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1、实验实验 0Y 果蝇遗传标志分析果蝇遗传标志分析-PAPD一、实验目的：一、实验目的：1. 掌握掌握RAPD分析根本方法技术分析根本方法技术;2. 了解分子标志的重要运用价值了解分子标志的重要运用价值 .二、主要内容：二、主要内容：基因基因DNA提取提取 PCR反响反响 电泳电泳 电泳图谱的察看、分析电泳图谱的察看、分析助教：助教： 王家文王家文 1D.Virilis -10只只 2黑腹果黑腹果蝇P、F1、F2 3其他其他资料料 - 0.2g1份份3种果蝇样品种果蝇样品+2种其他种其他/小组小组 果蝇用本人存的资料。果蝇用本人存的资料。资料：资料：1.提取粗提取粗DNA液液如今先做合理分工、协
2、调时间：如今先做合理分工、协调时间：每份资料普通果蝇每份资料普通果蝇20只、大果蝇只、大果蝇10只、或其他资料只、或其他资料0.2g+50L匀匀浆缓冲液匀冲液匀浆液体倒入液体倒入1.5ml离心管离心管 +等等V苯酚苯酚-氯仿氯仿1:1颠倒混匀颠倒混匀30s,12000rpm，5分钟。分钟。助教把握助教把握时间！+ 50 L 10%SDS颠倒混匀倒混匀20s，65度水浴度水浴30min参与参与200L的匀的匀浆液液10000rpm，3min，转移上清。转移上清。移上清于另一离心移上清于另一离心管，管，+等等V苯酚苯酚-氯氯仿仿1:1颠倒混颠倒混匀，匀，13000rpm，5分钟。分钟。12000r
3、pm，10min移上清于另一离心移上清于另一离心管，参与管，参与2倍体积倍体积的无水乙醇，静置的无水乙醇，静置10min。弃上清，弃上清，70%乙醇洗乙醇洗涤沉淀，涤沉淀， 10000rpm，3min弃上清，超净台吹弃上清，超净台吹干沉淀。参与干沉淀。参与20ul的无菌水，溶解沉的无菌水，溶解沉淀，备用。淀，备用。留意：转移上清时记住上清的准确体积，另外转移时操作要小心，留意：转移上清时记住上清的准确体积，另外转移时操作要小心，枪头从液面上层往下层缓慢的挪动，不要带入其它杂质。枪头从液面上层往下层缓慢的挪动，不要带入其它杂质。1 组织匀匀浆液曾液曾经预备好好 ： LiCl 0.40 molL-
4、1 TrisHCl 0.20 molL-1pH9.0 EDTA 2.5 mmolL-1RNaseA 100 gL-12 SDS 10% 曾经预备好曾经预备好相关试剂相关试剂(3) 25 x TAE(在在15离心离心时配制配制) 500ml 用于后用于后边的的电泳泳 Tris 12.1 g 冰醋酸冰醋酸 2.86 mL Na2EDTA2H2O 1.86 g ddH2O 定容到定容到100 mL (一人配置，全班公用，用一人配置，全班公用，用时稀稀释)三、实验原理三、实验原理 :RAPD:建立在建立在PCR根底上的一种分子根底上的一种分子标志。志。模板高温模板高温变性性足足够低的温度下通常低的温度
5、下通常为36与随机与随机引物普通引物普通10个个bp退火退火 PCR 电泳泳假假设两个退火位点足两个退火位点足够近近200-2000bp左右、分左右、分别位位于互于互补的的DNA链上，可以上，可以经过PCR扩增出增出DNA片段。片段。 引物结合位点引物结合位点DNA序列的改动以及两扩增位点之序列的改动以及两扩增位点之间间DNA碱基的缺失、插入或置换均可导致扩增片段数碱基的缺失、插入或置换均可导致扩增片段数目和长度的差别，经电泳分别后经过目和长度的差别，经电泳分别后经过EB染色以检测染色以检测DNA片段的多态性。片段的多态性。 假设位点假设位点2处碱基发生改动，那么处碱基发生改动，那么 3. R
6、APD反响反响1在在0.2ml PCR管中配制管中配制20l反响体系反响体系 随机引物随机引物 1L ddH2O 6L 每组领取每组领取5份样品所需量份样品所需量各组等分各组等分5份份 分分别别加加5种种样样品的模板品的模板DNA 各各 3L包括包括 dNTP Mixture, Taq酶, 10PCR bufferPCR mixture 10 L 2在在PCR热循循环仪中中进展如下反响：展如下反响： 94 200s 94 60s36 60s72 120s 40个循个循环 72 (300s-600s)4电泳后泳后继课中中* 1.5%琼脂糖凝胶用脂糖凝胶用20mL的的1TAE溶解溶解琼脂糖脂糖配制
7、配制电泳，察看比泳，察看比较不同品系或同一品系不同品系或同一品系亲子代子代间的条的条带的不同，并照相的不同，并照相记录。*第第12周周“非中断非中断杂交交实验的的“扩菌、倒一切的平板步菌、倒一切的平板步骤后可后可以由一个同窗提早一会儿以由一个同窗提早一会儿进展展操作分工操作分工技术问题技术问题本卷须知本卷须知实验课教师实验课教师助教指点：助教指点：实验报告为果蝇系列实验的最后部分：实验报告为果蝇系列实验的最后部分： 1. 简单表达简单表达RAPD的实验原理、处理的实验原理、处理的问题；的问题； 2. 实验结果照片显示出来信实验结果照片显示出来信号弱的可用画方式图辅助表达，标出样品号弱的可用画方
8、式图辅助表达，标出样品称号、差别条带等，进展分析。称号、差别条带等，进展分析。 补充知识课后阅读：补充知识课后阅读：RAPDRFLPAFLPSTRSNPn n利用利用1010个碱基的一个或几个随机引个碱基的一个或几个随机引物非定点地物非定点地扩扩增增DNADNA片段，普通一个片段，普通一个引物可引物可扩扩增增6-126-12条条DNADNA片段，利用片段，利用凝胶凝胶电电泳分开泳分开扩扩增的片段，从而增的片段，从而进进展展基因多基因多态态性研性研讨讨。n nRAPDRAPD是一种能快速是一种能快速进进展基因多展基因多态态性研性研讨讨的技的技术术，并且由于不涉及印迹，并且由于不涉及印迹杂杂交、放
9、射性自交、放射性自显显影等技影等技术术，因此，因此简简便易行。便易行。RAPD是英文是英文Restriction Fregrmeat Length Po1ymor Restriction Fregrmeat Length Po1ymor PhismPhism的的缩缩写，意思是写，意思是“ “限制性片段限制性片段长长度多度多态态性。性。RFLPRFLP是根据不同种是根据不同种类类个体基因个体基因组组的限制性内切的限制性内切酶酶的的酶酶切位点碱基切位点碱基发发生突生突变变，或，或酶酶切位点之切位点之间发间发生了碱基的插入、生了碱基的插入、缺失，缺失，导导致致酶酶切片段大小切片段大小发发生了生了变变
10、化，化，这这种种变变化可以化可以经过经过特定探特定探针杂针杂交交进进展展检测检测，从而可比，从而可比较较不同种不同种类类个体的个体的DNADNA程度的差程度的差别别即多即多态态性，多个探性，多个探针针的比的比较较可以确立可以确立生物的生物的进进化和分化和分类类关系。关系。所用的探所用的探针为针为来源于同种或不同种基因来源于同种或不同种基因组组DNADNA的克隆，位的克隆，位于染色体的不同位点，从而可以作于染色体的不同位点，从而可以作为为一种分子一种分子标标志志(Mark)(Mark)，构建分子构建分子图谱图谱。RFLPRFLPRFLPAFLP:Amplified Fragment Length
11、 Polymorphism. AFLP technology combines the power of Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) with the flexibility and power of PCR.“AFLP续：由于变异、进化，一种引物可以使某一由于变异、进化，一种引物可以使某一品系的品系的DNA片段复制扩增，而不能使另片段复制扩增，而不能使另一品系的一品系的DNA片段复制扩增。片段复制扩增。电泳分别：同一引物扩增电泳分别：同一引物扩增品系品系1品系品系2引物如：引物如：EcoRI和和MseI相关相关引物引物荧光标
12、志全自动荧光标志全自动AFLP原理与方法原理与方法短串联反复序列短串联反复序列STRs (short tendem repeats, mini-satellites )STR广泛存在于人基因组，占约广泛存在于人基因组，占约5%，根本单位是根本单位是1bp-8bp的串联反复，的串联反复，反复次数反复次数 n=15-60，知，知8000多个，多个，主要方式为：主要方式为： (CA)n ， (GA)n ， (AA)n ， (GG)n ， (CAA)n， (CGG)n ，其中以，其中以 (CA)n ， (GT)n 为多见。为多见。1992年，年，Welssenbanch等以等以STR为标志的为标志的第
13、二代连锁图取代了第二代连锁图取代了RFLP连锁图。连锁图。可变数目串联反复序列可变数目串联反复序列VNTRs (variable number tandem repeats)每个每个 VNTR 都含有都含有10-15 bp中心序列，中心序列，VNTR与与STR比较类似，但是反复顺序更长；比较类似，但是反复顺序更长；多态性及分布方面不如多态性及分布方面不如STR，因此，因此VNTR作作为遗传标志只是一种过渡，目前已较少运用，为遗传标志只是一种过渡，目前已较少运用，但是，但是，VNTR曾经对曾经对STR的基因定位运用起到的基因定位运用起到推进作用。推进作用。定义：不同个体间，基因组定义：不同个体间
14、，基因组DNA某部位的某部位的 单核苷酸的变异。单核苷酸的变异。 1996年，年，Lander报道了用单核苷酸多态性报道了用单核苷酸多态性标志标志single nucleotid polymorphism SNP制备第三代遗传连锁图的遗传标志。制备第三代遗传连锁图的遗传标志。可经过杂交、序列分析、电泳等检测。可经过杂交、序列分析、电泳等检测。单核苷酸多态性单核苷酸多态性single nucleotid polymorphism，SNP1，The most abundant DNA marker present in the human genome， about 90% of sequence
15、s variants in human are SNP. There is one SNP in every 1000 bases leads to an estimate that any two individuals differ by up to three million SNPs. 2，A few hundred thousand are currently identified, but 17 million of SNPs out of 3 billion are estimated.3, SNPs in coding regions of genes have been te
16、rmed cSNPs, about 500,000 of cSNPs and an average of about 6 per gene. Frequency of SNP in Human Genome1, Neutral alteration: a base substitution with no effect on the amino acid residue encoded.2, Conservative change: a base substitution that results in an altered amino acid, but has minimal effect
17、 on protein structure or function.3, Non-conservative alteration: leading to a change in the encoded amino acid residue that has dramatic effects on protein structure or function. The Functional Effects of cSNPs Major changes in protein structure can result from subtle variation in the genetic sequence encoding it. These changes can completely block the function of the protein in vivo and can also affect the development of high-throughput(高通亮高通亮) assays for screening therapeutic compounds.
