行分离的。1分离原理分离原理 当当流流动动相相通通过过固固定定相相（吸吸附附剂剂）时时，吸吸附附剂剂表表面面的的活活性性中中心心就就要要吸吸附附流流动动相相分分子子。同同时时，当当试试样样分分子子（X）被被流流动动相相带带入入柱柱内内，与与流流动动相相溶溶剂分子（剂分子（S）在固定相表面发生竞争吸附）在固定相表面发生竞争吸附: X + nS吸附吸附= X

50、吸附吸附 + nS60 X + nS吸附吸附= X吸附吸附 + nS达平衡时，有达平衡时，有 其中其中K为吸附平衡常数为吸附平衡常数，值大表示组分在吸附剂上，值大表示组分在吸附剂上保留强，难于洗脱。保留强，难于洗脱。K值小值小,则保留值弱，易于洗脱。则保留值弱，易于洗脱。试样中各组分据此得以分离。试样中各组分据此得以分离。K值可通过吸附等温值可通过吸附等温线数据求出。线数据求出。 612固定相固定相 吸吸附附色色谱谱所所用用固固定定相相多多是是一一些些吸吸附附活活性性强强弱弱不不等等的的吸吸附附剂剂，如如硅硅胶胶、氧氧化化铝铝、聚聚酸酸胶胶等等。由由于于硅硅胶胶的的优优点点较较多多，因因此此，

51、以硅胶用得最多。以硅胶用得最多。 在在高高效效液液相相色色谱谱法法中中，表表面面多多孔孔型型和和全全多多孔孔型型都都可可作作吸吸附附色色谱谱中中的的固固定定相相，目目前最广泛使用的还是前最广泛使用的还是全多孔型微粒填料。全多孔型微粒填料。623、流动相、流动相 一般把吸附色谱中流动相称作洗一般把吸附色谱中流动相称作洗脱剂。在吸附色谱中对极性大的试样往往采脱剂。在吸附色谱中对极性大的试样往往采用极性强的洗脱剂；对极性弱的试样宜用极用极性强的洗脱剂；对极性弱的试样宜用极性弱的洗脱剂。性弱的洗脱剂。63四、离子交换色谱法（四、离子交换色谱法（IEC） 此法是利用此法是利用离子交换原理和液相色离子交换

52、原理和液相色谱技术的结合来测定溶液中阳离子和阴谱技术的结合来测定溶液中阳离子和阴离子的一种分离分析方法。离子的一种分离分析方法。凡在溶液中凡在溶液中能够电离的物质，通常都可用离子交换能够电离的物质，通常都可用离子交换色谱法进行分离。它不仅色谱法进行分离。它不仅适用无机离子适用无机离子混合物的分离，亦可用于有机物的分离混合物的分离，亦可用于有机物的分离，例如氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分例如氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子。因此，应用范围较广。子。因此，应用范围较广。 641离子交换原理离子交换原理 离离子子交交换换色色谱谱法法是是利利用用不不同同待待测测离离子子对对固固定定相相亲亲和和力力的的

53、差差别别来来实实现现分分离离的的。其其固固定定相相采采用用离离子子交交换换树树脂脂，树树脂脂上上分分布布有有固固定定的的带带电电荷荷基基团团和和可可游游离离的的平平衡衡离离子子。当当待待分分析析物物质质电电离离后后产产生生的的离离子子可可与与树树脂脂上上可可游游离离的的平平衡衡离离子子进进行行可可逆逆交交换，其交换反应通式如下：换，其交换反应通式如下：阳离子交换：阳离子交换： 阴离子交换： 一般形式：一般形式： R一一AB RBA65 2固定相固定相 作为固定相的离子交换剂，其基作为固定相的离子交换剂，其基质大致有三大类：合成树脂（聚苯乙烯）、质大致有三大类：合成树脂（聚苯乙烯）、纤维素和硅胶

54、。而离子交换剂又有阳离子纤维素和硅胶。而离子交换剂又有阳离子和阴离子之分。再根据官能基的离解度大和阴离子之分。再根据官能基的离解度大小还有强弱之分（见下表）小还有强弱之分（见下表）66673流动相流动相 离离子子交交换换色色谱谱法法所所用用流流动动相相大大都都是是一一定定pH和和盐盐浓浓度度（或或离离子子强强度度）水水的的缓缓冲冲溶溶液液。通通过过改改变变流流动动相相中中盐盐离离子子的的种种类类、浓浓度度和和pH值值可可控控制制k值值，改改变变选选择择性性。如如果果增增加加盐盐离离子子的的浓浓度度，则则可可降降低低样样品品离离子子的的竞竞争争吸吸附附能能力力，从而降低其在固定相上的保留值。从而

55、降低其在固定相上的保留值。 关关于于pH值值的的影影响响，要要视视不不同同情情况况而而定定。例例如如，分分离离有有机机酸酸和和有有机机碱碱时时，这这些些酸酸碱碱的的离离解解程程度度可可通通过过改改变变流流动动相相的的pH值值来来控控制制。增增大大pH值值会会使使酸酸的的电电离离度度增增加加，使使碱碱的的电电离离度度减减少少；降降低低PH值值，其其结结果果相相反反。但但无无论论属属于于哪哪种种情情况况，只只要要电电离离度度增增大大，就就会会使使样样品品的的保保留留增增大。大。 68五、凝胶色谱法（五、凝胶色谱法（SEC） 凝凝胶胶色色谱谱法法又又称称尺尺寸寸排排阻阻色色谱谱法法，主主要要用用于于

56、较较大大分分子子的的分分离离。与与其其他他液液相相色色谱谱方方法法原原理理不不同同，它它不不具具有有吸吸附附、分分配配和和离离子子交交换换作作用用机机理理，而而是是基基于于试试样样分子的尺寸和形状不同来实现分离的。分子的尺寸和形状不同来实现分离的。 尺寸排阻色谱被广泛应用于大分子的分级，即用来尺寸排阻色谱被广泛应用于大分子的分级，即用来分析大分子物质相对分子质量的分布。它具有其他分析大分子物质相对分子质量的分布。它具有其他液相色谱所没有的特点：（液相色谱所没有的特点：（1）保留时间是分子尺寸）保留时间是分子尺寸的函数，有可能提供分子结构的某些信息。的函数，有可能提供分子结构的某些信息。(2)保

57、留保留时间短，谱峰窄，易检测，可采用灵敏度较低的检时间短，谱峰窄，易检测，可采用灵敏度较低的检测器（测器（3）固定相与分子间作用力极弱，趋于零。由）固定相与分子间作用力极弱，趋于零。由于柱子不能很强保留分子，因此柱寿命长。（于柱子不能很强保留分子，因此柱寿命长。（4）不）不能分辨分子大小相近的化合物，相对分子质量差别能分辨分子大小相近的化合物，相对分子质量差别必须大于必须大于10才能得以分离。才能得以分离。69 1分离原理分离原理 凝胶色谱是按分子大小顺序进行分凝胶色谱是按分子大小顺序进行分离的一种色谱方法。其固定相为化学情离的一种色谱方法。其固定相为化学情性多孔物质性多孔物质凝胶凝胶，它类似

58、于分子筛，它类似于分子筛，但孔径比分子筛大。凝胶内具有一定大但孔径比分子筛大。凝胶内具有一定大小的孔穴，小的孔穴，体积大的分子不能渗透到孔体积大的分子不能渗透到孔穴中去而被排阻，较早地被淋洗出来；穴中去而被排阻，较早地被淋洗出来；中等体积的分子部分渗透；小分子可完中等体积的分子部分渗透；小分子可完全渗透入内，最后洗出色谱柱全渗透入内，最后洗出色谱柱。这样，这样，样品分子基本上按其分子大小，排阻先样品分子基本上按其分子大小，排阻先后由柱中流出。其渗透过程模型见图：后由柱中流出。其渗透过程模型见图：70聚合物溶液进入色谱柱后，由聚合物溶液进入色谱柱后，由于浓度差，所有溶质分子都力于浓度差，所有溶质

59、分子都力图向凝胶表面孔穴渗透。图向凝胶表面孔穴渗透。体积较小的分子体积较小的分子既能进入既能进入较大的孔穴，也可以进入较小较大的孔穴，也可以进入较小的孔穴的孔穴，向孔内扩散的较深；向孔内扩散的较深；体积较大的分子体积较大的分子只能进入只能进入较大的孔穴；较大的孔穴；体积更大的分子体积更大的分子不能进入不能进入孔穴，只能从凝胶的空隙流过。孔穴，只能从凝胶的空隙流过。聚合物试样进入色谱柱后处于溶剂的淋洗之下：聚合物试样进入色谱柱后处于溶剂的淋洗之下：1) 高分子量级分在柱内停留时间很短，很快就被溶高分子量级分在柱内停留时间很短，很快就被溶剂淋洗出来；剂淋洗出来；2) 分子量中等级分在柱内的停留时间

60、较长，它们随分子量中等级分在柱内的停留时间较长，它们随淋洗液缓慢的带出；淋洗液缓慢的带出；3) 分子量最小的级分在柱内的停留时间最长，最后分子量最小的级分在柱内的停留时间最长，最后被溶剂淋洗出；被溶剂淋洗出； 按按照照淋淋出出的的先先后后顺顺序序，依依次次收收集集到到分分子子量量从从大大到到小的各个级分，从而达到对聚合物分级的目的。小的各个级分，从而达到对聚合物分级的目的。732固定相固定相 排阻色谱固定相种类很多，一般可分为软性、半刚性和刚排阻色谱固定相种类很多，一般可分为软性、半刚性和刚性凝胶三类。性凝胶三类。 所谓凝胶，指含有大量液体（一般是水）的柔软而富于弹所谓凝胶，指含有大量液体（一

61、般是水）的柔软而富于弹性的物质，它是一种经过交联而具有立体网状结构的多聚体。性的物质，它是一种经过交联而具有立体网状结构的多聚体。 （1）软软性性凝凝胶胶 如如葡葡聚聚糖糖凝凝胶胶、琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶都都具具有有较较小小的的交交联联结结构构，其其微微孔孔能能吸吸入入大大量量的的溶溶剂剂，并并能能溶溶胀胀到到它它们们干干体体的的许许多多倍倍。它它们们适适用用以以水水溶溶性性溶溶剂剂作作流流动动相相，一一般般用用于于小小分分子子质质量量物物质的分析，不适宜用在高效液相色谱中。质的分析，不适宜用在高效液相色谱中。 （2）半半刚刚性性凝凝胶胶 如如高高交交联联度度的的聚聚苯苯乙乙烯烯（Styrage

62、l）比比软软性性凝凝胶胶稍稍耐耐压压，溶溶胀胀性性不不如如软软性性凝凝胶胶。常常以以有有机机溶溶剂剂作作流流动动相相。用于高效液相色谱时，流速不宜大。用于高效液相色谱时，流速不宜大。 （3）刚刚性性凝凝胶胶 如如多多孔孔硅硅胶胶、多多孔孔玻玻璃璃等等它它们们既既可可用用水水溶溶性性溶溶剂剂，又又可可用用有有机机溶溶剂剂作作流流动动相相，可可在在较较高高压压强强和和较较高高流流速速下下操操作作。一一般般控控制制压压强强小小于于7MPa，流流速速1cm3s-1；否否则则将将影影响响凝凝胶孔径，造成不良分离。胶孔径，造成不良分离。743流动相流动相 排阻色谱所选用的流动相必须能溶解样排阻色谱所选用的

63、流动相必须能溶解样品，并必须与凝胶本身非常相似，溶剂也必须品，并必须与凝胶本身非常相似，溶剂也必须能能溶胀凝胶溶胀凝胶。另外，溶剂的粘度要小。选择溶剂还另外，溶剂的粘度要小。选择溶剂还必须与检测器相匹配。常用的流动相有四氢呋喃、必须与检测器相匹配。常用的流动相有四氢呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酸胺和水等。甲苯、氯仿、二甲基酸胺和水等。 以水溶液为流动相的凝胶色谱适用于水以水溶液为流动相的凝胶色谱适用于水溶性样品，以有机溶剂为流动相的凝胶色谱适用溶性样品，以有机溶剂为流动相的凝胶色谱适用于非水溶性样品。于非水溶性样品。二、二、GPC结构和仪器工作示意图结构和仪器工作示意图试样和溶剂注入系统，主要包括

64、：溶剂储槽、脱气室、过滤器、精密计量泵、进样装置；色谱柱系统，包括柱温控制箱；检测系统各种检测器（RI、UV等）；数据处理系统（包括模数转换器、计算机、打印机/绘图仪等）；控制系统。溶剂的选择溶剂的选择 在在凝凝胶胶色色谱谱分分离离中中, ,溶溶剂剂是是流流动动相相，它它的的作作用用没没有有其其他他液液相相色色谱谱重重要要。样样品品中中不不同同分分子子量量级级分分的的分分离离并并不不依依赖赖于于溶溶剂剂与与样样品品之之间间的的相相互互作作用用力力。因因此此溶溶剂剂的的选选择择主主要要是是从从对对样样品品的的溶溶解解能能力力, , 溶溶剂剂与与仪仪器器的的匹匹配配以以及及实实验结果处理的方便来考

65、虑。验结果处理的方便来考虑。2 2、色谱柱系统色谱柱系统 包括参与柱、分离柱和柱温控制箱。色谱柱是包括参与柱、分离柱和柱温控制箱。色谱柱是一支内部装有凝胶填料的不锈钢管。柱内凝胶材料一支内部装有凝胶填料的不锈钢管。柱内凝胶材料的选择很重要，要有较高的分离效果、良好的化学的选择很重要，要有较高的分离效果、良好的化学稳定性、热稳定性，同时还要求有较好的机械强度稳定性、热稳定性，同时还要求有较好的机械强度和低流动阻力。和低流动阻力。 交联交联PSPS凝胶凝胶适用于非极性有机溶剂。适用于非极性有机溶剂。多孔硅胶多孔硅胶化学惰性、热稳定性、机械强度好、化学惰性、热稳定性、机械强度好、可以在柱中直接更换溶

66、剂。可以在柱中直接更换溶剂。多孔玻璃多孔玻璃水溶液体系水溶液体系凝胶色谱柱的选择凝胶色谱柱的选择1）根据渗透极限和分离范围进行选择；通常可采用搭配柱子的方法, 将不同规格的凝胶柱串联起来, 可以起到更好的分离效果；2）根据溶剂体系水溶性/油溶性；3）考虑凝胶的热稳定性、机械强度和化学惰性差。3.3.检测系统检测系统 检测器的作用是将色谱柱淋出液中样品的组成、含量的变化转化为可供检测的信号，从而完成定性、定量的判断分离情况的任务。 用于GPC的检测器很多，包括：示差折光检测器适用于所有聚合物的检测；紫外/红外检测器适用于对该检测器有特殊响应的聚合物。 自动馏分收集器自动计算出淋出液的体积； 由此

67、得到随淋洗时间延长样品中不同级份的含量变化。从而得到被测样品中的相对分子量和相对分子量分布的信息。4.数据处理和控制系统数据处理和控制系统 GPC仪器配置有一台计算机工作站，它的主要功能的两项：自动地对检测结果进行数据处理，最后给出分子量分布和平均分子量的数据和曲线。对仪器的工作状态进行控制，包括温度、压力、流速； 整个测试过程都要在严格的恒温条件下进行。三三 GPC谱图和校正曲线谱图和校正曲线 使使用用GPC进进行行分分子子量量大大小小和和分分布布的的测测定定过过程程中中，仪器记录了两个方面的数据：仪器记录了两个方面的数据：（1）淋出体积；（）淋出体积；（2）淋出液中溶质的相对浓度；）淋出液

68、中溶质的相对浓度； GPC谱图的横坐谱图的横坐标为淋出体积，它标为淋出体积，它反映了聚合物分子反映了聚合物分子量的大小；量的大小；纵坐标纵坐标是淋出液中溶质浓是淋出液中溶质浓度的响应，它反映度的响应，它反映了某一级分的相对了某一级分的相对含量。含量。淋出体积与分子量之间的转换淋出体积与分子量之间的转换 选选择择已已知知分分子子量量且且分分子子量量分分布布为为单单分分散散性性的的聚聚合合物物作作为为标标准准样样品品，在在相相同同的的条条件件下下对对标标准准样样品品进进行行GPC测测试试，得得到到淋淋出出体体积积。以以log M 对对Ve作作图图，可可以以得到一条直线得到一条直线 分子量分子量-淋

69、出体积标定曲线。淋出体积标定曲线。直线方程为：直线方程为： log M = A BVe A、B均为常数均为常数 淋出液中分子量的直接测定淋出液中分子量的直接测定 随随着着科科学学技技术术水水平平的的提提高高，人人们们现现在在已已经经开开发发出出了了多多种种高高灵灵敏敏度度的的检检测测器器，包包括括小小角角激激光光光散射检测器、粘度检测器光散射检测器、粘度检测器。 采采用用示示差差折折光光检检测测器器与与光光散散射射检检测测器器或或者者自自动动粘粘度度检检测测器器联联用用方方式式。GPC在在对对淋淋出出液液进进行行示示差差折折光光检检测测得得到到淋淋出出液液中中级级分分相相对对浓浓度度的的同同时

70、时，光光散散射射检检测测器器或或者者自自动动粘粘度度检检测测器器可可以以将将该该级级分分的的分分子子量量直直接接测测定定出出来来，不不再再需需要要使使用用PS标准试样做普适曲线来标定。标准试样做普适曲线来标定。85 色谱法基本要求色谱法基本要求1. 掌握色掌握色谱法的分法的分类，色，色谱流出曲流出曲线及有关及有关术语；2. 掌握色掌握色谱法的基本理法的基本理论，了解柱效的影响因素；，了解柱效的影响因素；3. 掌握分离度与柱效、掌握分离度与柱效、选择因子、容量因子、分析因子、容量因子、分析时间之之间关系；关系；4. 了解定性、定量分析方法；了解定性、定量分析方法；5. 掌握气相色掌握气相色谱流程

71、及气相色流程及气相色谱仪的的结构；构；6.了解气相色了解气相色谱固定相的特性；固定相的特性；7. 了解了解检测器性能指器性能指标的描述方法；的描述方法；8. 掌握液相色掌握液相色谱仪的基本的基本结构及基本概念；构及基本概念；9. 了解液相色了解液相色谱法的主要法的主要类型及固定相、流型及固定相、流动相的相的选择。10.了解色了解色谱方法方法选择。86 思考题思考题1 1现需分离分析一氨基酸试样，拟采用哪种色谱？现需分离分析一氨基酸试样，拟采用哪种色谱？2 2提高液相色谱中柱效的最有效途径是什么？提高液相色谱中柱效的最有效途径是什么？3. 3. 何谓反相液相色谱？何谓正相液相色谱？何谓反相液相色

72、谱？何谓正相液相色谱？4. 4. 在液相色谱法中，梯度淋洗适用于分离何种试样？在液相色谱法中，梯度淋洗适用于分离何种试样？5. 5. 在在液液相相色色谱谱中中，范范氏氏方方程程中中的的哪哪一一项项对对柱柱效效能能的的影影响响可可以以忽忽 略不计？略不计？(p369)(p369)6. 6. 对下列试样，用液相色谱分析，应采用何种检测器：对下列试样，用液相色谱分析，应采用何种检测器： （l l）长链饱和烷烃的混合物）长链饱和烷烃的混合物 （2 2）水源中多环芳烃化合物。）水源中多环芳烃化合物。7. 7. 对对聚聚苯苯乙乙烯烯相相对对分分子子质质量量进进行行分分级级分分析析，应应采采用用哪哪一一种种液液相相色谱法？色谱法？8 8什么是化学键合固定相？它的突出优点是什么？什么是化学键合固定相？它的突出优点是什么？9 9什么叫梯度洗脱？它与气相色谱中的程序升温有何异同？什么叫梯度洗脱？它与气相色谱中的程序升温有何异同？10.10.指出下列各种色谱法，最适宜分离的物质。指出下列各种色谱法，最适宜分离的物质。 （l l）气气液液色色谱谱；(2) (2) 正正相相色色谱谱；（3 3）反反相相色色谱谱；（4 4）离离子子交换色谱交换色谱; ;（5 5）凝胶色谱；）凝胶色谱；(6(6）气固色谱；）气固色谱；(7(7）液固色谱。）液固色谱。