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1、基因工程基因工程 Genetic EngineeringGenetic Engineering第三章第三章 大肠杆菌基因工大肠杆菌基因工程程Escherichia coli （SEM，14000） 四、工程菌构建、分析、发酵与产物分离纯化四、工程菌构建、分析、发酵与产物分离纯化三、工程菌构建策略三、工程菌构建策略三、工程菌构建策略三、工程菌构建策略二、大肠杆菌表达系统高效表达原理二、大肠杆菌表达系统高效表达原理二、大肠杆菌表达系统高效表达原理二、大肠杆菌表达系统高效表达原理一、一、一、一、 大肠杆菌表达（生产）系统的优缺点大肠杆菌表达（生产）系统的优缺点大肠杆菌表达（生产）系统的优缺点大肠杆菌
2、表达（生产）系统的优缺点五、利用大肠杆菌系统生产重组蛋白案例五、利用大肠杆菌系统生产重组蛋白案例五、利用大肠杆菌系统生产重组蛋白案例五、利用大肠杆菌系统生产重组蛋白案例第三章第三章 大肠杆菌基因工大肠杆菌基因工程程n工程菌构建工程菌构建n发酵工艺研究发酵工艺研究n分离纯化工艺研究分离纯化工艺研究四、工程菌构建、发酵与产物分离纯化四、工程菌构建、发酵与产物分离纯化 工程菌构建研究内容与技术路线工程菌构建研究内容与技术路线目的蛋白分析目的蛋白分析表达载体与宿主表达载体与宿主菌株选择菌株选择目的基因的获得目的基因的获得与优化与优化表达载体构建与分析表达载体构建与分析转化与表达筛选转化与表达筛选工程菌
3、稳定性分析工程菌稳定性分析表达产物确证表达产物确证工程菌菌种保存工程菌菌种保存1 1、目的蛋白分析：、目的蛋白分析： 糖基化？难表达？难复性？药用？糖基化？难表达？难复性？药用？1)1)理化特性理化特性()() *分子大小：分子大小：5KD、100KD难表达难表达（融合表达、截短表（融合表达、截短表达）达）*氨基酸组成：氨基酸组成：Cys、Pro多的难表达多的难表达（用真核系统）（用真核系统）*疏水性：疏水性强的难表达疏水性：疏水性强的难表达（截短表达、用真核系统）（截短表达、用真核系统）2)2)生物学特性：生物学特性：膜蛋白难表达膜蛋白难表达（截短表达、用真核系统）截短表达、用真核系统） 工
4、程菌构建主要研究内容工程菌构建主要研究内容3)3)用途用途药用：安全性、产量、成本药用：安全性、产量、成本（包涵体、独立表达）（包涵体、独立表达）工业用：产量、成本工业用：产量、成本（包涵体、独立表达）（包涵体、独立表达）研究用：迅速获得活性产品为首要考虑研究用：迅速获得活性产品为首要考虑（可溶、融合表达）（可溶、融合表达） 工程菌构建主要研究内容工程菌构建主要研究内容2 2、选择表达载体与宿主菌株：、选择表达载体与宿主菌株： 1 1）表达载体选择）表达载体选择 启动子、标签、标记基因、拷贝数等。启动子、标签、标记基因、拷贝数等。 需要可溶表达时采用弱启动子，需要可溶表达时采用弱启动子，T7T
5、7启动子最强，启动子最强，PL/PRPL/PR热激诱导不宜工业化。热激诱导不宜工业化。 从蛋白特性、用途、发酵和分离纯化工艺考虑标签。从蛋白特性、用途、发酵和分离纯化工艺考虑标签。 药用避免氨苄青霉素，用卡拉霉素。药用避免氨苄青霉素，用卡拉霉素。 4 4）宿主菌：）宿主菌：符合符合表达要求（表达要求（T7 RNAT7 RNA酶溶源？可溶？稀有酶溶源？可溶？稀有密码密码tRNAtRNA？），来源与遗传背景清楚，资料翔实。？），来源与遗传背景清楚，资料翔实。 工程菌构建主要研究内容工程菌构建主要研究内容3 3、目的基因获得、分析与优化、目的基因获得、分析与优化 克隆、合成、索要？克隆、合成、索要？
6、 工程菌构建主要研究内容工程菌构建主要研究内容nn 翻译起始位点与终止密码子：头尾不要缺，中间不能断翻译起始位点与终止密码子：头尾不要缺，中间不能断翻译起始位点与终止密码子：头尾不要缺，中间不能断翻译起始位点与终止密码子：头尾不要缺，中间不能断nnGCGC含量：含量：含量：含量：70%70%时表达水平低时表达水平低时表达水平低时表达水平低nn二级结构二级结构二级结构二级结构 ： mRNA mRNA 二级结构抑制翻译的起始或终止。二级结构抑制翻译的起始或终止。二级结构抑制翻译的起始或终止。二级结构抑制翻译的起始或终止。nn基因或者蛋白的大小：一般说来小于基因或者蛋白的大小：一般说来小于基因或者蛋
7、白的大小：一般说来小于基因或者蛋白的大小：一般说来小于 5kD 5kD 或者大于或者大于或者大于或者大于 100kD 100kD 的蛋白都是难以表达的。前者融合表达，后者截取的蛋白都是难以表达的。前者融合表达，后者截取的蛋白都是难以表达的。前者融合表达，后者截取的蛋白都是难以表达的。前者融合表达，后者截取表达（如抗原用途，选抗原性强、好表达区段）。表达（如抗原用途，选抗原性强、好表达区段）。表达（如抗原用途，选抗原性强、好表达区段）。表达（如抗原用途，选抗原性强、好表达区段）。nn疏水性：疏水性强的、特别是膜蛋白难表达。截取表达。疏水性：疏水性强的、特别是膜蛋白难表达。截取表达。疏水性：疏水性
8、强的、特别是膜蛋白难表达。截取表达。疏水性：疏水性强的、特别是膜蛋白难表达。截取表达。nnN N端和端和端和端和C C端稳定性端稳定性端稳定性端稳定性 ：人为突变末端残基。：人为突变末端残基。：人为突变末端残基。：人为突变末端残基。4 4、表达载体构建与分析、表达载体构建与分析1 1）根据选定载体物理图和基因特点设计与构建）根据选定载体物理图和基因特点设计与构建 PCRPCR扩增目的基因：扩增目的基因：* *引物中引入适当的酶切位点，避免基因内部位点。引物中引入适当的酶切位点，避免基因内部位点。 * *是否需要目的基因带入是否需要目的基因带入ATGATG和和TAATAA？是否要对框？是否要对框
9、？2 2）表达载体酶切分析：双酶切、多酶切图谱分析）表达载体酶切分析：双酶切、多酶切图谱分析3 3）目的基因序列分析：目的基因或表达盒序列分析）目的基因序列分析：目的基因或表达盒序列分析 工程菌构建主要研究内容工程菌构建主要研究内容 pET21a质粒物理图谱质粒物理图谱pET21a质粒多克隆位点与表达盒质粒多克隆位点与表达盒 pET32a质粒物理图谱质粒物理图谱pET32a质粒多克隆位点与表达盒质粒多克隆位点与表达盒M1234目的基因：目的基因：VL-,表达载体：表达载体：pET32aM：Maker，1kblader1：PCR产物，引物含NcoI、HindIII2：HindIII单酶切pET3
10、2a质粒3：NcoI-HindIII双酶切重组子4：HindIII单酶切重组子pET32a-VL-酶切鉴定酶切鉴定 5 5、转化与表达筛选、转化与表达筛选 1 1）转化选定的工程菌宿主株（不同于克隆）转化选定的工程菌宿主株（不同于克隆宿主菌！）宿主菌！） 2 2）表达筛选：表达筛选：以表达水平（以表达水平（% %）为指标。）为指标。 表达水平（表达水平（% %）= =目的产物占总蛋白的百目的产物占总蛋白的百 分数分数 测定方法：测定方法：SDS-PAGE+SDS-PAGE+凝胶扫描分析凝胶扫描分析 工程菌构建主要研究内容工程菌构建主要研究内容6 6、表达产物确证、表达产物确证 1 1）基本要求
11、：）基本要求：SDS-PAGE + Western-BlotSDS-PAGE + Western-Blot 2 2）特殊要求（如基因工程药物）：）特殊要求（如基因工程药物）： A A、结构：、结构：末端顺序（末端顺序（N-N-端端1515个个/C/C端端3 3个）、氨基个）、氨基 酸组成、肽图等酸组成、肽图等 B B、理化特性：、理化特性：分子量（分子量（SDS-PAGESDS-PAGE、质谱）、等电点、质谱）、等电点、 紫外特征吸收峰等紫外特征吸收峰等 C C、生物学活性、生物学活性 工程菌构建主要内容工程菌构建主要内容基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制改善
12、工程菌不稳定性的策略改善工程菌不稳定性的策略 大肠杆菌工程菌的不稳定性大肠杆菌工程菌的不稳定性大肠杆菌工程菌的不稳定性大肠杆菌工程菌的不稳定性工程菌遗传稳定性分析工程菌遗传稳定性分析 7 7、工程菌遗传稳定性分析、工程菌遗传稳定性分析、工程菌遗传稳定性分析、工程菌遗传稳定性分析工程菌遗传不稳定性的表现形式工程菌遗传不稳定性的表现形式工程菌遗传不稳定性的表现形式工程菌遗传不稳定性的表现形式结构不稳定性结构不稳定性结构不稳定性结构不稳定性重组重组DNADNA分子上某一区域发生缺失、重排、修分子上某一区域发生缺失、重排、修饰，导致其表观生物学功能的丧失（不表达、饰，导致其表观生物学功能的丧失（不表达
13、、产物结构改变）产物结构改变）分配不稳定性（主要）分配不稳定性（主要）分配不稳定性（主要）分配不稳定性（主要）整个重组整个重组DNADNA分子从受体细胞中逃逸（分子从受体细胞中逃逸（curingcuring）。导致表达水平下降。导致表达水平下降。重组质粒的逃逸：重组质粒的逃逸： 工程菌部分细胞因质粒丢失而不再携带重组质粒的现象。工程菌部分细胞因质粒丢失而不再携带重组质粒的现象。重组质粒的宏观逃逸率：重组质粒的宏观逃逸率： 工程菌培养液中丢失质粒的细胞占细胞总数的百分比。工程菌培养液中丢失质粒的细胞占细胞总数的百分比。宏观逃逸率（宏观逃逸率（%）= =非选择性非选择性平板菌落数平板菌落数-选择性
14、选择性平板菌落数平板菌落数非选择性非选择性平板菌落数平板菌落数100关闭质粒关闭质粒DNADNA合成途径，启动降解程序合成途径，启动降解程序重组质粒逃逸的原因重组质粒逃逸的原因环境因素诱导的重组质粒渗漏环境因素诱导的重组质粒渗漏高温、表面活性剂（高温、表面活性剂（SDSSDS）、）、药物（利福平）、染料（吖啶）药物（利福平）、染料（吖啶）目的基因高效表达诱导宿主细胞产生应激反应目的基因高效表达诱导宿主细胞产生应激反应目的基因表达盒目的基因表达盒“ “转录过头转录过头” ”，影响，影响OriOri区域。区域。目的基因本底表达产物引起的毒性反应目的基因本底表达产物引起的毒性反应抗性标记基因过表达，
15、抗生素消耗过快。抗性标记基因过表达，抗生素消耗过快。重组质粒结构不稳定性的产生原因重组质粒结构不稳定性的产生原因重组质粒结构不稳定性的产生原因重组质粒结构不稳定性的产生原因宿主细胞中的修饰性酶系对外源重组宿主细胞中的修饰性酶系对外源重组DNADNA分子的破坏分子的破坏环境因素诱导的突变环境因素诱导的突变宿主细胞中内源性的转座元件促进重组分子的缺失重排宿主细胞中内源性的转座元件促进重组分子的缺失重排改善基因工程菌不稳定性的策略改善基因工程菌不稳定性的策略1 1 1 1、改进载体、改进载体、改进载体、改进载体- - - -宿主系统宿主系统宿主系统宿主系统选择性地杀死无质粒细胞选择性地杀死无质粒细胞
16、如如敲除宿主基因组致死性基因敲除宿主基因组致死性基因（如（如ssbssb基因，缺失无法基因，缺失无法DNADNA复制），并将其改由表达载体提供复制），并将其改由表达载体提供正确设置载体上的多克隆位点，正确设置载体上的多克隆位点，避免避免DNADNA片段插在片段插在稳定区内稳定区内选择特定质粒最适宿主菌株选择特定质粒最适宿主菌株使用可控型复制子（扩增与表达诱导同步使用可控型复制子（扩增与表达诱导同步)改善基因工程菌不稳定性的策略改善基因工程菌不稳定性的策略2 2 2 2、施加选择压力、施加选择压力、施加选择压力、施加选择压力根据载体上的抗药性标记，向培养系统中添加相应根据载体上的抗药性标记，向培
17、养系统中添加相应的抗生素的抗生素药物和食品生产时不宜使用抗生素药物和食品生产时不宜使用抗生素采用营养缺陷型宿主菌，载体含营养标记，培养基采用营养缺陷型宿主菌，载体含营养标记，培养基不含该营不含该营养组份养组份改善基因工程菌不稳定性的策略改善基因工程菌不稳定性的策略3 3、采用严紧调控型载体系统，减少本底表达造成的不稳定、采用严紧调控型载体系统，减少本底表达造成的不稳定、采用严紧调控型载体系统，减少本底表达造成的不稳定、采用严紧调控型载体系统，减少本底表达造成的不稳定4 4、优化工程菌的培养工艺、优化工程菌的培养工艺、优化工程菌的培养工艺、优化工程菌的培养工艺培养基组成：培养基组成：限制培养基比
18、丰富培养基更有利于稳定限制培养基比丰富培养基更有利于稳定培养温度：培养温度： 较低的培养温度有利于重组质粒的稳定较低的培养温度有利于重组质粒的稳定 在非选择条件下连续传代数代后，对工程菌重组质粒在非选择条件下连续传代数代后，对工程菌重组质粒存在状况、结构完整性和功能完整性进行分析：存在状况、结构完整性和功能完整性进行分析： A A、存在状况：、存在状况：宏观逃逸率宏观逃逸率 B B、结构完整性：、结构完整性：酶切图谱分析、序列分析酶切图谱分析、序列分析 C C、功能完整性：、功能完整性： 表达产物免疫特异性（表达产物免疫特异性（western blotting)western blotting
19、) 表达水平（表达水平（% %） 工程菌遗传稳定性分析工程菌遗传稳定性分析1 1、原始菌种保存：、原始菌种保存： 实验室构建而来。冻干、实验室构建而来。冻干、-70-70保存保存。表达载体（质粒）表达载体（质粒）和宿主菌分别冻存更稳定。和宿主菌分别冻存更稳定。2 2、主细胞库（、主细胞库（master cell bank,MCBmaster cell bank,MCB）：）： 由原始菌种单一克隆一次培养与分装而来，供工作细胞由原始菌种单一克隆一次培养与分装而来，供工作细胞库制备。库制备。 冻干、冻干、-70-70保存保存。3、工作细胞库（、工作细胞库（working cell bank, WC
20、B）: 由主细胞库单个最小包装甘油种培养与分装而来，供生由主细胞库单个最小包装甘油种培养与分装而来，供生产用。产用。甘油种，甘油种，-70-70保存。保存。 8、工程菌菌种保存（三级种子库）工程菌菌种保存（三级种子库） 工程菌生长与表达主要影响因素工程菌生长与表达主要影响因素 工程菌摇瓶水平生长与表达试验工程菌摇瓶水平生长与表达试验 工程菌工业发酵工艺研究工程菌工业发酵工艺研究工程菌发酵工艺研究工程菌发酵工艺研究工程菌发酵工艺研究工程菌发酵工艺研究1 1、培养基、培养基2 2、菌龄与接种量、菌龄与接种量3 3、pHpH值、温度与溶解氧值、温度与溶解氧4 4、诱导时机与收菌时机、诱导时机与收菌时
21、机工程菌生长与表达主要影响因素工程菌生长与表达主要影响因素工程菌生长与表达主要影响因素工程菌生长与表达主要影响因素工程菌生长曲线与表达曲线分析工程菌生长曲线与表达曲线分析生长曲线生长曲线 纵坐标：生物量（细胞密度纵坐标：生物量（细胞密度OD600OD600、干重、干重/ /体积、湿重体积、湿重/ /体积）体积） 横坐标：培养时间（小时）横坐标：培养时间（小时） 时期：停滞期、加速期、对数期、减速期、平台期、衰减期时期：停滞期、加速期、对数期、减速期、平台期、衰减期表达曲线表达曲线 纵坐标：表达水平（纵坐标：表达水平（% %）、活性单位）、活性单位/ /体积体积 横坐标：培养时间（小时）横坐标：
22、培养时间（小时） 1 1、培养基、培养基 影响菌体生长、质粒稳定性、表达水平、产物可溶性等影响菌体生长、质粒稳定性、表达水平、产物可溶性等 碳源碳源：葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等：葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等 应避免外源基因表达的应避免外源基因表达的“葡萄糖效应葡萄糖效应”。 氮源氮源： 有机氮：酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米浆有机氮：酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米浆 无机氮：无机氮： 氨水、硫酸铵、硝酸铵、氯化铵等氨水、硫酸铵、硝酸铵、氯化铵等 其他：其他：无机盐、微量元素维生素、生物素等无机盐、微量元素维生素、生物素等工程菌生长与表达主要影响因素工程菌生长与表达
23、主要影响因素工程菌生长与表达主要影响因素工程菌生长与表达主要影响因素2 2、菌龄与接种量、菌龄与接种量菌龄：菌龄：自接种起培养的时间（小时）自接种起培养的时间（小时） 影响停滞期、质粒宏观逃逸率影响停滞期、质粒宏观逃逸率接种量：接种量：是指接入的种子液体积占培养液体积的百分比是指接入的种子液体积占培养液体积的百分比 接种量过小：接种量过小：延长菌体停滞期，质粒宏观逃逸率高延长菌体停滞期，质粒宏观逃逸率高 接种量过大：接种量过大：菌体生长过快，代谢产物积累过多，抑制后菌体生长过快，代谢产物积累过多，抑制后 期菌体的生长，降低表达水平。期菌体的生长，降低表达水平。3 3、pHpH值、温度与溶解氧值
24、、温度与溶解氧 pHpH值：值：影响生长速度、表达水平和产物可溶性。影响生长速度、表达水平和产物可溶性。 生长最适生长最适pH范围在范围在6.8-7.4，表达最适，表达最适pH为为6.0-6.5 温度：温度：影响生长速度、表达水平和产物可溶性。影响生长速度、表达水平和产物可溶性。 生长最适生长最适37，较低温度利于可溶性表达。，较低温度利于可溶性表达。 溶解氧溶解氧：影响生长速度和表达水平影响生长速度和表达水平4 4、诱导时机与收菌时机、诱导时机与收菌时机 诱导时机：诱导时机：过早影响生物量、过晚影响表达水平 一般在生长曲线对数中期或对数后期进行诱导一般在生长曲线对数中期或对数后期进行诱导 收
25、菌时机：收菌时机：过早影响表达水平、过晚影响产物稳定过早影响表达水平、过晚影响产物稳定 性、可溶性、并造成浪费。性、可溶性、并造成浪费。 一般在表达曲线平台期（诱导后一般在表达曲线平台期（诱导后3-43-4小时）收菌小时）收菌n主要研究参数：主要研究参数： 培养基、接种量、培养基、接种量、pHpH值、温度、诱导与收菌时机等值、温度、诱导与收菌时机等n主要观察指标主要观察指标 表达水平（表达水平（% %）、生物量、表达产物积累（包涵体形）、生物量、表达产物积累（包涵体形成）情况、质粒宏观逃逸率等成）情况、质粒宏观逃逸率等n结果：结果：生长曲线与表达曲线生长曲线与表达曲线 工程菌摇瓶水平生长与表达
26、试验工程菌摇瓶水平生长与表达试验n基本要求：基本要求： 高表达、高生物量、便于放大、低成本高表达、高生物量、便于放大、低成本n重点问题：重点问题：1 1）质粒稳定性问题）质粒稳定性问题2 2）表达与生长的矛盾问题）表达与生长的矛盾问题3 3）发酵方式问题：）发酵方式问题： 分批式分批式oror流加式发酵？常规发酵流加式发酵？常规发酵oror高密度发酵？高密度发酵？工程菌发酵工艺基本要求与重点问题：工程菌发酵工艺基本要求与重点问题：工程菌工业发酵工艺研究工程菌工业发酵工艺研究工程菌工业发酵工艺研究工程菌工业发酵工艺研究工程菌工业发酵工艺流程工程菌工业发酵工艺流程甘油种甘油种活化活化试管试管/ /
27、摇瓶摇瓶放大放大/ /种子罐种子罐发酵发酵/ /发酵罐发酵罐工程菌发酵工艺流程工程菌发酵工艺流程1、菌种活化： 参数：培养基、温度、培养时间（菌龄） 指标：菌体浓度（OD600）、质粒宏观逃逸率2、放大培养（种子液制备）： 参数：菌龄、接种量、培养基、温度、溶氧、搅 拌速度、转接时机（菌龄）、放大级数 指标：菌体浓度（OD600）、质粒宏观逃逸率 结果：生长曲线工程菌发酵工艺研究主要内容工程菌发酵工艺研究主要内容3、发酵（放大培养与表达）： 参数：种子液菌龄、接种量、培养基、温度、溶氧、搅 拌速度、诱导时机、收菌时机 指标：菌体浓度、表达水平、质粒宏观逃逸率 结果：生长曲线、表达曲线工程菌发酵
28、工艺研究主要内容工程菌发酵工艺研究主要内容4、发酵方式： 1）批式发酵：较常用，高表达、但菌体量较少。 2）流加发酵：较常用，主要补充碳源，菌体量大、表达 水平下降，碳源流加时机和速度是关键。 *高密度发酵：无机盐介质，通过碳源限制和流加实现 高密度发酵。 3）连续发酵：少用，高表达、高总生物量、难控制。 工程菌发酵工艺研究主要内容工程菌发酵工艺研究主要内容基因工程发酵基因工程发酵表达产物分离纯化工艺研究表达产物分离纯化工艺研究n分离纯化工艺研究的目的、任务和要求n分离纯化工艺设计原则n粗提工艺n精纯工艺 *精纯主要任务 *分离纯化总策略 *色谱技术为基础的精纯工艺 分离纯化工艺研究的目的、任
29、务和要求分离纯化工艺研究的目的、任务和要求n目的：目的：建立高效、便于规模放大和质控的表达产物分离 纯化工艺n任务：任务：1、建立粗提工艺：从菌体或培养液中获取目的产物，包涵体形式表达的尚包括变性和复性处理。2、建立精纯工艺：去除蛋白质和非蛋白质类杂质，使纯度达到指定要求。3、建立工艺过程质控体系n要求：要求： 高活性、高得率、高纯度、低费用表达产物分离纯化原则表达产物分离纯化原则n要建立一个方便灵敏的蛋白检测方法，以估价每一步的要建立一个方便灵敏的蛋白检测方法，以估价每一步的提纯程度；提纯程度；n分离步骤要尽可能少，每一步便于工业放大；分离步骤要尽可能少，每一步便于工业放大；n尽量采用柱层析
30、技术，各步骤间样品应无需复杂处理；尽量采用柱层析技术，各步骤间样品应无需复杂处理；n初步分离要快速、大规模，精纯要高分辨率；初步分离要快速、大规模，精纯要高分辨率；n尽可能避免带入有害物质尽可能避免带入有害物质; ;n每步需统计：每步需统计：得率、纯度、纯化倍数得率、纯度、纯化倍数粗粗 提提离心离心离心离心发酵液发酵液发酵液发酵液菌体菌体包涵体包涵体裂解液裂解液复性液复性液菌体菌体粗提液粗提液粗提液粗提液上清上清破菌、离心破菌、离心洗涤、裂解洗涤、裂解复性复性胞内表达胞内表达胞内表达胞内表达分泌表达分泌表达分泌表达分泌表达工艺流程工艺流程工艺流程工艺流程精纯工艺主要任务精纯工艺主要任务 1 1
31、、去除非蛋白质类大分子杂质：、去除非蛋白质类大分子杂质： 内毒素、DNA、RNA、脂类、多糖等 2、去除蛋白质类杂质：、去除蛋白质类杂质： 宿主蛋白、融合表达的Tag、质粒上其它元件表达产物、培养基带来的蛋白等 。 3、去除纯化方法带来的杂质、去除纯化方法带来的杂质分离纯化策略分离纯化策略分离纯化三步策略分离纯化三步策略分离纯化工艺设计考虑要素分离纯化工艺设计考虑要素离子交换（离子交换（Ion exchange chromatography，IEC) 速度快，分辩率较高，适合前速度快，分辩率较高，适合前1-2步；步；疏水层析（疏水层析（Hydrophobic interaction chrom
32、atography, HIC) 速度快，分辩率较高，适合前速度快，分辩率较高，适合前1-2步；步；凝胶过滤凝胶过滤(Gel filter, GF) 分辩率高，上样体积和洗脱速度受限制分辩率高，上样体积和洗脱速度受限制, 适合最后适合最后亲和层析亲和层析(Affinity chromatography,AC) 速度快，分辩率较高，但成本高，配基污染，适合速度快，分辩率较高，但成本高，配基污染，适合1-3步步反相色谱（反相色谱（Reversed phase chromatography，RPC) 分辩率高，但不适合蛋白质分辩率高，但不适合蛋白质 主要色谱技术特点主要色谱技术特点色谱技术为基础的精纯
33、工艺色谱技术为基础的精纯工艺层析系统工作流程层析系统工作流程中压层析系统中压层析系统AKTA explorer 100AKTA explorer 100AKTA-readyAKTA-ready系统（生产型）系统（生产型）四、工程菌构建、分析、发酵与产物分离纯化四、工程菌构建、分析、发酵与产物分离纯化三、工程菌构建策略三、工程菌构建策略三、工程菌构建策略三、工程菌构建策略二、大肠杆菌表达系统高效表达原理二、大肠杆菌表达系统高效表达原理二、大肠杆菌表达系统高效表达原理二、大肠杆菌表达系统高效表达原理一、一、一、一、 大肠杆菌表达（生产）系统的优缺点大肠杆菌表达（生产）系统的优缺点大肠杆菌表达（生产
34、）系统的优缺点大肠杆菌表达（生产）系统的优缺点五、利用大肠杆菌系统生产重组蛋白案例五、利用大肠杆菌系统生产重组蛋白案例五、利用大肠杆菌系统生产重组蛋白案例五、利用大肠杆菌系统生产重组蛋白案例第三章第三章 大肠杆菌基因工大肠杆菌基因工程程重组人胰岛素重组人胰岛素* *胰岛素是糖尿病特效药，全球约胰岛素是糖尿病特效药，全球约1 1亿患者亿患者* *传统的为猪源性产品传统的为猪源性产品*1982*1982年，美国年，美国Ely LiLiEly LiLi公司首先使用重组大肠杆菌生产人公司首先使用重组大肠杆菌生产人胰岛素胰岛素*1987*1987年，年，NovoNovo公司推出重组酵母菌生产的人胰岛素公
35、司推出重组酵母菌生产的人胰岛素* *目前主要在突变型方面进行研发，已有长效型与速效型目前主要在突变型方面进行研发，已有长效型与速效型入市入市胰岛素的结构及其生物合成胰岛素的结构及其生物合成SSSSSSSSCCNNSSSSB B 肽（肽（3030）C C 肽（肽（3131）A A 肽（肽（2121）RRRRRRKKSSSSSSSSCCNNSSSSNNCC高尔基体内的特异性肽酶高尔基体内的特异性肽酶NNCC信号肽信号肽B B 肽肽C C 肽肽A A 肽肽信号肽酶信号肽酶利用重组大肠杆菌生产人胰岛素A A、B B链分别表达法链分别表达法胰岛素原（胰岛素原（BCABCA）表达法）表达法A A、B B链
36、共表达法链共表达法A A链和链和链和链和B B链分别表达法链分别表达法链分别表达法链分别表达法基因工程菌的构建策略：基因工程菌的构建策略：tactactactacbb-GalGalbb-GalGalA peptideA peptideB peptideB peptideorioriorioriApAprrApAprrMetMetMetMetMetMetMetMetMMMMNNCCMMMMNNCC化学合成化学合成A A链链和和B B链的编码链的编码序列序列A A链和链和链和链和B B链分别表达法链分别表达法链分别表达法链分别表达法表达产物的后处理路线：表达产物的后处理路线：MMMMNNCCMMM
37、MNNCCbb-GalGalbb-GalGalAABBCNBr CNBr 处理处理NNCCSSSSSSSSCCNNSSSSNNCCNNCCNNCCNNCCCys Cys 体外氧化和重折叠体外氧化和重折叠分离纯化分离纯化人胰岛素原（人胰岛素原（人胰岛素原（人胰岛素原（BCABCA）表达法）表达法）表达法）表达法基因工程菌的构建策略：基因工程菌的构建策略：tactacbb-GalGalC peptideC peptideorioriApAprrMetMetMetMetMMMMNNCCB peptideB peptideA peptideA peptide人胰岛素原的人胰岛素原的cDNAcDNA重组
38、人胰岛素原重组人胰岛素原转化转化分离纯化分离纯化表达产物的后处理路线：表达产物的后处理路线：SSSSSSSSCCNN胰蛋白酶胰蛋白酶C peptideC peptideA peptideA peptideB peptideB peptideMMRRRRKKRRCNBrCNBrRRSSSSSSSSCCNNNNCCSSSSSSSSRR羧肽酶羧肽酶BBBB链中第链中第2222位上的位上的ArgArg和第和第2929位上的位上的LysLys由于良好折叠的原由于良好折叠的原因，对胰蛋白酶不敏感因，对胰蛋白酶不敏感人胰岛素原（人胰岛素原（人胰岛素原（人胰岛素原（BCABCA）表达法）表达法）表达法）表达法
39、A A链和链和链和链和B B链同时表达法链同时表达法链同时表达法链同时表达法tactacbb-GalGalorioriApAprrMetMetMetMetMMMMNNCCB peptideB peptideA peptideA peptide化学合成化学合成ABAB链编码序列链编码序列重组人胰岛素重组人胰岛素转化转化分离纯化分离纯化CNBr CNBr 处理处理特异性裂解特异性裂解体外折叠体外折叠1、试述大肠杆菌表达系统工程菌构建技术路线及工程菌鉴定内容。、试述大肠杆菌表达系统工程菌构建技术路线及工程菌鉴定内容。2、工程菌质粒不稳定性的表现形式和机制是什么？有哪些改进策略？、工程菌质粒不稳定性的
40、表现形式和机制是什么？有哪些改进策略？3、如何进行工程菌遗传稳定性分析？分析项目包括哪些？什么是质粒的、如何进行工程菌遗传稳定性分析？分析项目包括哪些？什么是质粒的宏观逃逸率？如何测定？宏观逃逸率？如何测定？ 4、工程菌常规保存条件为何？菌种库包括哪几种形式？相互关系如何？、工程菌常规保存条件为何？菌种库包括哪几种形式？相互关系如何？5、影响工程菌发酵的主要因素有哪些？、影响工程菌发酵的主要因素有哪些？什么是工程菌的生长曲线和表达曲线？最佳诱导时机在工程菌生长曲线中的什么时期？6、工程菌工业发酵工艺流程如何？发酵工艺研究需要解决的主要问题是什么？如何实现大肠杆菌高密度发酵？7、表达产物分离纯化
41、研究的主要内容和原则是什么？8、大肠杆菌系统表达产物粗提工艺包括哪些内容？9、表达产物精纯的主要任务是什么？为什么主要采用色谱柱分离（层析）技术？在分离纯化三步策略中各有哪些层析技术可选择？思考题（工程菌构建、发酵、分离纯化）思考题（工程菌构建、发酵、分离纯化）题目：题目： 重组人白介素重组人白介素-2-2（rhIL-rhIL- 2 2 ）大肠杆菌工程菌的构建）大肠杆菌工程菌的构建 请你根据所学习知识，从基因克隆开始，为请你根据所学习知识，从基因克隆开始，为rhIL-rhIL- 2 2构建构建大肠杆菌工程菌株，进行工程菌稳定性和表达分析，并根据你大肠杆菌工程菌株，进行工程菌稳定性和表达分析，并
42、根据你的工程菌构建策略提出相应的发酵与分离纯化策略。的工程菌构建策略提出相应的发酵与分离纯化策略。作业：在作业：在5月月25日前交，日前交， 严禁互相抄袭！严禁互相抄袭！题目：题目： rhIL- rhIL- 2 2大肠杆菌工程菌的构建大肠杆菌工程菌的构建摘要：摘要：本文研究目的、内容与结果本文研究目的、内容与结果（200200字以内）字以内）前言：前言：简要介绍简要介绍rhIL-rhIL- 2 2的理化特性、基因结构、生物学活性的理化特性、基因结构、生物学活性 、临床潜在用途、本文研究目的、临床潜在用途、本文研究目的（500500字以字以内）内）。材料与方法：材料与方法：1 1）菌株、质粒、培
43、养基名称与来源）菌株、质粒、培养基名称与来源（可虚拟）（可虚拟）2 2）工具酶、关键试剂名称与来源）工具酶、关键试剂名称与来源（可虚拟）（可虚拟）3 3）仪器：关键仪器名称与来源）仪器：关键仪器名称与来源（可虚拟）（可虚拟）4 4）方法：基因克隆和表达载体构建的全过程、质粒与工程菌）方法：基因克隆和表达载体构建的全过程、质粒与工程菌鉴定、遗传稳定性分析、工程菌培养与表达诱导分析等鉴定、遗传稳定性分析、工程菌培养与表达诱导分析等的具体的具体方法名称与基本操作过程。方法名称与基本操作过程。4 4、结果与讨论、结果与讨论1 1） rhIL- rhIL- 2 2基因克隆基因克隆 须包含基因编码序列、须
44、包含基因编码序列、PCRPCR或或RT-PCRRT-PCR的引物序列、供克隆操作的酶的引物序列、供克隆操作的酶切位点等信息。切位点等信息。PCRPCR产物电泳结果请绘图。产物电泳结果请绘图。2 2）表达载体与工程菌构建）表达载体与工程菌构建 工具质粒和宿主菌允许虚构，但须注明关键元件、目的基因克隆位工具质粒和宿主菌允许虚构，但须注明关键元件、目的基因克隆位点、构建所获表达载体的物理图谱（示意图）、表达调控方式、酶切鉴点、构建所获表达载体的物理图谱（示意图）、表达调控方式、酶切鉴定方法。请尽量采用流程图形式说明构建过程。定方法。请尽量采用流程图形式说明构建过程。3 3）工程菌生长与表达分析）工程菌生长与表达分析 须包含工程菌生长曲线、表达产物初步鉴定（须包含工程菌生长曲线、表达产物初步鉴定（SDS-PAGESDS-PAGE、WesternblotWesternblot）、表达曲线等。）、表达曲线等。4 4）工程菌传代稳定性分析）工程菌传代稳定性分析 须包含结构稳定性和分配稳定性分析结果须包含结构稳定性和分配稳定性分析结果5 5）发酵和分离纯化策略发酵和分离纯化策略 必须根据你的工程菌构建策略描绘可能的发酵与分离纯化工艺设计必须根据你的工程菌构建策略描绘可能的发酵与分离纯化工艺设计策略，并给出相应的工艺流程图。策略，并给出相应的工艺流程图。
