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1、College of Bioengineering, Jimei University, CHINA第二章第二章 紫外紫外可见分光光度法可见分光光度法2.1 2.1 引言引言2.2 2.2 紫外可见吸收光谱紫外可见吸收光谱2.3 2.3 光吸收定律光吸收定律Lambert-BeerLambert-Beer定律定律2.4 2.4 紫外可见分光光度计紫外可见分光光度计2.5 2.5 分析条件的选择分析条件的选择2.6 UV-Vis2.6 UV-Vis光度法的应用光度法的应用1College of Bioengineering, Jimei University, CHINA光谱分析法光谱分析法：利
2、用物质与光（辐射能）相互作用而：利用物质与光（辐射能）相互作用而建立起来的定性、定量和结构分析方法建立起来的定性、定量和结构分析方法。作用粒子：原子光谱法作用粒子：原子光谱法分子光谱法和核磁共振波谱法分子光谱法和核磁共振波谱法吸收和发射光：吸收和发射光：吸收光谱和发射光谱吸收光谱和发射光谱光的能量：光的能量： 射线光谱法、射线光谱法、x x射线光谱法、射线光谱法、 紫外可见光谱法、红外光谱法紫外可见光谱法、红外光谱法 等等分分类类2.1 2.1 引言引言2College of Bioengineering, Jimei University, CHINA 紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法定
3、义：（又称：紫外可见吸收光谱法）是根据定义：（又称：紫外可见吸收光谱法）是根据溶液中物质的分子或离子对紫外溶液中物质的分子或离子对紫外可见光谱可见光谱区的辐射能的吸收来研究物质的组成和结构的区的辐射能的吸收来研究物质的组成和结构的方法。方法。l较高的灵敏度和准确度，检出限可达较高的灵敏度和准确度，检出限可达10-7 10-7 g/mlg/ml，相对误差通常为相对误差通常为1%1%5%5%。l该方法仪器设备简单、操作方便、易于掌握和该方法仪器设备简单、操作方便、易于掌握和推广，是常用分析方法之一推广，是常用分析方法之一。3College of Bioengineering, Jimei Univ
4、ersity, CHINA光是一种电磁波光是一种电磁波整个电磁波包括：整个电磁波包括：无线电波无线电波微波微波红外光红外光可见光可见光紫外光紫外光X X射线射线 射线射线共同特点：横向电磁波，在真空中的传播速度共同特点：横向电磁波，在真空中的传播速度等于光速，即等于光速，即4College of Bioengineering, Jimei University, CHINA光具有波粒二象性，即波动性和粒子性。光具有波粒二象性，即波动性和粒子性。波动性：折射、衍射、偏振及干涉等性质。波动性：折射、衍射、偏振及干涉等性质。粒子性：具有动量，光电效应。粒子性：具有动量，光电效应。光的特性光的特性5C
5、ollege of Bioengineering, Jimei University, CHINA光子的能量与波长的关系（反比）光子的能量与波长的关系（反比）能量能量J J或或eVeVPlanckPlanck常数常数6.626106.62610-34 -34 JsJs频率，频率，HzHz光速光速2.998 102.998 108 8 m/sm/s波长波长nmnm1 1eV=1.602 eV=1.602 1010-19 -19 J J 96.55kJ/mol96.55kJ/mol6College of Bioengineering, Jimei University, CHINA例：计算波长为例
6、：计算波长为200 200 nmnm的光子的能量的光子的能量解：解：7College of Bioengineering, Jimei University, CHINA各种电磁波谱波长范围各种电磁波谱波长范围：无线电波无线电波 1 11000 1000 m m微波微波 10 10-3-31 1 m m红外红外 0.76 0.761000 1000 m m可见可见 400 400800 800 n nm m紫外紫外 10 100 0400 400 n nm m近紫外近紫外200200400400远紫外远紫外10100 0200 200 X X射线射线 0.01 0.0110 10 n nm m
7、本章重点本章重点讨论讨论8College of Bioengineering, Jimei University, CHINA2.2 2.2 紫外可见吸收光谱紫外可见吸收光谱一一. .吸收光谱的产生吸收光谱的产生分子内三种运动对应三种能级：分子内三种运动对应三种能级：电子运动电子能级电子运动电子能级(Electron energy level)(Electron energy level)原子之间的相对振动振动能级原子之间的相对振动振动能级(vibration)(vibration)分子转动转动能级分子转动转动能级(rotation)(rotation)分子整体能级分子整体能级 E=Ee+Ev
8、+ErE=Ee+Ev+Er9College of Bioengineering, Jimei University, CHINA当有一频率当有一频率v v , , 如果辐射能量如果辐射能量hvhv恰恰好等于该分子较高能级与较低能级好等于该分子较高能级与较低能级的能量差时，即有：的能量差时，即有： 分子从基态能级跃迁到激发态能级分子从基态能级跃迁到激发态能级10College of Bioengineering, Jimei University, CHINA基基态激激发态11College of Bioengineering, Jimei University, CHINA E E电电=1-2
9、0eV=1-20eVE E转转=0.05-1eV=0.05-1eVE E振振在分子能级跃迁所产生的能量变化，电子跃在分子能级跃迁所产生的能量变化，电子跃迁能量变化最大，它对应电磁辐射能量主要迁能量变化最大，它对应电磁辐射能量主要在区紫外在区紫外可见区。可见区。用紫外用紫外可见光照射分子时，会发生电子能可见光照射分子时，会发生电子能级的跃迁，对应产生的光谱，称为电子光谱，级的跃迁，对应产生的光谱，称为电子光谱，通常称为通常称为紫外紫外可见吸收光谱可见吸收光谱。12College of Bioengineering, Jimei University, CHINA 电子能级跃迁伴随分子振动和转动能
10、级的跃迁，因电子能级跃迁伴随分子振动和转动能级的跃迁，因此得到光谱是带状光谱。此得到光谱是带状光谱。UV-VisUV-Vis是带是带状光谱？状光谱？13College of Bioengineering, Jimei University, CHINA二、二、 物质的颜色与吸收光的关系物质的颜色与吸收光的关系 当一束白光通过棱镜后就色散成红、橙、当一束白光通过棱镜后就色散成红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等颜色的光，它们具有黄、绿、青、蓝、紫等颜色的光，它们具有不同的波长范围。反之，这些不同颜色的光不同的波长范围。反之，这些不同颜色的光按一定的强度比混合后便又形成白光。按一定的强度比混合后便又形成白
11、光。14College of Bioengineering, Jimei University, CHINA将将两种适当颜色的光按一定的强度比例混合两种适当颜色的光按一定的强度比例混合可形成白光，这两种光称为可形成白光，这两种光称为互补色光互补色光。白光红红650650750750紫紫400400450450蓝蓝450450480480绿蓝绿蓝480480500500绿绿500500560560黄绿黄绿560560580580黄黄580580600600橙橙60060065065015College of Bioengineering, Jimei University, CHINAl物质呈现
12、的颜色与吸收光颜色是互物质呈现的颜色与吸收光颜色是互补色关系。补色关系。l若物质对白光中所有颜色的光全部若物质对白光中所有颜色的光全部吸收，它就呈现黑色。吸收，它就呈现黑色。l若反射所有颜色的光则呈现白色若反射所有颜色的光则呈现白色l若透过所以颜色的光，则为无色若透过所以颜色的光，则为无色。16College of Bioengineering, Jimei University, CHINAl物质不同颜色是对光的选择性吸收物质不同颜色是对光的选择性吸收不同物质的分子组成和结构不同， E不同，E也不同。Mh M* 。由于。由于Eh，所以能，所以能级差决定级差决定只能吸收特定波长的光。只能吸收特
13、定波长的光。l人眼可以比作是定性分析可见光区人眼可以比作是定性分析可见光区分光光度计。分光光度计。17College of Bioengineering, Jimei University, CHINAKMnOKMnO4 4溶液吸收溶液吸收525 525 nmnm绿青色光绿青色光( (互补互补光的光的400 400 nmnm附近附近的紫色光的紫色光),),所以所以KMnOKMnO4 4溶液呈溶液呈紫红色。紫红色。例：例：18College of Bioengineering, Jimei University, CHINA溶液颜色的深浅，决定于溶液吸收光的量，溶液颜色的深浅，决定于溶液吸收光的
14、量，即取决于吸光物质浓度的高低。即取决于吸光物质浓度的高低。如如CuSOCuSO4 4溶液的浓度愈高，对黄色光的吸收溶液的浓度愈高，对黄色光的吸收就愈多，表现为透过的蓝色光愈强，溶液的就愈多，表现为透过的蓝色光愈强，溶液的蓝色愈深。蓝色愈深。因此，人眼可以通过比较溶液颜色的深浅来因此，人眼可以通过比较溶液颜色的深浅来确定溶液中吸光物质的浓度大小。确定溶液中吸光物质的浓度大小。19College of Bioengineering, Jimei University, CHINA三、吸收光谱三、吸收光谱吸收光谱（吸收光谱（吸收曲线吸收曲线）：）：不同波长的单色光不同波长的单色光依次照射溶液，并测
15、量在每一波长处对光的依次照射溶液，并测量在每一波长处对光的吸收程度的大小（吸光度），并以波长吸收程度的大小（吸光度），并以波长（ ）为横坐标，）为横坐标，吸光度（吸光度（A A）为纵坐标作图，为纵坐标作图，即可得一条吸光度随波长变化的曲线，。即可得一条吸光度随波长变化的曲线，。它反映物质对各种不同波长光的吸收情况。它反映物质对各种不同波长光的吸收情况。 20College of Bioengineering, Jimei University, CHINA吸收峰吸收峰谷谷肩峰肩峰末端吸收末端吸收21College of Bioengineering, Jimei University, CHI
16、NA同一种物质对不同波长同一种物质对不同波长光的吸光度不同。吸光度最光的吸光度不同。吸光度最大处对应的波长称为大处对应的波长称为最大吸最大吸收波长收波长maxmax不同浓度的同一种物质，不同浓度的同一种物质，其吸收曲线形状相似其吸收曲线形状相似maxmax不变。而对于不同物质，它不变。而对于不同物质，它们的吸收曲线形状和们的吸收曲线形状和maxmax则不同。则不同。吸收曲线的讨论：吸收曲线的讨论：22College of Bioengineering, Jimei University, CHINA吸收曲线可以提供物质的结构信息，并作为吸收曲线可以提供物质的结构信息，并作为物质物质定性分析的依
17、据之一定性分析的依据之一( (分子内部能级分布分子内部能级分布状况状况) )。不同浓度的同一种物质，在不同浓度的同一种物质，在maxmax处吸光度处吸光度A A 的差异性可作为的差异性可作为物质定量分析的依据物质定量分析的依据。在在maxmax处吸光度随浓度变化的幅度最大，所处吸光度随浓度变化的幅度最大，所以以测定最灵敏测定最灵敏。吸收曲线是定量分析中选择入。吸收曲线是定量分析中选择入射光波长的重要依据。射光波长的重要依据。23College of Bioengineering, Jimei University, CHINAa.a.有机分子的轨道类型及跃迁类型有机分子的轨道类型及跃迁类型四四
18、. .有机化合物的吸收光谱有机化合物的吸收光谱24College of Bioengineering, Jimei University, CHINA能量成键成键未成键反键反键n* *n*n *1. 1. * *跃迁跃迁键类型：饱和键。键类型：饱和键。特点：特点：1.1.所需能量高所需能量高 2. 2.吸收波长短吸收波长短200nm200nm 3. 3.不易检测不易检测例子：甲烷例子：甲烷125125nmnm，乙烷乙烷135135nmnm成键作用越强，反键轨道能量越高。成键作用越强，反键轨道能量越高。25College of Bioengineering, Jimei University,
19、CHINA2. 2. * *跃迁跃迁键类型：碳碳双键、三键类型：碳碳双键、三键、共轭双键等键、共轭双键等特点：吸收强度大特点：吸收强度大单个饱和键吸收波长单个饱和键吸收波长200nm200nm,200nm,如如1 1，3-3-丁二烯丁二烯210nm210nm能量成键成键未成键反键反键n* *n*n *26College of Bioengineering, Jimei University, CHINA3.n *跃迁跃迁 特点：特点：1.n1.n * *所需能量小所需能量小 2.2.吸收波长长吸收波长长 3.3.吸收强度很小吸收强度很小(10(10100 )100 )键类型：连有杂原子（键类型
20、：连有杂原子（N N、 S S、 P P、O O）的的 不饱和键不饱和键范围：醛、酮等范围：醛、酮等能量成键成键未成键反键反键n* *n*n *27College of Bioengineering, Jimei University, CHINA4. 4. n n * *跃迁跃迁 键类型：含杂原子（键类型：含杂原子（N N、S S、P P、O O）饱和键饱和键一般杂原子电负性越大，一般杂原子电负性越大，n n电子被束缚得越紧，跃迁电子被束缚得越紧，跃迁所需的能量越大，吸收的波长越短，如所需的能量越大，吸收的波长越短，如CH3ClCH3Cl为为173nm 173nm ，CH3BrCH3Br为为
21、204nm204nm，CH3ICH3I为为258nm258nm。不大，为不大，为100100300300能量成键成键未成键反键反键n* *n*n *特点：特点：n n * *所需能所需能量在量在200nm 200nm 接近。接近。28小结小结： * *饱和键饱和键所需能量所需能量最大最大200nm200nm远紫远紫外区外区紫外紫外可见分光光可见分光光度法溶剂，例己烷、度法溶剂，例己烷、环己烷环己烷 等等 * *C=CC=C或共或共轭双键轭双键所需能量所需能量适中适中单双键单双键200nm200nm200nm共轭双键常为紫外共轭双键常为紫外可见分光光度法可见分光光度法研究对象，跃迁强研究对象，跃
22、迁强度大，度大，1101104 4n n * *C=XC=X(X=O/N/S(X=O/N/S/P)/P)所需能量所需能量最小最小200nm200nm近近紫紫外区外区紫外可见研究对紫外可见研究对象，跃迁强度小，象，跃迁强度小， 100. 10 105 5 超高灵敏；（超高灵敏；（6 61010）10104 4高灵高灵敏；敏；210 0.01 0.01 mol mol L L-1-1, , 分分子子或或离离子子间间平平均均距距离离缩缩小小，其其电电子子云云或或电电荷荷分分布布相相互互影影响响，分分子子轨轨道道能能级级之之差差发发生生变变化，从而改变最大吸收波长光的吸收能力。化，从而改变最大吸收波长
23、光的吸收能力。消除措施：浓度控制在上限以下。消除措施：浓度控制在上限以下。正偏离正偏离负偏离负偏离54College of Bioengineering, Jimei University, CHINAa a非单色光非单色光当当E E1 1=E=E2 2时，时，A=EA=E1 1CL ACL AC C 有线性关系。有线性关系。设设 1 1是需要的光：当是需要的光：当E1E1E2E2时，测得的时，测得的A A值低，负误值低，负误差；反之，产生正误差。且差；反之，产生正误差。且E1 E1 与与E2E2越接近，误差越小越接近，误差越小单色光越纯越好；一般使用灵敏度最大的吸收波长作单色光越纯越好；一般
24、使用灵敏度最大的吸收波长作为测定波长。为测定波长。当当E E1 1EE2 2时时 A AC C 非线性，偏离比尔定律。非线性，偏离比尔定律。2.2.仪器因素（光学因素）仪器因素（光学因素）55College of Bioengineering, Jimei University, CHINAb b杂散光杂散光 仪器中常含有与所需波长相差较大的光，一般仪器中常含有与所需波长相差较大的光，一般样品不吸收，样品不吸收， 所以不干扰测定。所以不干扰测定。c c散射光和反射光散射光和反射光 浑浊溶液产生散射和反射，不能用空白消除影浑浊溶液产生散射和反射，不能用空白消除影响响( (被认为成吸光），被认为成
25、吸光），I I变小，但变小，但I I0 0不变。不变。A A变大，变大，正误差。正误差。d. d. 非平行光非平行光 通过吸收池的非平行光影响光程通过吸收池的非平行光影响光程L L，不同仪器测，不同仪器测定定A A值不同的主要原因。值不同的主要原因。56College of Bioengineering, Jimei University, CHINAa. a. 吸光物质在溶液中发生化学变化引起的偏离吸光物质在溶液中发生化学变化引起的偏离 由于吸光物质变成了不同的存在形式由于吸光物质变成了不同的存在形式 消除措施：控制适当的显色条件。消除措施：控制适当的显色条件。如酸度控制。如酸度控制。 b.
26、 b. 配合物不稳定也会引起的偏离配合物不稳定也会引起的偏离 有些显色配合物不稳定有些显色配合物不稳定, ,发生解离（越稀）发生解离（越稀）。 消除措施：试液浓缩富集。消除措施：试液浓缩富集。 3.3.化学因素化学因素57College of Bioengineering, Jimei University, CHINA 2.4 2.4 紫外紫外可见分光光度计可见分光光度计 紫外可见分光光度计由上五部分组成。紫外可见分光光度计由上五部分组成。对光源的要求对光源的要求足够光强、稳定、连续辐射且强度随波长变化小足够光强、稳定、连续辐射且强度随波长变化小1.1.钨灯和碘钨灯：钨灯和碘钨灯：34034
27、02500nm2500nm，多用在可见光区。，多用在可见光区。2.2.氢灯和氘灯氢灯和氘灯: 160: 160375nm375nm，用于紫外光区。，用于紫外光区。 58College of Bioengineering, Jimei University, CHINA单色器单色器 单色器的用途就是把混合光变成单色光，由入单色器的用途就是把混合光变成单色光，由入射狭缝、准直镜、色散元件、聚焦元件和出口狭缝射狭缝、准直镜、色散元件、聚焦元件和出口狭缝组成。常用的色散元件有棱镜和光栅。组成。常用的色散元件有棱镜和光栅。棱镜棱镜 不同波长的光具有不同的折射率不同波长的光具有不同的折射率 光栅光栅 光的
28、衍射和干涉。其特点是：色散波长范围光的衍射和干涉。其特点是：色散波长范围宽，分辨率高，色散率基本上不随波长改变而改变。宽，分辨率高，色散率基本上不随波长改变而改变。现代仪器多用光栅作色栅元件。现代仪器多用光栅作色栅元件。59College of Bioengineering, Jimei University, CHINA 吸收池吸收池 absorption cell absorption cell 比色皿比色皿cuvettecuvette玻璃吸收池：用于可见光区玻璃吸收池：用于可见光区石英吸收池：用于紫外区石英吸收池：用于紫外区1 1）盛放参比的吸收池和盛放样品的吸收池应匹配，）盛放参比的吸
29、收池和盛放样品的吸收池应匹配，即有相同的厚度与透光性。即有相同的厚度与透光性。2 2）吸收池的光学面应垂直于光束方向。）吸收池的光学面应垂直于光束方向。比色池比色池 0.10.1、1.01.0、1.51.5、2.0cm2.0cm微量池微量池 0.5mL0.5mL流动池流动池 5 511uL11uL60College of Bioengineering, Jimei University, CHINA检测器检测器将光信号转变为电信号进行检测。将光信号转变为电信号进行检测。光电池（硒光电池）、光电管光电池（硒光电池）、光电管 和光电倍增管和光电倍增管信号处理与显示装置信号处理与显示装置放大信号并以
30、适当的方式指示或记录。检流计、数放大信号并以适当的方式指示或记录。检流计、数字显示及微机（控制及数据的采集和处理）。字显示及微机（控制及数据的采集和处理）。61College of Bioengineering, Jimei University, CHINA 1. 1. 单波长分光光度计单波长分光光度计 a.a.单光束单光束0.575光源单色器吸收池检测器显示优点：结构简单，操作方便；缺点：光源不稳定。优点：结构简单，操作方便；缺点：光源不稳定。721721、751751、724724、英国、英国SP500SP500型以及型以及Backman DUBackman DU8 8型型 62Coll
31、ege of Bioengineering, Jimei University, CHINA差值A光源单色器吸收池检测器显示光束分裂器b.b.双光束双光束特点：消除光源强度变化所引起的误差特点：消除光源强度变化所引起的误差国产国产710710型、型、730730型、型、740740型都属于这类型。型都属于这类型。 63College of Bioengineering, Jimei University, CHINA S S为背景吸收为背景吸收切光器切光器吸收池吸收池光源光源检测器检测器单色器单色器单色器单色器2.双波长分光度计双波长分光度计特特点点：可可测测多多组组份份试试样样、混混浊浊试试
32、样样、而而且且可可作作成成导导数数光光谱谱、不需参比液、克服了电源不稳而产生的误差，灵敏度高。不需参比液、克服了电源不稳而产生的误差，灵敏度高。国产国产WFZ800-5型、岛津型、岛津UV-260型、型、UV-265型型64College of Bioengineering, Jimei University, CHINA分光光度计校正分光光度计校正仪器使用过一段时间后仪器使用过一段时间后波长波长和和吸光度吸光度出现漂移，出现漂移，要进行校正。要进行校正。 波长校正波长校正镨玻璃或钬玻璃都有若干特征的吸收镨玻璃或钬玻璃都有若干特征的吸收峰，可用来校正分光光度计的波长标尺，前者峰，可用来校正分光
33、光度计的波长标尺，前者用于可见光区，后者则对紫外和可见光区都适用于可见光区，后者则对紫外和可见光区都适用。用。 吸光度校正吸光度校正可用可用K2CrO4K2CrO4标准溶液来校正吸光标准溶液来校正吸光度标度。将度标度。将0.0400gK2CrO40.0400gK2CrO4溶解于溶解于1L1L的的0.05molL0.05molL1KOH1KOH溶液中，在溶液中，在1cm1cm光程的吸收池光程的吸收池中，在中，在2525时用不同波长测得的吸光度值（有时用不同波长测得的吸光度值（有表可对）表可对） 。 65College of Bioengineering, Jimei University, CH
34、INA2.5 2.5 分析条件选择分析条件选择一一. .仪器测量条件选择仪器测量条件选择1.1.测量波长的选择测量波长的选择a.a. 选择最强吸收带的最大吸收波长选择最强吸收带的最大吸收波长maxmax b. b. 如果如果maxmax处有干扰，应选择灵敏度稍处有干扰，应选择灵敏度稍低但能避免干扰的入射光波长。低但能避免干扰的入射光波长。66College of Bioengineering, Jimei University, CHINA2.2.吸光度范围选择吸光度范围选择最佳吸光度范围最佳吸光度范围0.20.20.7(T0.7(T为为65652020) ) (， 67College of
35、Bioengineering, Jimei University, CHINA二、反应条件选择二、反应条件选择1.1.显色剂选择原则显色剂选择原则显色剂与待测离子生成配合物组成恒定、稳定性好、显色剂与待测离子生成配合物组成恒定、稳定性好、吸收能力强，即吸收能力强，即大、显色剂与配合物的吸收波长大、显色剂与配合物的吸收波长有明显的差别，一般要求有明显的差别，一般要求 60nm60nm。2.2.显色剂用量显色剂用量形成逐级配合物时，显色剂的用量关系较大，一般形成逐级配合物时，显色剂的用量关系较大，一般就需过量较多或必须严格控制用量就需过量较多或必须严格控制用量 。3.3.溶液酸度（配位数和水解等与
36、溶液酸度（配位数和水解等与pHpH相关）。相关）。4.4.显色时间、温度、放置时间显色时间、温度、放置时间68College of Bioengineering, Jimei University, CHINA参比溶液的选择参比溶液的选择whywhy使用参比溶液使用参比溶液只有使用参比溶液，才能真正反映待测溶液的吸光度值。只有使用参比溶液，才能真正反映待测溶液的吸光度值。1.1.溶剂参比溶剂参比当组成简单，共存组分很少，显色剂没有吸收时，当组成简单，共存组分很少，显色剂没有吸收时，可消除溶剂、吸收池等因素的影响。可消除溶剂、吸收池等因素的影响。2. 2. 试剂参比试剂参比如果显色剂或其他试剂在
37、测定波长有吸收，按显色反应如果显色剂或其他试剂在测定波长有吸收，按显色反应同的条件，只是不加入试样溶液。同的条件，只是不加入试样溶液。消除消除显显色剂色剂的吸收影响。的吸收影响。69College of Bioengineering, Jimei University, CHINA3. 3. 试样参比试样参比如果试样基体（除被测组分外的其它共存组分）如果试样基体（除被测组分外的其它共存组分）在测定波长处有吸收，而与显色剂不起显色反应在测定波长处有吸收，而与显色剂不起显色反应时可按与显色反应相同的条件处理试样，只是不时可按与显色反应相同的条件处理试样，只是不加显色剂，作为参比溶液。这种参比溶液适
38、用于加显色剂，作为参比溶液。这种参比溶液适用于试样中有较多的共存组分，加入的显色剂量不大，试样中有较多的共存组分，加入的显色剂量不大，且显色剂在测定波长无吸收的情况。且显色剂在测定波长无吸收的情况。4. 4. 平行操作溶液参比平行操作溶液参比用不含被测组分的试样，在相同条件下与被测用不含被测组分的试样，在相同条件下与被测试样同样进行处理，由此得到平行操作参比溶液试样同样进行处理，由此得到平行操作参比溶液干扰及消除方法。干扰及消除方法。 70College of Bioengineering, Jimei University, CHINA小结：小结：参比溶液选择原则：参比溶液选择原则：凡是有色
39、的溶剂或显色剂或基底液，应尽凡是有色的溶剂或显色剂或基底液，应尽量消除对测定配合物的吸收影响。当作为量消除对测定配合物的吸收影响。当作为参比溶液时，可扣除这种影响。参比溶液时，可扣除这种影响。如果仍有干扰，则可采取下列方式：如果仍有干扰，则可采取下列方式：71College of Bioengineering, Jimei University, CHINA1.1.控制酸度控制酸度例双硫腙能与例双硫腙能与Hg2+Hg2+、Pb2+Pb2+、Cu2+Cu2+、Ni2+Ni2+、Cd2+Cd2+等形成有色配合物，其中与等形成有色配合物，其中与Hg2+Hg2+生成的配合物生成的配合物最稳定，而上述其
40、他离子在此条件下不发生反最稳定，而上述其他离子在此条件下不发生反应。应。2.2.选择适当的掩蔽剂选择适当的掩蔽剂 3.3.选择适当的测量波长选择适当的测量波长 4.4.干扰物分离干扰物分离5.5.导数光谱及双波长技术导数光谱及双波长技术72College of Bioengineering, Jimei University, CHINA2.6 UV-Vis2.6 UV-Vis分光光度法应用分光光度法应用一、定性分析一、定性分析二、纯度分析二、纯度分析三、结构分析三、结构分析四、定量分析四、定量分析73College of Bioengineering, Jimei University, C
41、HINA作用：鉴定物质作用：鉴定物质做法：与已知或标准物的做法：与已知或标准物的UV-VisUV-Vis进行比较进行比较原则：对比吸收光谱的特征（形状和原则：对比吸收光谱的特征（形状和 maxmax ）一、定性分析一、定性分析1 1对比吸收光谱特征数据对比吸收光谱特征数据 maxmax ， minmin ， 等等 2.2.对比吸收光谱的形状一致性对比吸收光谱的形状一致性 74College of Bioengineering, Jimei University, CHINA比较未知物与已知标准物的吸收光谱曲线比较未知物与已知标准物的吸收光谱曲线 75College of Bioengineer
42、ing, Jimei University, CHINA 1 Sadtler Standar Spectra(Ultraviolet),Heyden, London,1978. (46000种化合物)。 2 and M.Orchin,“Ultraviolet and Visible Absorption Spectra of Aromatic Comp -ounds” ,Wiley,New York, 1951.(597种芳香化合物)。 3 Kenzo Hirayama：“Handbook of Ultraviolet and Visible Absorption Spectra of Org
43、anic Compounds.”,New York,Plenum,1967。4 “Organic Electronic Spectral Data”，John Wiley and Sons，1946 （目前还在继续编写）。 与标准谱图比较（以下四种）与标准谱图比较（以下四种） 76College of Bioengineering, Jimei University, CHINA二、纯度分析：二、纯度分析：1.1.当化合物在紫外光谱区的某一波长范围内无吸当化合物在紫外光谱区的某一波长范围内无吸收，而杂志有强的吸收时，则可用于测定该化合收，而杂志有强的吸收时，则可用于测定该化合物中的杂质。物中的
44、杂质。例如例如乙醇中微量苯的鉴定。乙醇中微量苯的鉴定。2.2.如果在某一紫外光谱区，化合物有强吸收而杂如果在某一紫外光谱区，化合物有强吸收而杂志无吸收，也可以用摩尔吸光系数检查它的纯度。志无吸收，也可以用摩尔吸光系数检查它的纯度。例如例如标准菲的氯仿溶液在标准菲的氯仿溶液在296nm296nm处有强吸收，测处有强吸收，测得摩尔吸光系数比精制的菲在相同波长处低得摩尔吸光系数比精制的菲在相同波长处低1010，说明菲样品的实际含量只有说明菲样品的实际含量只有909077College of Bioengineering, Jimei University, CHINA三、结构分析三、结构分析可以鉴定
45、化合物中的共轭结构和芳香环结构可以鉴定化合物中的共轭结构和芳香环结构（无这些结构，则近紫外区内无吸收）。（无这些结构，则近紫外区内无吸收）。经验规则：经验规则：伍德沃德（伍德沃德（WoodwardWoodward）规则）规则适用：适用：计算二烯烃或多烯烃的最大吸收位置计算二烯烃或多烯烃的最大吸收位置 斯科特（斯科特（ScottScott）规则）规则适用：适用：计算不饱和羰基化合物的计算不饱和羰基化合物的 *最大吸收位最大吸收位置置78College of Bioengineering, Jimei University, CHINA母体类型母体类型/nm基数基数214同环的二烯烃同环的二烯烃基
46、数基数253253 （注意：当两种情形同时存在时，选择波长较长的为其母体）（注意：当两种情形同时存在时，选择波长较长的为其母体）增加一个共轭双键增加一个共轭双键30环外双键环外双键5每个烷基取代基每个烷基取代基5O乙酰基乙酰基0OR6SR30Cl，Br5NR260（Woodward）规则）规则79College of Bioengineering, Jimei University, CHINA母体（同环二烯）母体（同环二烯） 253253取代烷基（取代烷基（5 5个）个） 2525环外双键（环外双键（3 3个）个） 1515延伸双键延伸双键 3030 323nm 323nm 例子：例子：(
47、(实测实测320nm320nm）80College of Bioengineering, Jimei University, CHINA，不饱和羰基不饱和羰基化合物母体化合物母体215每增加一个共轭双每增加一个共轭双键键30同环二烯化合物同环二烯化合物39环外双键环外双键5每个烷每个烷基基101218OH353050OAc666Cl1512Br2530NR295母体母体 215215延伸双键延伸双键 3030取代烷基（取代烷基（3 3个）个） 5454 299 299 （实测（实测296296）（ScottScott）规则）规则81College of Bioengineering, Jime
48、i University, CHINA四、定量分析四、定量分析（一）单组分定量（一）单组分定量1.标准曲线法标准曲线法82College of Bioengineering, Jimei University, CHINAAcAxcx标准曲线83College of Bioengineering, Jimei University, CHINA2. 2. 标准比较法标准比较法该该法法是是标标准准曲曲线线法法的的简简化化，即即只只配配制制一一个个浓浓度度为为c cs s的的标标准准溶溶液液，并并测测量量其其吸吸光光度度，求求出出吸吸收收系系数数k k，然后求出然后求出c cx x 该该法法只只有
49、有在在测测定定浓浓度度范范围围内内遵遵守守L-BL-B定定律律，且且c cx x与与c cs s大致相当时，才可得到准确结果大致相当时，才可得到准确结果。84College of Bioengineering, Jimei University, CHINA（二）多组分定量方法（二）多组分定量方法(a)(a)当各组分的吸收光谱不重叠，如单组分测定其浓度。当各组分的吸收光谱不重叠，如单组分测定其浓度。(b)(b)、（、（c)c)中中A A、B B互相干扰，根据吸光度加和性，解方程组。互相干扰，根据吸光度加和性，解方程组。可分别用已知浓可分别用已知浓度度A A、B B纯液求出纯液求出85Colle
50、ge of Bioengineering, Jimei University, CHINA2. 2. 双波长法双波长法等吸收点法等吸收点法双波长输出信号为双波长输出信号为A A输出讯号输出讯号A A与干扰组与干扰组分分A A无关，它只正比于无关，它只正比于待测组分待测组分B B的浓度，即的浓度，即消除了消除了A A的干扰的干扰. . 吸收光谱重叠较为严重吸收光谱重叠较为严重 86College of Bioengineering, Jimei University, CHINA3.3.系数倍率法系数倍率法当干扰组分当干扰组分A A是是陡坡状，不存陡坡状，不存在两个波长处在两个波长处等吸收点。等
51、吸收点。 利用双波长分光光度计中差分函数放大器，利用双波长分光光度计中差分函数放大器，把分别把分别 ( (双波长分光光度计）放大双波长分光光度计）放大k k1 1、k k2 2倍，则两波长处的信号差为倍，则两波长处的信号差为S, S, 、调节放大器，使调节放大器，使2 2和和1 1满足：满足： 干扰组分干扰组分A A无关，即消除了无关，即消除了A A的干扰的干扰 87College of Bioengineering, Jimei University, CHINA4.4.示差分光光度法示差分光光度法常规法常规法示差法示差法参比参比T10100试液试液T5%50%A(0.2-0.7)1.300
52、.30用一已知合适浓度的为参用一已知合适浓度的为参比液，调节仪器的比液，调节仪器的100100透射比点透射比点, ,测量试样溶液测量试样溶液对该已知标准溶液的投射对该已知标准溶液的投射比方法比方法称为示差分光光度称为示差分光光度法法（改善精确度）。（改善精确度）。适应范围：浓度很稀或很适应范围：浓度很稀或很浓溶液。浓溶液。试液浓度试液浓度Cs+Cs+C C88College of Bioengineering, Jimei University, CHINA5.5.导数法导数法1 1）定义：将吸光度信号转化为对波长的导数信）定义：将吸光度信号转化为对波长的导数信号的方法。导数光谱是解决干扰物质
53、与被测物光号的方法。导数光谱是解决干扰物质与被测物光谱重叠，消除胶体等散射影响吸收，提高光谱分谱重叠，消除胶体等散射影响吸收，提高光谱分辨率的一种数据处理技术。辨率的一种数据处理技术。2 2）原理：）原理：控制控制一阶导数信号与浓度成正比。同样可得到二一阶导数信号与浓度成正比。同样可得到二阶、三阶阶、三阶 n n阶导数信号亦与浓度成正比。阶导数信号亦与浓度成正比。89College of Bioengineering, Jimei University, CHINAN N阶微分产生阶微分产生n+1n+1个谱峰，个谱峰，宽度变小，峰形越来越尖宽度变小，峰形越来越尖锐，因而导数光谱法分辨锐，因而导
54、数光谱法分辨率高（左图）。率高（左图）。90College of Bioengineering, Jimei University, CHINA三、配合物组分及其稳定性常数的测定三、配合物组分及其稳定性常数的测定 摩尔比法、等摩尔连续变化法、斜率比法和平衡摩尔比法、等摩尔连续变化法、斜率比法和平衡移动法四种，前两种方法更为常用移动法四种，前两种方法更为常用 1. 1. 摩尔比法摩尔比法( (也称为饱和法也称为饱和法) ) 固定金属离子固定金属离子M M的浓度，改变配位的浓度，改变配位体体R R的浓度，可得到一系列的浓度，可得到一系列C CR/ R/ C CM M值不同的吸光度曲线，曲线拐点处值
55、不同的吸光度曲线，曲线拐点处为为n. n. 设配合物电离度为设配合物电离度为 显色显色91College of Bioengineering, Jimei University, CHINA四、弱酸离解常数的测定四、弱酸离解常数的测定 若测出若测出LL- -HL,HL,即可求出即可求出K Ka a。一份强碱性，一份强碱性，maxLmaxL- - ，A=A=LL- - bCbC ，求出，求出L-L-另一份为强酸性，同理求出另一份为强酸性，同理求出HLHL 。第三份为已知第三份为已知pHpH值的缓冲溶液，分别在碱性和酸性值的缓冲溶液，分别在碱性和酸性体的最大吸收波长处测定总吸光度，解联立方程求体的
56、最大吸收波长处测定总吸光度，解联立方程求得得L-HLL-HL，然后按前式求出，然后按前式求出KaKa。92College of Bioengineering, Jimei University, CHINA思考题与练习题1.分子的紫外可见吸收光谱呈带状光谱，原因是什么？dcabdcab2.93College of Bioengineering, Jimei University, CHINA 思考题与练习题思考题与练习题1.1.紫外吸收光谱有何特征？紫外吸收光谱说明什么？紫外吸收光谱有何特征？紫外吸收光谱说明什么？2.2.2.2.朗伯比尔定律的物理意义是什么？朗伯比尔定律的物理意义是什么？3.
57、3.3.3.在双波长法中，测定波长与参比波长如何选择？在双波长法中，测定波长与参比波长如何选择？4.4.4.4.某化合物在已炔溶剂中吸收波长为某化合物在已炔溶剂中吸收波长为305nm,305nm,而在水而在水中吸收波长为中吸收波长为307nm.307nm.试问：引起该吸收的是试问：引起该吸收的是n-n-* *还是还是-* *跃迁？跃迁？5.5.排列下列化合物的最大吸收波长的顺序：排列下列化合物的最大吸收波长的顺序：乙烯、乙烯、1 1，3 3，5 5己三烯、己三烯、1 1，3 3丁二烯。丁二烯。94College of Bioengineering, Jimei University, CHIN
58、A澳洲的宝石蛋白石澳洲的宝石蛋白石(opal)(opal) 蛋白石是由二氧化硅蛋白石是由二氧化硅纳米纳米球球(nano-sphere)(nano-sphere)沉积形成的沉积形成的矿物，其色彩缤纷的外观与色素无关，矿物，其色彩缤纷的外观与色素无关， 而是因为它而是因为它几几何结构上的周期性何结构上的周期性使它具有光子能带结构，随着能隙位使它具有光子能带结构，随着能隙位置不同，反射光的颜色也跟着变化置不同，反射光的颜色也跟着变化 光子晶体选择反射太阳光中某波长光而呈现光子晶体选择反射太阳光中某波长光而呈现颜色颜色95College of Bioengineering, Jimei University, CHINA这是因为太阳光是由这是因为太阳光是由红、橙、黄、绿、青、橙、黄、绿、青、蓝蓝、紫七种颜色组成的。这七种颜色的光波长是不紫七种颜色组成的。这七种颜色的光波长是不一样的。大气中的尘埃以及其他微粒散射蓝光一样的。大气中的尘埃以及其他微粒散射蓝光的能力大于散射其他波长较长的光子的能力，的能力大于散射其他波长较长的光子的能力，因此天空显现出蓝色。因此天空显现出蓝色。波长愈短的光，散射愈强，波长愈长的光，散波长愈短的光，散射愈强，波长愈长的光，散射愈弱射愈弱 。 散射能力不同使天空呈现蓝色散射能力不同使天空呈现蓝色96
