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1、双向电泳蛋白样品的制备双向电泳蛋白样品的制备一、蛋白质提取原则:、蛋白质提取原则:二、样本裂解方式:二、样本裂解方式:三、三、2D2D蛋白裂解液组成及作用:蛋白裂解液组成及作用: 1:裂解液组成及作用 2:常见裂解液四、蛋白质提取步骤:四、蛋白质提取步骤:五、蛋白质样本制备实例:五、蛋白质样本制备实例: 1:动物组织样本制备 2:植物组织样本制备六、样本制备试剂:六、样本制备试剂:双向电泳样品制备:双向电泳样品制备: 辉骏生物:辉骏生物:http:/ 免费服务热线:免费服务热线:400-699-16633 3、还原剂:、还原剂: (1) 作用:断裂蛋白质中的二硫键,以利于肽链的分离。 (2)
2、分类: -巯基乙醇,二硫苏糖醇(DTT),二硫赤藓糖(DTE) a: 其中DTT带有电荷,在等点聚焦时,常常会迁移到PH范围 以外,从而使某些蛋白质的二硫键重新配对,使溶解度降低而重新沉淀下来。使用浓度范围10100 mmol/L. b: 采用非离子还原剂三丁基膦TBP可以大大增加蛋白质的溶解性,并利于蛋白从第一向转移到第二向。但是TBP在水溶液中的不稳定性和不溶性,使其在第一向IEF中维持蛋白质还原状态是相对无效的。因此在IEF时建议最好使用巯基还原剂。三、双向电泳样本制备裂解液组成及作用三、双向电泳样本制备裂解液组成及作用 辉骏生物:辉骏生物:http:/ 免费服务热线:免费服务热线:40
3、0-699-1663种类种类作用作用PMSF不可逆地抑制丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶EDTA,EGTA 可逆的蛋白酶抑制剂(如亮抑蛋白酶肽,胃蛋白酶抑制剂)多肽蛋白酶抑制剂 逆的蛋白酶抑制剂(如亮抑蛋白酶肽,胃蛋白酶抑制剂)磷酸酶抑制剂抑制磷酸酶活性Benzamidine抑制丝氨酸蛋白酶。4 4、蛋白酶抑制剂的种类及作用:、蛋白酶抑制剂的种类及作用:三、双向电泳样本制备裂解液组成及作用三、双向电泳样本制备裂解液组成及作用 辉骏生物:辉骏生物:http:/ 免费服务热线:免费服务热线:400-699-1663 1、 提取前准备: (1): 提取总蛋白,亚细胞蛋白; (2): 裂解细胞的方式选择; (3
4、): 裂解液的选择。 2、 加入裂解液,冰上放置一段时间。 3、 离心去沉淀,收集上清蛋白。 4、 用于二维电泳时,考虑是否有必要除去干扰物质,如核酸, 脂类,盐等。三、双向电泳样本制备简要实验步骤三、双向电泳样本制备简要实验步骤 辉骏生物:辉骏生物:http:/ 免费服务热线:免费服务热线:400-699-1663五、双向电泳样本制备实例五、双向电泳样本制备实例动物样本动物样本 (1 1)将组织切细后置于研钵中,迅速加入液氮进行研磨,直至组织变成粉末,均匀而没有明显颗粒即可。 (2 2)在研钵中加入800LB(使用前加入1 PMSF),充分溶解(收集)粉末后转移至1.5mLEP管中,4,12
5、000r/min,离心20min,收集上清液。 (3 3)超声处理,破碎核酸。每个EP管超声3次,每次58下,然后进行离心,4,12000r/min,离心20min,收集上清液。 (4 4)将上清液分装成3管,每管约250L,每管再加入1mL丙酮-20沉淀过夜。沉淀完的蛋白质于4,12000r/min,离心20min,倒去上清液后,平放于干净的纸巾上自然干燥,即可得到处理后的蛋白质团块,-80保存备用。 (5) (5)在干燥后的蛋白质团块中加入相应量的RB(具体加入量视蛋白团块大小而定),用枪头将蛋白质团块戳小后反复吹打直至蛋白质完全溶解。对于太过干燥的蛋白质团块(呈透明状),可用50L移液器
6、调至10L刻度处,吸上一点RB封住枪头,然后反复的将蛋白质团块戳小,再用超声仪处理,直至看不到明显的蛋白质团块为止。4,12000r/min,离心20min,吸出上清液,转移至新的EP管中。 五、双向电泳样本制备实例五、双向电泳样本制备实例植物样本植物样本 (1 1)植物样本置于研钵中,迅速加入液氮进行研磨,直至组织变成粉末,均匀而没有明显颗粒即可,在研钵中加入一小勺PVPP(用于吸附植物组织破碎后释放出的酚类物质),用药勺将粉末转移至50mL离心管中。 (2 2)在50mL离心管中加入8mL提取液混匀,再加入8mLTris饱和酚,充分振荡后放置于冰上,每隔5min振荡一次,总共6次,4500
7、0r/min,离30min,此时溶液会分层,下层为水相,上层为酚相,吸出上层液体,转移到15mL离心管中。 (3 3)加入与酚相同体积的提取液,充分振荡后放置于冰上,每隔5min振荡一次,总共6次,4,5000r/min,离心30min,吸出上层酚相,转移至新的15mL离心管中。重复一次苯酚抽提。 (4 4)加入最后得到的酚的5倍体积的醋酸铵甲醇溶液对蛋白进行沉淀,充分振荡后置于冰上保温每隔5min振荡一次,总共6次,于-20沉淀过夜。 (5 5)对沉淀过夜的蛋白质4,5000r/min,离心30min,倒掉上清液,加入5mL甲醇对蛋白进行洗涤,反复吹打均匀后,4,5000r/min,离心30
8、min。重复一次。五、双向电泳样本制备实例:五、双向电泳样本制备实例:(6 6)加入4mL丙酮对蛋白进行洗涤,反复吹打均匀后,4,5000r/min,离心30min。重复一次操作。加入3mL丙酮,吹打均匀后将蛋白质平均分到3支1.5mLEP管中,4,12000r/min,离心20min。倒去上清液后,平放于干净的纸巾上自然干燥,即可得到处理后的蛋白质团块,-80保存备用。 (7) (7)在干燥后的蛋白质团块中加入相应量的RB(具体加入量视蛋白团块大小而定),用枪头将蛋白质团块戳小后反复吹打直至蛋白质完全溶解。对于太过干燥的蛋白质团块(呈透明状),可用50L移液器调至10L刻度处,吸上一点RB封
9、住枪头,然后反复的将蛋白质团块戳小,再用超声仪处理,直至看不到明显的蛋白质团块为止。4,12000r/min,离心20min,吸出上清液,转移至新的EP管中。 辉骏生物:辉骏生物:http:/ 免费服务热线:免费服务热线:400-699-1663六、双向电泳样本制备试剂六、双向电泳样本制备试剂Alklysis buffer(LB)ReagentReagentFinal concentrationFinal concentrationTris20mMThiourea (FW 76.12)2MUrea (FW 60.06)7MCHAPs (FW 64.89)2%(W/V)Phenol extraction bufferReagentReagentFinal concentrationFinal concentrationSucrose (FM 342.30)0.7MKCl(FM 74.55)0.1MEDTA(FM 292.25)50mMTris(FM 121.14)0.5MHClTo pH7.5醋酸醋酸铵甲醇溶液甲醇溶液Ammonium acetate in methanolAmmonium acetate in methanol用甲醇配制0.1M的醋酸铵 辉骏生物:辉骏生物:http:/ 免费服务热线:免费服务热线:400-699-1663THANKS!