免疫荧光细胞化学技术ppt课件

《免疫荧光细胞化学技术ppt课件》由会员分享，可在线阅读，更多相关《免疫荧光细胞化学技术ppt课件（44页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、第四章第四章 免疫荧光细胞化学技术免疫荧光细胞化学技术1ppt课件免疫荧光细胞化学技术免疫荧光细胞化学技术( (immunofluorescenceimmunofluorescence cytochemistrycytochemistry) ) 采采用用荧荧光光素素标标记记的的已已知知抗抗体体或或抗抗原原作作为为探探针针，检检测测待待测测细细胞胞或或组组织织内内的的靶靶抗抗原原或或抗抗体体，形形成成带带有有荧荧光光素素的的抗抗原原抗抗体体复复合合物物。利利用用荧荧光光显显微微镜镜观观察察标标本本，根根据据组组织织细细胞胞中中荧荧光光物物质质的的存存在在，确确定定抗抗原原或或抗抗体体的的性质并定

2、位，以及利用定量技术测定含量。性质并定位，以及利用定量技术测定含量。2ppt课件荧光抗体法：荧光抗体法：用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法。用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法。 较常用较常用荧光抗原法：荧光抗原法：用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法。用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法。荧光抗体法荧光抗体法+ +荧光抗原法荧光抗原法= =免疫荧光细胞（组织）技术免疫荧光细胞（组织）技术免疫荧光细胞化学技术免疫荧光细胞化学技术包括荧光抗体法和荧光抗原法包括荧光抗体法和荧光抗原法3ppt课件免疫荧光细胞化学方法：免疫荧光细胞化学方法： 直接法、间接法、补体法直接法、间接法、补

3、体法免疫荧光染色标本制备：免疫荧光染色标本制备： 涂片、印片、细胞单层培养物、组织切片涂片、印片、细胞单层培养物、组织切片 经适当固定后染色，或不固定直接染色。经适当固定后染色，或不固定直接染色。 存档蜡块：存档蜡块：不能再用以免疫荧光染色不能再用以免疫荧光染色 存档的存档的HEHE染色标本染色标本：褪褪去去盖盖片片和和颜颜色色，再再作作免免疫疫荧荧光光或或其其它它免免疫疫细细胞胞化化学学的染色。的染色。4ppt课件主主要要内内容容一一、荧荧光光的的特特征征二二、荧荧光光素素三三 、 荧荧 光光 素素 标标 记记 抗抗 体体 的的 方方 法法四四 、 荧荧 光光 抗抗 体体 的的 质质 量量

4、鉴鉴 定定五五 、 免免 疫疫 荧荧 光光 组组 化化 染染 色色 方方 法法六六、荧荧光光显显微微镜镜七七 、 非非 特特 异异 性性 荧荧 光光 的的 消消 除除 方方 法法 八、八、免疫荧光细胞化学的对照染色免疫荧光细胞化学的对照染色 九、激光扫描共聚焦显微镜九、激光扫描共聚焦显微镜5ppt课件一一、荧荧光光的的特特征征 分分子子都都含含有有电电子子，电电子子在在不不停停地地运运动动着着。根根据据量量子子理理论论，运运动动着着的的电电子子可可以以处处于于一一系系列列不不连连续续的的能能量量状状态态中中，电电子子遵遵守守一一定定的的规规则则，要要以以从从一一个个能能级级向向另另一一能能级级

5、跃跃迁迁，并并伴伴随随着着与与能能级级差差相相对对应应的的特特定定能能量量的吸收或释放。的吸收或释放。激发激发: : 当当电电子子吸吸收收能能量量跃跃迁迁到到较较高高能能级级 ， 这这 个个 过过 程程 叫叫 激激 发发 。发射发射: : 以以辐辐射射方方式式跃跃迁迁时时，能能量量转转化化成相应波长的光，这个过程叫发射。成相应波长的光，这个过程叫发射。6ppt课件荧光荧光 (fluorescence) 跃跃迁迁到到激激发发态态的的电电子子，大大多多处处于于单单重重激激发发态态。如如果果电电子子直直接接从从单单重重激激发发态态以以辐辐射射方方式式跃跃迁迁到到基基态态，由由于于单单重重激激发发态态

6、很很不不稳稳定定，半半衰衰期期很很短短，发射持续的时间也很短，这种发射光，叫荧光。发射持续的时间也很短，这种发射光，叫荧光。即即指指一一个个分分子子或或原原子子吸吸收收了了给给予予的的能能量量后后即即刻刻引引起起发发光光，停停止止能能量量供供给，发光也瞬时停止给，发光也瞬时停止( (一般持续一般持续lOlO-7-7lOlO-8-8s)s)。7ppt课件二二 荧荧光光素素 能够产生荧光并能作为染料的化合物称为荧光素；能够产生荧光并能作为染料的化合物称为荧光素； 必须具备：吸收激发光的光能并发射荧光。必须具备：吸收激发光的光能并发射荧光。 1 1 具具备备用用于于标标记记抗抗体体的的荧荧光光素素条

7、条件件 (1) (1) 应具有与蛋白质分子形成应具有与蛋白质分子形成共价键共价键的化学基团，结合后不易离解，而未的化学基团，结合后不易离解，而未 结合的色素及其降解产物易排除。结合的色素及其降解产物易排除。(2) (2) 荧荧 光光 效效 率率 高高 ， 与与 蛋蛋 白白 质质 结结 合合 后后 荧荧 光光 素素 质质 量量 下下 降降 不不 多多 。(3) (3) 标标 记记 后后 对对 抗抗 体体 的的 免免 疫疫 学学 性性 质质 和和 生生 化化 性性 质质 无无 影影 响响 。(4) (4) 结合方法简便而快速，并且较稳定。结合方法简便而快速，并且较稳定。(5) (5) 荧光素容易溶

8、解，溶解后不会和其他物质发生化学反应。荧光素容易溶解，溶解后不会和其他物质发生化学反应。(6) (6) 荧光颜色与背景组织的自发荧光颜色对比鲜明，能清晰判断结果。荧光颜色与背景组织的自发荧光颜色对比鲜明，能清晰判断结果。8ppt课件(1)(1)异硫氰酸荧光素异硫氰酸荧光素(FITC)(FITC) 呈呈黄黄色色、橙橙黄黄或或褐褐黄黄色色粉粉末末或或结结晶晶，性性质质稳稳定定，在在室室温温下下能能保保存存2 2年年以以上，在低温中可保存多年。易溶于水和酒精。呈现上，在低温中可保存多年。易溶于水和酒精。呈现黄绿色黄绿色荧光。荧光。 在在碱碱性性条条件件下下，FITCFITC的的异异硫硫氰氰酸酸基基在

9、在水水溶溶液液中中与与免免疫疫球球蛋蛋白白的的自自由由氨氨基经碳酰胺化而形成硫碳氨基键基经碳酰胺化而形成硫碳氨基键, ,成为标记荧光免疫球蛋白，即荧光抗体。成为标记荧光免疫球蛋白，即荧光抗体。一个一个IgGIgG分子最多能标记分子最多能标记15-2015-20个个FITCFITC分子分子2 2 荧光素的种类：荧光素的种类：最最大大吸吸收收光光谱谱：490490495nm495nm，最大发射光谱：最大发射光谱：520520530nm530nm。分子量：分子量：389.4KD389.4KD9ppt课件(2)(2)四乙基罗达明四乙基罗达明(RB200)(RB200) 褐褐红红色色粉粉末末，不不溶溶于

10、于水水，易易溶溶于于酒酒精精和和丙丙酮酮，性性质质稳稳定定，可可长长期期保保存存。呈呈明明亮亮橙橙红红色色荧荧光光。RB200RB200在在五五氯氯化化磷磷(PCl(PCl5 5) )作作用用下下转转变变成成磺磺酰酰氯氯，在在碱碱性性条件下易与蛋白质的赖氨酸一氨基反应结合而标记在蛋白分子上。条件下易与蛋白质的赖氨酸一氨基反应结合而标记在蛋白分子上。最大吸收光谱最大吸收光谱:570nm:570nm最大发射光谱最大发射光谱:596:596600nm600nm分子量：分子量：580KD580KD10ppt课件(3)(3)四甲基异硫氰酸罗达明四甲基异硫氰酸罗达明(TMRITC)(TMRITC) 紫红色

11、粉末，紫红色粉末，罗达明的衍生物，易溶于水，罗达明的衍生物，易溶于水，性质较稳定。呈性质较稳定。呈橙红色荧橙红色荧光光，与，与FITCFITC的黄绿色荧光对比清晰，与蛋白质结合方式同的黄绿色荧光对比清晰，与蛋白质结合方式同FITCFITC。它可。它可用于用于双标记双标记示踪研究。示踪研究。 最大吸收光谱最大吸收光谱:550nm:550nm 最大发射光谱最大发射光谱:620nm:620nm (4) 4-(4) 4-乙酰胺乙酰胺-4-4-异硫氰酸异硫氰酸-2-2-硫酸芪（硫酸芪（SITSSITS）-蓝色荧光蓝色荧光(5) (5) 得克萨斯红（得克萨斯红（Texas redTexas red）(6)

12、 (6) 藻红素藻红素R R(7) (7) 花青（花青（Cyanine,Cy2Cyanine,Cy2绿色绿色,Cy3,Cy3红色红色,Cy5,Cy5）11ppt课件三三、荧荧光光素素标标记记抗抗体体的的方方法法( (一一)FITC)FITC标标记记抗抗体体的的方方法法1 1 MarsshallMarsshall法法(1)(1)原原理理：当当FITCFITC在在碱碱性性溶溶液液中中与与抗抗体体反反应应时时，主主要要是是抗抗体体分分子子上上的的赖赖氨氨酸酸- -氨氨基基与与FITCFITC上上硫硫碳碳胺胺键键结结合合，一一个个IgGIgG分分子子中中有有8686个个赖赖氨氨酸酸残残基基，一般最多能

13、结合一般最多能结合15152020个。个。荧光素FITC-NCN-蛋白质FITC-NCN-蛋白质SHHHSH(2)(2)操操作作流流程程 抗抗体体与与荧荧光光素素比比例例为为50-100:150-100:1抗体的准备：抗体的准备：20mg/ml(20mg/ml(抗体抗体+ +生理盐水生理盐水+ +碳酸盐缓冲液）碳酸盐缓冲液） 碳碳酸酸盐盐缓缓冲冲液液为为总总量量的的1/101/10。荧荧光光素素的的准准备备：根根据据欲欲标标记记的的蛋蛋白白总总量量，每每毫毫克克加加入入0.01mgFITC0.01mgFITC12ppt课件结合（标记）：边搅拌边将称取的荧光素加入抗体溶液中（结合（标记）：边搅拌

14、边将称取的荧光素加入抗体溶液中（5-10min)。 避免粘于瓶壁或搅拌棒上，继续搅拌避免粘于瓶壁或搅拌棒上，继续搅拌12-18h12-18h，44 透析：离心去沉淀，装入透析袋透析：离心去沉淀，装入透析袋pH8.0pH8.0缓冲盐水透析过夜，缓冲盐水透析过夜，0-40-4 过柱：葡萄糖凝胶过柱：葡萄糖凝胶G50G50或或 G25G25柱柱 分离游离荧光素分离游离荧光素保保存存 4 4 -40-40等等量量甘甘油油分分装装保保存存。2 Chadwick2 Chadwick法法3 3 改良法改良法4 4 透透析析标标记记法法13ppt课件四四、荧荧光光抗抗体体的的质质量量控控制制主要进行特异性和敏

15、感性两个方面的鉴定。主要进行特异性和敏感性两个方面的鉴定。1 1 特异性染色效价测定特异性染色效价测定-与相应抗原标本染色与相应抗原标本染色 直直接接染染色色：倍倍比比稀稀释释荧荧光光抗抗体体1:21:2，1:4,1:81:4,1:8, ,“+”的的最最大大稀稀释释度度为为染染色色滴滴度度，实实际际染染色色可可取取低低1-21-2稀稀释释度度，如如染染色色滴滴度度1:641:64，实实际际为为1:321:32或或1:161:16； 间接染色：间接染色：“+”的最大稀释度为染色滴度。的最大稀释度为染色滴度。2 2 非特异性染色测定非特异性染色测定-与相类似抗原标本染色与相类似抗原标本染色3 3

16、吸收试验吸收试验-在荧光抗体中加入过量抗原，吸收后再用相应抗原阳性在荧光抗体中加入过量抗原，吸收后再用相应抗原阳性 标本染色，结果无明显阳性荧光。标本染色，结果无明显阳性荧光。4 F/P4 F/P比值的测定方法比值的测定方法F F（荧荧光光素素）和和P P（抗抗体体蛋蛋白白）的的克克分分子子比比值值反反映映荧荧光光抗抗体体的的特特异异性性染染色色质质量量， F/P=1-2F/P=1-2， 过高过高-非特异染色增强；非特异染色增强； 过低过低-荧光很弱，降低敏感性。荧光很弱，降低敏感性。14ppt课件荧光抗体的保存0-40-4或或-20-20低温保存，防止抗体活性降低和蛋白变性；低温保存，防止抗

17、体活性降低和蛋白变性；加入防腐剂：硫柳汞或叠氮钠；加入防腐剂：硫柳汞或叠氮钠；小量分装；小量分装；真空干燥后更易长期保存。真空干燥后更易长期保存。15ppt课件 1 1 直接法直接法 （1 1）基基本本原原理理 用用已已知知特特异异性性抗抗体体与与荧荧光光素素结结合合，制制成成荧荧光光特特异异性性抗抗体体，直直接接与与细细胞胞或或组组织织中中相相应应抗抗原原结结合合，在在荧荧光光显显微微镜镜下下即即可可见见抗抗原原存存在在部部位呈现特异性荧光。位呈现特异性荧光。特特点点：适适合合做做细细菌菌、螺螺旋旋体体、原原虫虫、真真菌菌及及浓浓度度较较高高的的蛋蛋白白质质抗抗原原如如肾肾、皮皮肤的检查和研

18、究。但一种荧光抗体只能检查一种抗原，敏感性较低肤的检查和研究。但一种荧光抗体只能检查一种抗原，敏感性较低五、荧光抗体染色方法五、荧光抗体染色方法适用标本：涂片、印片、细胞单层培养物或组织切片，经适当固定或不固定；适用标本：涂片、印片、细胞单层培养物或组织切片，经适当固定或不固定；方法：直接法、间接法、补体法方法：直接法、间接法、补体法16ppt课件 （2 2）器材）器材 荧光显微镜，恒冷箱切片机，剪刀，镊子，载玻片荧光显微镜，恒冷箱切片机，剪刀，镊子，载玻片。 （3 3）材料和试剂）材料和试剂 FITCFITCsIgsIg；0.01MPBS(Ph7.2).2)；100%100%丙酮；甘油缓冲液

19、。丙酮；甘油缓冲液。 （4 4）操作步骤）操作步骤 1 1）恒冷箱切片，厚）恒冷箱切片，厚5m5m，风吹干燥，风吹干燥30min30min。 2 2）100100冷丙酮固定冷丙酮固定lOminlOmin。 3 3）0.01M PBS0.01M PBS漂洗漂洗3 3次，次，5min/5min/次。次。 4 4）滴加）滴加1 1：5050100100的的FITCFITCsIgsIg，室温或，室温或3737湿盒内染色湿盒内染色30min30min。 5 5）0.01M PBS0.01M PBS漂洗漂洗3 3次，次，5min/5min/次。次。 6 6）封片，镜检。）封片，镜检。 7 7）阴性对照：采

20、用正常血清染色，结果为阴性。）阴性对照：采用正常血清染色，结果为阴性。 （5 5）结果）结果 荧光显微镜下观察，呈现黄绿色荧光部分为阳性细胞。荧光显微镜下观察，呈现黄绿色荧光部分为阳性细胞。17ppt课件 2 2 间接法间接法（1 1）基基本本原原理理先先用用未未标标记记特特异异性性抗抗原原与与细细胞胞或或组组织织内内抗抗体体反反应应，再再用用此此抗抗原原的的特特异异性性荧荧光光抗抗体体与与结结合合在在细细胞胞内内抗抗体体上上的的抗抗原原相相结结合合，抗抗原原夹夹在在细细胞胞抗体与荧光抗体之间，故称夹心法。抗体与荧光抗体之间，故称夹心法。 优优点点：只只需需制制备备一一种种荧荧光光抗抗体体可可

21、检检出出多多种种抗抗原原，敏敏感感性性较较高高，能能解解决决一一些些不不易易制制备备动动物物免免疫疫血血清清的的病病原原体体（麻麻疹疹）等等的的研研究究和和检检查查，广广泛泛应应用用于于自自身身抗体和感染病人血清的检验。抗体和感染病人血清的检验。 缺点：缺点：非特异性着色机会较多，染色时间长。非特异性着色机会较多，染色时间长。18ppt课件（2 2）操作步骤：）操作步骤： 1 1）切片或涂片固定后，置于染色湿盒内；）切片或涂片固定后，置于染色湿盒内； 2 2）滴加）滴加未标记的特异性抗原未标记的特异性抗原作用切片于作用切片于3737，30min30min； 3 3）PBSPBS漂洗漂洗3 3次

22、，次，5min/5min/次；次； 4 4）滴加）滴加FITCFITCsIgsIg再作用切片于再作用切片于3737，30min30min； 5 5）PBSPBS漂洗漂洗3 3次，次，5min/5min/次。次。 6 6）缓冲甘油封固，镜检。）缓冲甘油封固，镜检。 7 7）封片，）封片， 阴性对照：用正常血清代替一抗，其余步骤同上。阴性对照：用正常血清代替一抗，其余步骤同上。结果结果 黄绿色荧光处即阳性细胞分布部位。黄绿色荧光处即阳性细胞分布部位。19ppt课件3 3 补体法补体法用用特特异异性性抗抗体体和和补补体体混混合合液液与与标标本本上上的的抗抗原原反反应应，补补体体就就结结合合在在抗抗原

23、原抗抗体体复复合合物物上上，再再用用荧荧光光标标记记的的抗抗补补体体的的抗抗体体与与补补体体结结合合，从从而而形形成成抗抗原原抗抗体体补补体体抗抗补补体体荧荧光光复复合合物物。荧荧光光显显微微镜镜下下所所见见阳阳性性荧荧光光即即为为抗抗原原所所在部位。在部位。特特点点：很很敏敏感感，且且不不受受特特异异性性抗抗体体种种属属的的限限制制，适适用用于于各各种种动动物物抗抗体体的的检查方法。检查方法。方法：方法： 1 1）涂片或冰冻切片固定，）涂片或冰冻切片固定，PBSPBS水洗；水洗； 2 2）滴加免疫血清和补体等量混合液，）滴加免疫血清和补体等量混合液，3737，30min30min； 3 3）

24、PBSPBS洗涤；洗涤； 4 4）滴加）滴加抗补体荧光抗体抗补体荧光抗体3737，30min30min； 5 5）水洗，缓冲甘油封固。）水洗，缓冲甘油封固。适用：肾穿刺组织活检诊断等；适用：肾穿刺组织活检诊断等； 形态小的立克体、病毒颗粒或低浓度抗原。形态小的立克体、病毒颗粒或低浓度抗原。20ppt课件4 4 双重免疫荧光染色法双重免疫荧光染色法适用：适用：在同一细胞组织标本上需要同时显示两种抗原。在同一细胞组织标本上需要同时显示两种抗原。方法：方法：如如A A抗原的抗体抗原的抗体- FITC - FITC 标记，标记， B B抗原的抗体抗原的抗体- RB200- RB200标记。标记。 (1

25、)(1)一步双染法一步双染法 将两种标记抗体按适当比例混合（将两种标记抗体按适当比例混合（A+B)A+B)； 直接法进行染色反应。直接法进行染色反应。(2)(2)二步双染法二步双染法 先用先用RB200RB200标记的标记的B B抗体抗体, ,不必洗去；不必洗去； 再用再用FITCFITC标记的标记的A A抗体染色；抗体染色； 按间接法进行。按间接法进行。 结果：结果： A A抗原呈黄绿色荧光；抗原呈黄绿色荧光； B B抗原呈桔红色荧光。抗原呈桔红色荧光。21ppt课件5 膜抗原荧光抗体染色方法原理和步骤：原理和步骤：直接法或间接法；直接法或间接法；适适用用：可可对对活活细细胞胞在在试试管管内

26、内进进行行染染色色，常常用用于于T T和和B B细细胞胞、细细胞培养物、瘤细胞抗原、受体等。胞培养物、瘤细胞抗原、受体等。结果：结果：阳性荧光主要在细胞膜上。阳性荧光主要在细胞膜上。 6 6 荧光抗体再染色法荧光抗体再染色法荧光抗原染色法荧光抗原染色法抗原用荧光素标记，少用。抗原用荧光素标记，少用。22ppt课件六六、荧荧光光显显微微镜镜检检查查方方法法1 1 荧光显微镜荧光显微镜 超超高高压压光光源源、滤滤板板系系统统( (包包括括激激发发和和压压制制滤滤板板) )、光光学学系系统统和和摄摄影影系系统统等等主主要部件组成，是利用一定波长的光激发标本发射荧光。要部件组成，是利用一定波长的光激发

27、标本发射荧光。（1 1）光源）光源 光光源源的的亮亮度度应应根根据据荧荧光光素素的的类类型型选选择择。小小功功率率汞汞灯灯可可满满足足激激励励一一般般荧荧光光染染料料的的要要求求。对对于于免免疫疫荧荧光光染染色色需需用用大大功功率率超超高高压压汞汞灯灯。其其工工作作时时，两两个个电电极极间间放放电电，引引起起球球内内水水银银蒸蒸发发，经经过过5 515min15min，球球内内气气压压升升至至50507070标标准准大大气气压压，此时达到最高亮度，成为稳定工作状态。此时达到最高亮度，成为稳定工作状态。（2 2）滤滤板板系系统统：包包括括激激发发滤滤片片，阻阻断断滤滤片片、隔隔热热滤滤片片，分分

28、光光镜镜和和其其他他中中性性滤滤片片。是是荧荧光光显显微微镜镜的的重重要要组组成成部部分分，是是获获得得特特定定波波长长光光，清清晰晰的的荧荧光光影影像像和和发发挥挥显显微微镜镜最最佳佳性性能能之之关关键键。了了解解滤滤片片性性能能，正正确确地地选选择择滤滤片片是是观观察察荧荧光光效效应的前提和必要条件。应的前提和必要条件。23ppt课件荧光显微镜的滤片系统激励法激励法分光镜分光镜激发滤光片激发滤光片截止滤光片截止滤光片 用途用途U UDM400DM400BP330-385BP330-385BP360-370BP360-370BA420BA420自自动动荧荧光光观观察察法法，DAPIDAPI(

29、 (联联脒脒基基吲吲哚哚) )：DNA DNA HoechestHoechest 33358,33342 33358,33342染色体染色体V VDM455DM455BP400-410BP400-410BA455BA455儿茶酚胺观察儿茶酚胺观察BVBVDM455DM455BP400-440BP400-440BA475BA475芥子喹吖因；染色体芥子喹吖因；染色体BP420-440BP420-440硫磺素硫磺素S S：淋巴细胞：淋巴细胞吖淀黄素：核酸吖淀黄素：核酸B BDM500DM500BP450-480BP450-480BA515BA515异硫氰酸荧光素异硫氰酸荧光素：荧光抗体观察：荧光抗

30、体观察BP470-490BP470-490吖啶橙吖啶橙：DNADNA，RNARNABP420-480BP420-480金胺结核杆菌金胺结核杆菌IBIBDM505DM505PB460-490PB460-490BA515IFBA515IFBP470-490BP470-490G GDM570DM570BP510-550BP510-550BA590BA590罗丹明罗丹明BP530-550BP530-550四甲基罗丹明异硫氰酸盐四甲基罗丹明异硫氰酸盐：荧光抗体观察：荧光抗体观察BP480-550BP480-550碘化丙啶：碘化丙啶：DNADNAIGIGDM565DM565BP520-550BP520-5

31、50BA580IFBA580IFDM600DM600BP545-580BP545-580BA610IFBA610IF德克萨斯红：荧光抗体观察德克萨斯红：荧光抗体观察24ppt课件2 2 标标本本制制作作要要求求(1) (1) 载载 玻玻 片片 厚厚 度度 应应 在在 0.60.6 1.2mm1.2mm之之 间间 （ 有有 时时 需需 石石 英英 玻玻 璃璃 载载 玻玻 片片 ) )(2) (2) 盖盖 玻玻 片片 应应 光光 洁洁 ， 厚厚 度度 在在 0.17mm0.17mm左左 右右 （ 有有 时时 需需 干干 涉涉 盖盖 玻玻 片片 ) )(3) (3) 标本标本不能太厚，如太厚激发光大

32、部分消耗在标本下部，而物镜直接观不能太厚，如太厚激发光大部分消耗在标本下部，而物镜直接观察到的上部不能充分激发光；细胞重叠或杂质掩盖易非特异着色。察到的上部不能充分激发光；细胞重叠或杂质掩盖易非特异着色。 (4) (4) 封片剂封片剂 常用甘油，必须无自发荧光，无色透明，荧光的亮度在常用甘油，必须无自发荧光，无色透明，荧光的亮度在pH8.5pH8.59.59.5时较亮，不易很快褪去。甘油和时较亮，不易很快褪去。甘油和0.5mol/L pH9.00.5mol/L pH9.09.59.5的碳酸盐缓的碳酸盐缓冲液等量混合作封片剂（室温过夜，待气泡消失可使用冲液等量混合作封片剂（室温过夜，待气泡消失可

33、使用) )。荧荧光光信信号号增增强强封封片片剂剂 mowiolmowiol 40-88 40-88 4.8g4.8g 甘甘油油 12ml12ml 蒸蒸馏馏水水 12ml12ml 0.2mol/L Tris(pH8.5) 24ml 0.2mol/L Tris(pH8.5) 24ml混混合合加加热热溶溶解解，5000g5000g离离心心，15min15min，最最后后加加入入DABcosDABcos，终终浓浓度度2.52.5，溶溶解解后后，分分装装存存于于-20-20中中。(5) (5) 镜油镜油: :无荧光；可用甘油、液体石蜡替代。无荧光；可用甘油、液体石蜡替代。25ppt课件3 3 使使用用荧

34、荧光光显显微微镜镜注注意意事事项项(1) (1) 严严 格格 按按 说说 明明 书书 操操 作作 ， 不不 要要 随随 意意 改改 变变 程程 序序 ；(2) (2) 应应在在暗暗室室中中进进行行检检查查。汞汞灯灯点点燃燃5-15min5-15min，光光源源稳稳定定后后观观察察；(3) (3) 防防止止紫紫外外线线对对眼眼睛睛的的损损害害。在在调调整整光光源源时时应应戴戴上上防防护护眼眼镜镜；(4) (4) 检检查查时时间间每每次次以以1 12h2h为为宜宜，超超过过90min90min，超超高高压压汞汞灯灯强强度度逐逐渐渐下下降降，荧光减弱；标本在紫外线照射荧光减弱；标本在紫外线照射3-5

35、min3-5min后，荧光减弱；最多不超后，荧光减弱；最多不超2-3h; 2-3h; (5) (5) 荧荧光光显显微微镜镜光光源源寿寿命命有有限限，标标本本应应集集中中检检查查，以以节节省省时时间间，保保护护光光源源。光光源源关关闭闭后后必必须须在在30min30min后后才才能能再再启启动动光光源源，一一天天中中应应避避免免数数次次点点燃光源；燃光源；(6) (6) 标标本本染染色色后后应应立立即即观观察察。(7) (7) 荧荧光光高高度度的的判判断断标标准准，分分四四级级“ ”为为阴阴性性，“ ”为为仅仅能能见见明明确确可可见见的的荧荧光光；“ ”为为可可见见有有明明亮亮的的荧荧光光；“

36、”为为可可见见耀耀眼的荧光。眼的荧光。26ppt课件27ppt课件4 荧光图像的记录方法荧光图像：具有形态学特征、荧光的颜色和亮度荧光图像：具有形态学特征、荧光的颜色和亮度荧光显微镜摄影：荧光显微镜摄影：基本同普通显微镜摄影技术基本同普通显微镜摄影技术高速感光胶片如高速感光胶片如ASA200以上或以上或24以上半半自自动动或或全全自自动动显显微微摄摄影影系系统统装装置置，或或CCD与与计计算算机机联联接接，将图像存在软盘上将图像存在软盘上缺缺点点：紫紫外外光光对对荧荧光光猝猝灭灭作作用用大大（如如FITC标标记记物物，紫紫外外光光照照射射30s，荧荧光光亮度降低亮度降低50%），曝光速度要求高

37、。），曝光速度要求高。28ppt课件29ppt课件30ppt课件七七 、 非非 特特 异异 性性 染染 色色 的的 产产 生生 及及 消消 除除 方方 法法产生的原因：产生的原因：（1 1）部部分分荧荧光光素素未未与与蛋蛋白白质质结结合合，形形成成了了聚聚合合物物和和衍衍化化物物，而而不不能能被被透透析析除去。除去。（2 2）抗抗体体以以外外的的血血清清蛋蛋白白与与荧荧光光素素结结合合形形成成荧荧光光素素脲脲蛋蛋白白，可可与与组组织织成成分分结合。结合。（3 3）组织中还可能存在类属抗原与相应抗体结合。）组织中还可能存在类属抗原与相应抗体结合。（4 4）制备的免疫血清中混杂抗其他组织成分的抗体

38、。）制备的免疫血清中混杂抗其他组织成分的抗体。（5 5）抗抗体体分分子子上上标标记记的的荧荧光光素素分分子子太太多多，过过量量标标记记的的抗抗体体分分子子带带过过多多的的阴阴离子，可吸附于正常组织上而呈现非特异性染色。离子，可吸附于正常组织上而呈现非特异性染色。（6 6）荧光素不纯，标本固定不当等。）荧光素不纯，标本固定不当等。 31ppt课件非特异性染色的消除方法非特异性染色的消除方法1 1 动物脏器粉末吸收法：动物脏器粉末吸收法： 常用：肝粉（猪、鼠）、骨髓粉、鼠脑粉、鸡胚粉常用：肝粉（猪、鼠）、骨髓粉、鼠脑粉、鸡胚粉 原理：对荧光抗体的荧光色素和蛋白都有吸收作用，消除非特异着色原理：对荧

39、光抗体的荧光色素和蛋白都有吸收作用，消除非特异着色 方法：每毫升荧光抗体中加入肝粉方法：每毫升荧光抗体中加入肝粉50-100mg50-100mg混匀混匀44过夜过夜离离 心心取上清取上清临用前加入荧光抗体进行吸收临用前加入荧光抗体进行吸收2 2 透析法透析法 原理：荧光素如原理：荧光素如FITCFITC分子可通过半透膜，而蛋白质大分子不能透过，可分子可通过半透膜，而蛋白质大分子不能透过，可 将未结合的荧光素透析除去。将未结合的荧光素透析除去。 方法：将标记完毕的荧光蛋白液装入透析袋方法：将标记完毕的荧光蛋白液装入透析袋 浸浸入入pH7.2-7.4pH7.2-7.4的的PBSPBS中中，44，每

40、每日日更更换换3-43-4次次PBSPBS，约约5-75-7天天，透透析液无荧光即可（荧光光源照射）析液无荧光即可（荧光光源照射） 32ppt课件3 3 葡葡 聚聚 糖糖 G-50G-50柱柱 层层 析析 法法目的：除去游离荧光素目的：除去游离荧光素方法：方法：加入荧光抗体加入荧光抗体15-18ml-15-18ml-即将入柱时加即将入柱时加PBS-PBS-关闭下口关闭下口30-40min-30-40min-游离荧光素进入分游离荧光素进入分子筛孔氏加入洗脱液子筛孔氏加入洗脱液-荧光抗体向下移行荧光抗体向下移行并与游离荧光素拉开距离并与游离荧光素拉开距离-荧光抗体流出荧光抗体流出- -前、中、后三

41、部分收集，测前、中、后三部分收集，测F/PF/P比值，合比值，合并、浓缩、分装并、浓缩、分装-继续加入洗脱液，直继续加入洗脱液，直至洗脱液中无蛋白和荧光素止。至洗脱液中无蛋白和荧光素止。33ppt课件4 DEAE4 DEAE纤维素柱层析法纤维素柱层析法 去除标记过多或过少荧光素的抗体分子去除标记过多或过少荧光素的抗体分子5 5 荧光抗体稀释法荧光抗体稀释法6 6 纯化抗原方法纯化抗原方法7 7 纯化抗体方法纯化抗体方法8 8 伊文氏蓝衬染方法：伊文氏蓝衬染方法： 0.01%0.01%伊伊文文氏氏蓝蓝 + + 0.01mol/LPH7.2PBS 0.01mol/LPH7.2PBS 稀稀释释荧荧光

42、光抗抗体体，可可将将背背景景细细胞胞和和组组织织染染色色呈呈红红色色荧荧光光，与与特特异异性性荧荧光光成成对对比比，减减少少非非特特异异性性荧荧光光，宜宜作作常常规应用。规应用。9 9 胰酶消化或胰酶消化或10%10%牛血清蛋白封闭牛血清蛋白封闭34ppt课件八、八、 免疫荧光细胞化学的对照染色免疫荧光细胞化学的对照染色 为为了了排排除除某某些些非非特特异异性性染染色色，保保证证免免疫疫荧荧光光细细胞胞化化学学染染色色的的准准确确性性，必必须须在在初初次次试试验验时时进进行行以以上上对对照照试试验验，从从而检测抗原与抗体的结合是否是特异的。常用对照如下：而检测抗原与抗体的结合是否是特异的。常用

43、对照如下： 阳性对照阳性对照 阴性对照阴性对照 自发荧光对照自发荧光对照35ppt课件1 1 阳性对照阳性对照用已知存在某相应抗原组织标本染色，结果为阳性用已知存在某相应抗原组织标本染色，结果为阳性2 2 阴性对照阴性对照(1)(1)吸收实验吸收实验 用用已已知知的的相相应应抗抗原原与与标标记记的的抗抗体体反反应应，然然后后离离心心除除去去反反应应物物，再再用用吸吸收收过过荧光抗体的液体与标本内抗原反应，结果应为阴性。荧光抗体的液体与标本内抗原反应，结果应为阴性。 (2)(2)抑制实验抑制实验 用用未未标标记记荧荧光光素素的的抗抗体体与与标标本本内内相相应应靶靶抗抗原原反反应应，然然后后再再加

44、加入入用用荧荧光光素标记的相同抗体进行染色反应，结果应为阴性。素标记的相同抗体进行染色反应，结果应为阴性。 二步抑制法二步抑制法： 标本先加未标记的特异性抗体，再加标记荧光抗体。标本先加未标记的特异性抗体，再加标记荧光抗体。 一步抑制法：一步抑制法： 先将荧光抗体用未标记抗体作适量混合，再加在标本上染色。先将荧光抗体用未标记抗体作适量混合，再加在标本上染色。效果较二步法好，并且简便。效果较二步法好，并且简便。 36ppt课件(3)(3)抗原对照抗原对照 用确知不存在某相应抗原的标本染色。用确知不存在某相应抗原的标本染色。 (4)(4)抗体对照抗体对照 用用与与特特异异性性抗抗体体种种属属相相同

45、同的的动动物物正正常常血血清清或或同同一一动动物物免免疫疫前前血血清清标标记记荧荧光素代替免疫血清。光素代替免疫血清。3 3 自发荧光对照自发荧光对照 标本只加标本只加PBSPBS或不加或不加PBSPBS。37ppt课件结结束束38ppt课件九、激光扫描共聚焦显微镜九、激光扫描共聚焦显微镜 LSCMLSCM 是是8080年代发展起来的一项具有划时代意义的高科技新产品。年代发展起来的一项具有划时代意义的高科技新产品。实实现现了了对对细细胞胞内内部部非非侵侵入入式式光光学学断断层层扫扫描描成成像像，从从而而对对被被检检物物体体样样品品从从停停留留到到表表面面单单层层，静静态态平平面面的的观观察察进

46、进行行到到立立体体，断断层层扫扫描描、动动态态全全面面的的观观察察，在生命科学研究中得到迅速应用。在生命科学研究中得到迅速应用。1 1 仪仪器器构构成成 (1)(1)计计算算机机系系统统：控控制制着着机机械械，光光学学、声声学学系系统统及及各各种种外外围围设设备备。 (2)(2)激光照射系统：氩离子激光器和声光调节器。激光照射系统：氩离子激光器和声光调节器。 (3)(3)显微镜系统，它主要由倒置显微镜和共聚焦系统组成。显微镜系统，它主要由倒置显微镜和共聚焦系统组成。 (4)(4)检测系统，由检测器，检测放大器等元件组成。检测系统，由检测器，检测放大器等元件组成。 (5)X(5)XY Y平台平台

47、 (6)Z-(6)Z-轴步进马达轴步进马达39ppt课件40ppt课件2 2 共聚焦成像原理共聚焦成像原理 激激光光器器发发出出的的激激光光束束经经过过光光的的扩扩束束和和整整形形，变变成成一一束束直直径径较较大大的的平平行行光光束束，长长通通分分色色光光镜镜使使光光束束偏偏转转9090度度，经经过过物物镜镜会会聚聚在在物物镜镜的的焦焦点点上上，样样品品中中的的荧荧光光物物质质在在激激光光的的激激发发下下发发出出沿沿各各个个方方向向的的荧荧光光，一一部部分分荧荧光光经经过过物物镜镜，长长通通分分色色反反射射镜镜，聚聚焦焦透透镜镜，会会聚聚在在聚聚焦焦透透镜镜的的焦焦点点外外，经经过焦点处的针孔

48、，由检测器接收并转变成电信号。过焦点处的针孔，由检测器接收并转变成电信号。 3 3 光光信信号号接接收收和和成成像像方方式式 (1)(1)光信号接收光信号接收 生物样品发出的荧光通常有二种接收方式：生物样品发出的荧光通常有二种接收方式： 由光电倍增管（由光电倍增管（PMTPMT）把光信号转变成电信号；）把光信号转变成电信号； 利用电荷耦合器（利用电荷耦合器（CCDCCD）把光信号转变成电信号。）把光信号转变成电信号。 (2)(2)成像方式成像方式 载载物物台台运运动动成成像像：以以直直径径很很小小的的激激光光束束照照射射样样品品，照照射射点点发发出出的的荧荧光光信信号号经经PMTPMT变变成成

49、电电信信号号，然然后后载载物物台台移移动动到到下下一一点点，记记录录该该点点的的荧荧光光强强度度。该该方方法无轴向像差，成像时间长；法无轴向像差，成像时间长； 反反射射扫扫描描成成像像方方式式，通通过过转转动动反反射射镜镜使使激激光光连连续续照照射射样样品品，由由CCDCCD摄摄像像机机记录下照射点所发射的荧光，成像速度快。记录下照射点所发射的荧光，成像速度快。41ppt课件42ppt课件4 4 参参数数的的选选择择基基本本参参数数：Confocal,pinhole,detectorConfocal,pinhole,detector, , PMT,StepsizePMT,Stepsize, X

50、 points, Y Points, , X points, Y Points, scanstr,speed,LaserPwr,Autoscanstr,speed,LaserPwr,Auto zoom, Display, zoom, Display, BRsubval,SamplesBRsubval,Samples/pt/pt等等5 5 性能特点：性能特点： 分分辨辨率率高高，灵灵敏敏度度高高，扫扫描描速速度度快快，扫扫描描范范围围大大，图图像像存存取取方方便便，可可进进行光切片的观察，可进行定量荧光分析。行光切片的观察，可进行定量荧光分析。43ppt课件6 6 应用应用 (1) (1) 组组

51、织织光光学学切切片片 可可对对活活的的或或固固定定的的细细胞胞及及组组织织进进行行无无损损伤伤的的系系列列“ 光光学学切切片片”， 得到其各层面的信息得到其各层面的信息- -“ 显微显微CTCT”。 (2) (2) 三维图像重建三维图像重建 (3)(3)细胞物理和生物化学测定细胞物理和生物化学测定 (4)(4)荧光的定量、定位分析荧光的定量、定位分析 (5)Ca(5)Ca2+2+、pHpH及其他细胞内离子的实时定量测定及其他细胞内离子的实时定量测定 (6)(6)粘附细胞的分选粘附细胞的分选 (7)(7)激光细胞显微外科及光陷阱技术激光细胞显微外科及光陷阱技术 (8)(8)荧光光漂白恢复（荧光光漂白恢复（FRAPFRAP）技术）技术 (9)(9)胞间通讯的研究胞间通讯的研究 (10)(10)细胞膜流动性测定细胞膜流动性测定 (11)(11)光活化技术光活化技术44ppt课件