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1、第四章第四章利用基因工程技术表达利用基因工程技术表达蛋白质蛋白质本章的重点内容：本章的重点内容：1.什么是基因工程？什么是基因工程？2.获得目的基因的方法有哪些？获得目的基因的方法有哪些？3.DNA双脱氧测序技术的基本原理。双脱氧测序技术的基本原理。4.PCR技术的基本原理及其应用。技术的基本原理及其应用。5.基因定点突变技术及其应用。基因定点突变技术及其应用。6.表达载体的构建策略与技术方法。表达载体的构建策略与技术方法。7.如何根据蛋白质氨基酸序列获得其基因？如何根据蛋白质氨基酸序列获得其基因？利用基因工程技术表达蛋白质课件第一节第一节 基因工程原理简介基因工程原理简介一、基因工程的定义一
2、、基因工程的定义本义：本义：根据人们的意愿，利用工程设计的方法，在体外将根据人们的意愿，利用工程设计的方法，在体外将克隆获得的目的基因与适当的载体进行切割和连接，构建成正克隆获得的目的基因与适当的载体进行切割和连接，构建成正确的重组表达载体，再应用物理的、化学的或生物学的方法将确的重组表达载体，再应用物理的、化学的或生物学的方法将该表达载体导入到细菌、动植物细胞或受精卵中，使目的基因该表达载体导入到细菌、动植物细胞或受精卵中，使目的基因在宿主体内以瞬时方式或稳定方式进行表达，借此研究目的基在宿主体内以瞬时方式或稳定方式进行表达，借此研究目的基因的结构与功能，或获得该基因的表达产物。这一过程就是
3、基因的结构与功能，或获得该基因的表达产物。这一过程就是基因工程。因工程。广义：广义：转基因动物；克隆；基因打靶；基因组计划等均属转基因动物；克隆；基因打靶；基因组计划等均属于基因工程的范畴。于基因工程的范畴。利用基因工程技术表达蛋白质课件目的基因获得目的基因获得表达载体构建表达载体构建基因的导入基因的导入整合与表达的鉴定整合与表达的鉴定二、基因工程的基本步骤二、基因工程的基本步骤表达产物的提取、纯化与鉴定表达产物的提取、纯化与鉴定利用基因工程技术表达蛋白质课件第二节第二节 基因工程中的方法学基因工程中的方法学一、基因工程的基本技术一、基因工程的基本技术（一）无菌操作技术（一）无菌操作技术（二）
4、核酸的提取纯化（二）核酸的提取纯化1.RNA提取纯化技术；提取纯化技术；2.DNA提取纯化技术；提取纯化技术；3.plasmid提取纯化技术。提取纯化技术。（三）核酸电泳技术（三）核酸电泳技术1.琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳2.SDS-PAGE（四）感受态细胞的制备与转化（四）感受态细胞的制备与转化利用基因工程技术表达蛋白质课件真核细胞总真核细胞总RNA的电泳结果：的电泳结果：利用基因工程技术表达蛋白质课件核酸电泳技术核酸电泳技术1.琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳2.SDS-PAGE500200010007501002001 DL2000 marker1 DL2000 marker2 BamHI
5、2 BamHI和和EcoRIEcoRI双切双切3 BamHI3 BamHI单切切4 Hind4 Hind单切单切5 5 重组质粒重组质粒pVAX1/ABPS1pVAX1/ABPS1 1 2 3 4 5利用基因工程技术表达蛋白质课件二、一些重要技术原理介绍二、一些重要技术原理介绍重点介绍重点介绍DNA双脱氧双脱氧测序技术，核酸探针技术，测序技术，核酸探针技术，PCR技术技术等。等。（一）（一）DNADNA双脱氧测序双脱氧测序利用基因工程技术表达蛋白质课件利用基因工程技术表达蛋白质课件利用基因工程技术表达蛋白质课件利用基因工程技术表达蛋白质课件利用基因工程技术表达蛋白质课件(二二)核酸杂交技术（核
6、酸杂交技术（probe）1）原理；原理；2）标记物；标记物；3）种类；种类；4）应用应用 利用基因工程技术表达蛋白质课件1.Dotblot利用基因工程技术表达蛋白质课件2.Southernblot：DNA利用基因工程技术表达蛋白质课件3. Northernblot:RNA利用基因工程技术表达蛋白质课件Westernblot:Protein利用基因工程技术表达蛋白质课件（三）（三）PCRPCR技术技术 1.1.基本原理基本原理 2. 2.引物设计引物设计 1) 1)长度长度; 2)GC%; 3)stem-loop; ; 2)GC%; 3)stem-loop; 4)dimer; 5) 4)dime
7、r; 5)错配错配; ; 6)5 6)5末端可以不配对末端可以不配对 3. 3.应用应用: : 科学研究；医学与兽医临床。科学研究；医学与兽医临床。KaryB.MullisLaJolla,CA,USA.B.1944利用基因工程技术表达蛋白质课件DNADNA生物合成与生物合成与PCRPCR方法合成方法合成DNADNA的异同点的异同点: :1.1.相同点：相同点：均为酶促反应；均需要模板和引物；底物为均为酶促反应；均需要模板和引物；底物为dNTP；半保留复制；均为半保留复制；均为53方向复制。方向复制。2.2.不同点：不同点：1）反应条件不同：体内为生理条件，体外为反应条件不同：体内为生理条件，体
8、外为94、52及及72等变温条件；等变温条件；2）参与反应的物质种类和数量不同；参与反应的物质种类和数量不同；3 3）引物不同，体内为引物不同，体内为RNARNA，体外为，体外为DNADNA，且在，且在DNADNA合成后，前者合成后，前者 被切除掉，后者作为终产物的一部分；被切除掉，后者作为终产物的一部分；4 4）体内为半不连续合成，体外为连续合成；体内为半不连续合成，体外为连续合成；5 5）体内单复制原点或多复制原点，单方向或双方向复制；体内单复制原点或多复制原点，单方向或双方向复制；6 6）体内受细胞周期的调控，体外按人们的意愿进行；体内受细胞周期的调控，体外按人们的意愿进行；7 7）体内
9、具有校正、修复的功能（错配率较低），体外无（错配体内具有校正、修复的功能（错配率较低），体外无（错配 率较高）；率较高）；8 8）体内体内DNADNA的复制为全部染色体的复制为全部染色体DNADNA的复制，体外仅复制两引物的复制，体外仅复制两引物 之间的之间的DNADNA序列。序列。利用基因工程技术表达蛋白质课件（四）（四）目的基因的改造技术目的基因的改造技术 1. 1. 引物介导的基因定点突变技术引物介导的基因定点突变技术 2. 2. 盒式突变盒式突变(cassette mutagenesis)(cassette mutagenesis)3. Genes Shuffling3. Genes
10、Shuffling利用基因工程技术表达蛋白质课件三、基因工程中的工具三、基因工程中的工具（一）载体（一）载体1.1.质粒质粒( (plasmidplasmid) ) 2. 2.粘粒粘粒( (cosmidcosmid) ) 3. 3.噬菌体噬菌体( ( phage phage) )（二）工具酶（二）工具酶 1. 1.限制性内切酶限制性内切酶 2. 2.外切酶外切酶 3. 3.连接酶连接酶 4. 4.聚合酶聚合酶: klenow I: klenow I 5. 5.核酸酶核酸酶（三）宿主菌（三）宿主菌DH5 ,JM101,JM109;DE3等等利用基因工程技术表达蛋白质课件利用基因工程技术表达蛋白质
11、课件四、获得目的基因的方法四、获得目的基因的方法基因文库基因文库（基因组文库和（基因组文库和cDNA文库），化学合文库），化学合成，成，PCR等方法。还有等方法。还有DD-PCR以及以及基因芯片基因芯片等技等技术。术。（一）（一）基因组文库基因组文库目的：目的：种质资源的保护；基因组测序；基因组种质资源的保护；基因组测序；基因组基因或调控序列的克隆等。基因或调控序列的克隆等。利用基因工程技术表达蛋白质课件家蝇卵黄蛋白基因组基因的克隆家蝇卵黄蛋白基因组基因的克隆和序列分析和序列分析利用基因工程技术表达蛋白质课件特异性探针特异性探针噬菌斑原噬菌斑原位杂交位杂交鉴定鉴定可疑阳性克隆可疑阳性克隆亚克亚
12、克隆隆文库液文库液转化转化KW251噬菌斑噬菌斑三次纯化三次纯化噬菌斑原噬菌斑原位杂交位杂交-DNA 提提取取 阳性克隆阳性克隆单酶切和单酶切和双酶切双酶切Southern Southern BlotBlotHind IIIHind IIIXhoIXhoI目的目的DNA片段片段测序测序序列分析序列分析技术路线技术路线:利用基因工程技术表达蛋白质课件结果结果1:GCTCCCGGCCGCCATGGCCGCGGGATCGAACAAGAAGTCACCGTTTTCATCACCGGTCTGCCCCAGTCCTTGGAGGATGTGAAAAAGGCCAACACCAAATTGATCCAGTCCTACATTCA
13、ACGTTACAGCAAAAAACCCGAAGCACCCCAGGGTGAGGATCAATCGAAATGGGAAAATGAAAAACCTGTGGGCGGTCATTTGGTTGTCATCGATTTGGGCCATGCCATCACCAATGTGGAACGTTATGCCACTTTGAATGTCAAGGAGACCGGTAAAATGATTGGCAAGACCTTGGCCGAGTTGGAGAGGGAAAGCAATGTCGATTTGGAAGATCTCCATGTCATTGGTCAGGGTATTGGTGCCAATGTTGCCGGTGCTGCTGGTAAGGCTTTCAAGGACATTACCACCCACAAATTGGA
14、TCGCATTACTGCCTTGGACCCTGCCAGCCAAATGGCCAAGGATCCCAAAGTTTTGACCGGTTTGTCTCGTGGCAGTGCCAAATTCGTTGATGCCATCCACACCTCCGCCTTGGGTATGGGCACCACCCGTCGTGTTGGTGATGTTGATTTCTTCCCCAATGGACCATGCCAAGGTGTTCCCGGTAGCCGCAATGCCATCGATGCCCAAGCTCGTGCCACACGTCTCTTTGCCGAAACAGTTCGTCCCGGTAACAGCCGCAATTTCCCTGCCGTTGAGGCCAGCTCTTTGAAACAGTACCG
15、CAACAATGATGGCTATGGCAAACGCACCTACATGGGCATTGCCACCCATCGTGACATCTCCGGTGACTACATGTTGGAGGTTAAATCACTAGTGCGGCCGCCTGCAGGTCGACCATATGGGAGAGCTCCCAACGCGTTGGATGCATAGC卵黄蛋白基因部分卵黄蛋白基因部分DNA片段特异性探针序列片段特异性探针序列特异性探针制备特异性探针制备制备了大小为制备了大小为768bp的地高辛标记的的地高辛标记的DNA片段特异性探片段特异性探针，工作浓度为针，工作浓度为1:2000。利用基因工程技术表达蛋白质课件结果结果2:阳性克隆的筛选和纯化阳性
16、克隆的筛选和纯化1#positiveclone（about2000plaques/plate）Fig.3 Screening result of 1st round in situ hybridization图图3第第一一次次噬噬菌菌斑斑原原位位杂杂交交筛筛选结果选结果YP1 2#positiveclone（about200plaques/plate）Fig.4 Screening result of 2nd round in situ hybridization图图4第第二二次次噬噬菌菌斑斑原原位位杂杂交交筛筛选结果选结果Numbers：11positiveclone（11plaques/p
17、late）Fig.5 Screening result of 3rd round in situ hybridization图图5第第3次次噬噬菌菌斑斑原原位位杂杂交交筛筛选选结结果果获得了含家蝇卵黄蛋白基因的阳性克隆获得了含家蝇卵黄蛋白基因的阳性克隆利用基因工程技术表达蛋白质课件2.0 2.3 4.4 6.6 9.423 1.4 1.6 2.0 3.5 4.3 5.0 21 123456 kb kb Fig.6Digestionanalysisofrecombinant-DNAofpositiveplaque图图6阳性克隆阳性克隆-DNA的酶切分析的酶切分析结果结果3:mdYP基因组基因的克
18、隆基因组基因的克隆1:LambdaDNA/HindMarker2:Xho,3:Xho/Hind,4: Hind,5:Sal6:DNA/EcoR+HindMarker3.5 kb 124 1:XhoI，2:Hind3:Xho/HindFig.7 Southernblotofrecombinant-DNAofpositiveplaquewithmdYP1DNAprobeDIG-labeled图图7阳性克隆阳性克隆-DNA的的Southernblot利用基因工程技术表达蛋白质课件 1 ACAGAATTTGCTATTTAGGTCTTATATTTCTCAGAGCAAAGAGCTGGGCTGCAGAGAG
19、ATTTATGACAACGCCGTTGTGTGGTGTATGTATATAGAAAGA 1001 ACAGAATTTGCTATTTAGGTCTTATATTTCTCAGAGCAAAGAGCTGGGCTGCAGAGAGATTTATGACAACGCCGTTGTGTGGTGTATGTATATAGAAAGA 100 101 ATAGAAGAATTACTTTNCTTAGTTGTTTTTTAAATAATCCTGTCCAACAAATGTGTCCAATCCAATTCTTGTTTTATTGGTTTTATCCCTCCTTAATATT 200101 ATAGAAGAATTACTTTNCTTAGTTGTTTTTTAAAT
20、AATCCTGTCCAACAAATGTGTCCAATCCAATTCTTGTTTTATTGGTTTTATCCCTCCTTAATATT 200 201 AATCTTTTTGGTCTTATTGAATAATTATTGATTGTGGTGATTGCTGTCTCTACTTCGTTTGGTTTGGTTTGGTTGTCAGTTGCGAACGTTGGAAACAAAA 300 201 AATCTTTTTGGTCTTATTGAATAATTATTGATTGTGGTGATTGCTGTCTCTACTTCGTTTGGTTTGGTTTGGTTGTCAGTTGCGAACGTTGGAAACAAAA 300 301 ATGAAAAA
21、CGTCCCAACGAAACGAATATGAAGGCCACAAAGGAATACCCGATAAAAAATAAACAGAAAGCAAAGACTCCGGGTACTCTGTTGTTTACGAA 400 301 ATGAAAAACGTCCCAACGAAACGAATATGAAGGCCACAAAGGAATACCCGATAAAAAATAAACAGAAAGCAAAGACTCCGGGTACTCTGTTGTTTACGAA 400 401 TGAGACATGAGAGAATTGAACATCTTCACTAAAGAGCTCGGAATTAGTTACAAATTAAATTGAATTCGACGGTGCGGTGGCGACATGACA
22、GACGGACGGGT 500 401 TGAGACATGAGAGAATTGAACATCTTCACTAAAGAGCTCGGAATTAGTTACAAATTAAATTGAATTCGACGGTGCGGTGGCGACATGACAGACGGACGGGT 500 501 TGATGGATAGATAACGGCGTTGAGAGTGAATGTGTTGGCGTCTTGTCTCTATTGCAGGGTGATTCATATATTAGAAAATTTACAATGGAAAAGTGGTTAT 600 501 TGATGGATAGATAACGGCGTTGAGAGTGAATGTGTTGGCGTCTTGTCTCTATTGCAGGGTG
23、ATTCATATATTAGAAAATTTACAATGGAAAAGTGGTTAT 600 601 TTTAAATAAGAAATAATATATATATGATATATATGATGTTTGGGGAAAAAATATGAAAAGATTACACTCTTACCTCATTATCTTTACTAAAAAAGGTATT 700 601 TTTAAATAAGAAATAATATATATATGATATATATGATGTTTGGGGAAAAAATATGAAAAGATTACACTCTTACCTCATTATCTTTACTAAAAAAGGTATT 700 701 TTATGTATAAAAGGCTTGCAAAGTCGAAGTCTAT
24、TCACAAAAGATTCGAAAACGGTAATAAATGATCCTTCAGCAAAATATTATTGGACAGTATTGGACA 800 701 TTATGTATAAAAGGCTTGCAAAGTCGAAGTCTATTCACAAAAGATTCGAAAACGGTAATAAATGATCCTTCAGCAAAATATTATTGGACAGTATTGGACA 800 801 ATTCAACGATAAAAAAGTCACATTAAAAAGTGCTTTAAAAATAATGGCGGTTGACTTTTTTGCAGTTTTTTTTTTATCTTACCCTTTATGTCTAAAACGG 900 801 ATTCAAC
25、GATAAAAAAGTCACATTAAAAAGTGCTTTAAAAATAATGGCGGTTGACTTTTTTGCAGTTTTTTTTTTATCTTACCCTTTATGTCTAAAACGG 900 901 ACATTTTCAAAGGAACCTTATTCTAAAAATCTCAAAATATATGGAAGAGGGGGTAACTTTCCTCCTCTATTTAGGTTACTTTCCGATGTAAATTTTCAAA 1000 901 ACATTTTCAAAGGAACCTTATTCTAAAAATCTCAAAATATATGGAAGAGGGGGTAACTTTCCTCCTCTATTTAGGTTACTTTCCGATG
26、TAAATTTTCAAA 10001001 ACGCCATTACATTTGTCTTCTATTTTTAGCCCTACTTTCATAATCTACTAGATTATTTCAGTATTTTTTTGCACAGTGCAGGTGATGATATTGGATAATT 11001001 ACGCCATTACATTTGTCTTCTATTTTTAGCCCTACTTTCATAATCTACTAGATTATTTCAGTATTTTTTTGCACAGTGCAGGTGATGATATTGGATAATT 11001101 CTTATTGAGGAAAAAATTCCCCAGTAAGAATGGAGAATCGGGTTATGAAACAAGATTT
27、TTTAATAATTTCATTAATTATTTATTTTTTGNTTCTATGATT 12001101 CTTATTGAGGAAAAAATTCCCCAGTAAGAATGGAGAATCGGGTTATGAAACAAGATTTTTTAATAATTTCATTAATTATTTATTTTTTGNTTCTATGATT 12001201 TTGTGTTTTTTTTTTTTTTTGAATATTATTTTGAAATAAAGTGAAATCGAAATCTTCTCCTTTTTAGGTTATTGATCTAAAATACAAGGCTATTGCCAAA 13001201 TTGTGTTTTTTTTTTTTTTTGAATATTA
28、TTTTGAAATAAAGTGAAATCGAAATCTTCTCCTTTTTAGGTTATTGATCTAAAATACAAGGCTATTGCCAAA 13001301 ATCATGTAATACAATATTTGCTGAAATAGGCCAAATCACTTCTCGCCCTCCGTTCTATTTTTGATGACAGTGAAGCATTATGCAAGCTTGTTTCAATTCT 14001301 ATCATGTAATACAATATTTGCTGAAATAGGCCAAATCACTTCTCGCCCTCCGTTCTATTTTTGATGACAGTGAAGCATTATGCAAGCTTGTTTCAATTCT 1400140
29、1 CCCGCTTATCGTCACAACCTCTACAGATTTTGCAATTTACGTAAAGAAAAAGAAAAACGGCAAAATATTGAAAATGAAAATCAGCAAAAATCAAAAAAAT 15001401 CCCGCTTATCGTCACAACCTCTACAGATTTTGCAATTTACGTAAAGAAAAAGAAAAACGGCAAAATATTGAAAATGAAAATCAGCAAAAATCAAAAAAAT 15001501 TATCAGCAGTTCTCGCT1501 TATCAGCAGTTCTCGCTGGACTCACCTGACGGTCTGATGGACTCACCTGACGGTCT
30、GATGGACTCACCTGACGGTCTGATGGACTCACCTGACGGTCTGATTAACTATTTTGCTGTGAAATGTTAAATTTATTTGATATAAATACCCCCAGTGGAAGCCAGTG 1600TAACTATTTTGCTGTGAAATGTTAAATTTATTTGATATAAATACCCCCAGTGGAAGCCAGTG 16001601 GAGGGTACATTTCACAAGTTAGAACATTCGGCTTAAGAAGTGCCCGTACGACTTTGGGAATTTTTGAAACTGACCGACAGAAGG1601 GAGGGTACATTTCACAAGTTAGAACAT
31、TCGGCTTAAGAAGTGCCCGTACGACTTTGGGAATTTTTGAAACTGACCGACAGAAGGATGATGATGATGAATCCATTGGGAG 1700AATCCATTGGGAG 17001701 TTTTGTGCTTTGTAGCCTTTGTGGCTGCCGGCGCCTTGGCCTCACAATCGCAGGACTACAGTCCAAAGCCAGCACATTGGCTGAAACCCACCGAATTGGA 18001701 TTTTGTGCTTTGTAGCCTTTGTGGCTGCCGGCGCCTTGGCCTCACAATCGCAGGACTACAGTCCAAAGCCAGCACATTGG
32、CTGAAACCCACCGAATTGGA 18001801 G1801 GGCCACACCATCTTTGAATGCCACACCATCTTTGAATGCCACACCATCTTTGAATGCCACACCATCTTTGAATGAGCTCACCTTTGAGCAGCTGGAGAATATGCCATTGGAAAAGGGAGCCAAATTGATGCGTAAACTCTGAGCTCACCTTTGAGCAGCTGGAGAATATGCCATTGGAAAAGGGAGCCAAATTGATGCGTAAACTCTGTAAGTAGCCAGTCGTAAGTAGCCAGTC 1900 190019011901 AAGAATTTGG
33、AAAAGACCTCCAATAATACAATTTCTCTCTTCTCTAG AAGAATTTGGAAAAGACCTCCAATAATACAATTTCTCTCTTCTCTAGACCACCTGTCCCAAATCGACTACTCTGTGTCGCCCAACTTTGTGCCCAGTCCC 2000ACCACCTGTCCCAAATCGACTACTCTGTGTCGCCCAACTTTGTGCCCAGTCCC 20002001 AGCAATGTCCCCGTCTACATTTTCAACAGCAAGGGTGAAAAAGAAACCTGCAACTTGAACAACTACGTCGACATTGCCAAGGAAAAGCCGAAAT
34、TTGGCG 21002001 AGCAATGTCCCCGTCTACATTTTCAACAGCAAGGGTGAAAAAGAAACCTGCAACTTGAACAACTACGTCGACATTGCCAAGGAAAAGCCGAAATTTGGCG 2100获获得得了了全全长长3991bp的的基基因因组组序序列列，包包含含1.7kb卵卵黄黄蛋蛋白白基基因组基因及其因组基因及其5-调控区序列。调控区序列。利用基因工程技术表达蛋白质课件2101 AACAAGAAGTCACCGTTTTCATCACCGGTCTGCCCCAGTCCTTGGAGGATGTGAAAAAGGCCAACACCAAATTGATCCAGTCCTA
35、CATTCAACGTTACAG 22002101 AACAAGAAGTCACCGTTTTCATCACCGGTCTGCCCCAGTCCTTGGAGGATGTGAAAAAGGCCAACACCAAATTGATCCAGTCCTACATTCAACGTTACAG 22002201 CAAAAAACCCGAAGCACCCCAGGGTGAGGATCAATCGAAATGGGAAAATGAAAAACCTGTGGGCGGTCATTTGGTTGTCATCGATTTGGGCCATGCCATC 23002201 CAAAAAACCCGAAGCACCCCAGGGTGAGGATCAATCGAAATGGGAAAATGAAAAA
36、CCTGTGGGCGGTCATTTGGTTGTCATCGATTTGGGCCATGCCATC 23002301 ACCAATGTGGAACGTTATGCCACTTTGAATGTCAAGGAGACCGGTAAAATGATTGGCAAGACCTTGGCTGAGTTGGAGAGGGAAAGCAATGTCGATTTGG 24002301 ACCAATGTGGAACGTTATGCCACTTTGAATGTCAAGGAGACCGGTAAAATGATTGGCAAGACCTTGGCTGAGTTGGAGAGGGAAAGCAATGTCGATTTGG 24002401 AAGATCTCCATGTCATTGGTCAGGG
37、TATTGGTGCCAATGTTGCCGGTGCTGCTGGTAAGGCTTTCAAGGACATTACCACCCACAAATTGGATCGCATTAC 25002401 AAGATCTCCATGTCATTGGTCAGGGTATTGGTGCCAATGTTGCCGGTGCTGCTGGTAAGGCTTTCAAGGACATTACCACCCACAAATTGGATCGCATTAC 25002501 TGCCTTGGACCCTGCCAGCCAAATGGCCAAGGATCCCAAAGTTTTGACCGGTTTGTCTCGTGGCAGTGCCAAATTCGTTGATGCCATCCACACCTCCGCC 2600
38、2501 TGCCTTGGACCCTGCCAGCCAAATGGCCAAGGATCCCAAAGTTTTGACCGGTTTGTCTCGTGGCAGTGCCAAATTCGTTGATGCCATCCACACCTCCGCC 26002601 TTGGGTATGGGCACCACCCGTCGTGTTGGTGATGTTGATTTCTTCCCCAATGGACCATGCCAAGGTGTTCCCGGTAGCCGCAATGCCATCGATGCCCAAG 27002601 TTGGGTATGGGCACCACCCGTCGTGTTGGTGATGTTGATTTCTTCCCCAATGGACCATGCCAAGGTGTTCCCGGT
39、AGCCGCAATGCCATCGATGCCCAAG 27002701 CTCGTGCCACACGTCTCTTTGCCGAAACAGTTCGTCCCGGTAACAGCCGCAATTTCCCTGCCGTTGAGGCCAGCTCTTTGAAACAGTACCGCAACAATGA 28002701 CTCGTGCCACACGTCTCTTTGCCGAAACAGTTCGTCCCGGTAACAGCCGCAATTTCCCTGCCGTTGAGGCCAGCTCTTTGAAACAGTACCGCAACAATGA 28002801 TGGCTATGGCAAACGCACCTACATGGGCATTGCCACCCATCGTGA
40、CATCTCCGGTGACTACATGTTGGAGGTCAACGCCGAGAGCCCCTATGGCAAGAGA 29002801 TGGCTATGGCAAACGCACCTACATGGGCATTGCCACCCATCGTGACATCTCCGGTGACTACATGTTGGAGGTCAACGCCGAGAGCCCCTATGGCAAGAGA 29002901 ACTCCCGCCCGCAAACAAAAATCATACCATGGTGTTCATCAAACTTCCTATGCCAAAAGCAACGAAAACTATTAGAACGTTGGATGTTTGGCAAAAGAAA 30002901 ACTCCCGCCCGCAAA
41、CAAAAATCATACCATGGTGTTCATCAAACTTCCTATGCCAAAAGCAACGAAAACTATTAGAACGTTGGATGTTTGGCAAAAGAAA 30003001 AAGATTCTTTGGAAATGACTCCGAAAAAATTAAGCTGTGAATATTTGTCGAACGAAAACAGAAAAAAAAAACATCGAAGATAAATTATTGATTATTTAAT 31003001 AAGATTCTTTGGAAATGACTCCGAAAAAATTAAGCTGTGAATATTTGTCGAACGAAAACAGAAAAAAAAAACATCGAAGATAAATTATTGATTAT
42、TTAAT 31003101 TAAAAAAAAAAAAAAAAATAAGACTCTGAACATTACAAAAAGGAAATATTTATTTGAATTTTTATTCTTAGAGGATCGGGCGGGATAAACAAGATTATTA 32003101 TAAAAAAAAAAAAAAAAATAAGACTCTGAACATTACAAAAAGGAAATATTTATTTGAATTTTTATTCTTAGAGGATCGGGCGGGATAAACAAGATTATTA 32003201 AAGAAGGGCTAAAAATATAAGACAAGTGCGTCGGCGTTTTGAAAATGTACATGGCAAAGTAACCT
43、AAATAGAGGCGCAAAGTTCCTCCTCTTCCCCATTT 33003201 AAGAAGGGCTAAAAATATAAGACAAGTGCGTCGGCGTTTTGAAAATGTACATGGCAAAGTAACCTAAATAGAGGCGCAAAGTTCCTCCTCTTCCCCATTT 33003301 TTAGAAATTTCGTTTCATAATATGTACAGGGTGAGATAAAAAAAAACTGCAACAAAGTCAAACGCTATAATTTTTATTTTTTTTTTAATTTTATTTATTG 34003301 TTAGAAATTTCGTTTCATAATATGTACAGGGTGAG
44、ATAAAAAAAAACTGCAACAAAGTCAAACGCTATAATTTTTATTTTTTTTTTAATTTTATTTATTG 34003401 AAAGCAAAAAATGTCGGAAATAGCATCAAATTTTAGAATATATTTAGTGTACAAGTTCCAATACCGTCGTATGGACTTGTTGTGGTTCAAATTCTACTGA 35003401 AAAGCAAAAAATGTCGGAAATAGCATCAAATTTTAGAATATATTTAGTGTACAAGTTCCAATACCGTCGTATGGACTTGTTGTGGTTCAAATTCTACTGA 35003501 GTAGA
45、TTTTGAGCCGGAATTTATTGTTGCACAAAGACGAACAACAATATTGTTTAGCAAACTACAAACAAACACAAAAGTATTCTGACGATACTTACGTT 36003501 GTAGATTTTGAGCCGGAATTTATTGTTGCACAAAGACGAACAACAATATTGTTTAGCAAACTACAAACAAACACAAAAGTATTCTGACGATACTTACGTT 36003601 TGTTGTCTGCACAAAAGAAAAAGCACTTTAATAATTAGTATTTCAAAGTTGAAAATGACTCAGTCGGTCAAATTTTTATTTTATA
46、AAAAAATTCACAATT 37003601 TGTTGTCTGCACAAAAGAAAAAGCACTTTAATAATTAGTATTTCAAAGTTGAAAATGACTCAGTCGGTCAAATTTTTATTTTATAAAAAAATTCACAATT 37003701 TTGATCTGGCGATCCACTTTTCTGAACTTCAAGAAGAAGAGTGCCGTTTTTAGTTTTGTGACGACATCGATAGTTTTTATTTATCGAGATCGATTAGATC 38003701 TTGATCTGGCGATCCACTTTTCTGAACTTCAAGAAGAAGAGTGCCGTTTTTAGTT
47、TTGTGACGACATCGATAGTTTTTATTTATCGAGATCGATTAGATC 38003801 CATGTCGATGTCGTCATCTATCGGGTTGGGTCTATTCCCAACATGCCGGGCCCCTTGCACTGGTGCACAGTTAATGCCGTTGCTATTTTTTCAAGCACGC 39003801 CATGTCGATGTCGTCATCTATCGGGTTGGGTCTATTCCCAACATGCCGGGCCCCTTGCACTGGTGCACAGTTAATGCCGTTGCTATTTTTTCAAGCACGC 39003901 TCAGGAACCTGTCCATCATCTCTGG
48、CTGCTGCATTAAGGACTTTCCTTCGGGTTTTAATTCGGGCTGTTGTGCGGTATGTCGACTTTGTTG 39913901 TCAGGAACCTGTCCATCATCTCTGGCTGCTGCATTAAGGACTTTCCTTCGGGTTTTAATTCGGGCTGTTGTGCGGTATGTCGACTTTGTTG 3991图图3. 卵黄蛋白基因组基因全序列卵黄蛋白基因组基因全序列利用基因工程技术表达蛋白质课件（二）（二）cDNA文库的构建文库的构建利用基因工程技术表达蛋白质课件家蝇早期胚胎转基因前后的家蝇早期胚胎转基因前后的差异表达研究差异表达研究（三）（三）DD-PCR技
49、术技术利用基因工程技术表达蛋白质课件 5-NMAAAAAAAAAAAAA 5-NMAAAAAAAAAAAAAn n细胞总细胞总RNA或或poly(A)RNA 5-NMAAAAAAAAAAAAA5-NMAAAAAAAAAAAAAn ncDNA3-NMTTTTTTTTTTTTNMTTTTTTTTTTTT 简简并锚定引物并锚定引物 进行进行PCR随机十聚体随机十聚体NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NMTTTTTTTTTTTT NMTTTTTTTTTTTT持续循环持续循环NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNMTTTTTTTTTTTTNMTTTTTTTTTTTT变性聚丙烯酰胺凝胶电泳变性
50、聚丙烯酰胺凝胶电泳样品样品A样品样品B作作Northern探针探针作作cDNA文库筛选探针文库筛选探针作亚克隆和测序样品作亚克隆和测序样品反转录反应反转录反应切取目的带切取目的带, ,重新扩增重新扩增, ,回收纯化回收纯化利用基因工程技术表达蛋白质课件五、重组质粒（表达载体）的构建与鉴定五、重组质粒（表达载体）的构建与鉴定1.DNA（载体和目的片段）的酶切与回收。（载体和目的片段）的酶切与回收。2.目的片段与载体的连接。二者的摩尔比应满足以下目的片段与载体的连接。二者的摩尔比应满足以下比例：粘端：比例：粘端：35:1；钝端：；钝端：68:13.转化与重组质粒的筛选、鉴定。转化与重组质粒的筛选、
51、鉴定。1）初步鉴定：抗性；）初步鉴定：抗性；-互补；互补；快速鉴定；原位杂交；快速鉴定；原位杂交；PCR。2）酶切鉴定：大小和方向。）酶切鉴定：大小和方向。3）测序鉴定：双脱氧测序法。）测序鉴定：双脱氧测序法。利用基因工程技术表达蛋白质课件利用基因工程技术表达蛋白质课件六、基因导入技术六、基因导入技术（一）细菌（一）细菌 1.1.氯化钙氯化钙； 2. 2.电穿孔技术。电穿孔技术。（二）细胞（二）细胞 1. 1.脂质体脂质体； 2. 2.磷酸钙；磷酸钙； 3. 3.电穿孔；电穿孔； 4. 4.显显微注射；微注射； 5.Virus Vector 5.Virus Vector。（三）受精卵（三）受精
52、卵 1. 1.显微注射显微注射； 2. 2.电穿孔技术；电穿孔技术； 3. 3.精子载体；精子载体； 4.ESC 4.ESC； 5.Virus Vector 5.Virus Vector（ RT-V or Lentivirus-VRT-V or Lentivirus-V）。）。利用基因工程技术表达蛋白质课件七、常用表达系统七、常用表达系统（一）原核表达系统：（一）原核表达系统：包涵体；分泌型。包涵体；分泌型。已成功的基因工程产品绝大部分是利用原核系统生产的，已成功的基因工程产品绝大部分是利用原核系统生产的，如如IFN、IL、TNF、G-CSF、GM-CSF等。等。（二）真核表达系统：（二）真核
53、表达系统：传代细胞；酵母；生物反应器等。传代细胞；酵母；生物反应器等。1. 1. 传代细胞：如传代细胞：如CHOCHO、BHKBHK、VeroVero、MDCKMDCK等；等；2.2. 酵母：毕赤（甲醇）酵母。酵母：毕赤（甲醇）酵母。3.3. 生物反应器：如乳腺、血液、尿液、鸡蛋、昆虫等。生物反应器：如乳腺、血液、尿液、鸡蛋、昆虫等。世界上第一个动物（山羊）乳腺生物反应器产品世界上第一个动物（山羊）乳腺生物反应器产品重组人重组人抗凝血酶抗凝血酶（商品名（商品名ATryn）于）于2006年获准上市。由全球最著年获准上市。由全球最著名的动物乳腺生物反应器研发企业名的动物乳腺生物反应器研发企业美国美
54、国Genzyme转基因公转基因公司研制成功。司研制成功。利用基因工程技术表达蛋白质课件利用基因工程技术表达蛋白质课件利用基因工程技术表达蛋白质课件利用基因工程技术表达蛋白质课件利用基因工程技术表达蛋白质课件重组蛋白重组蛋白 动物动物 生产公司生产公司LA,-LA,单抗抗,溶菌溶菌酶酶,牛牛AdvancedCellTechnology,GeneticGH,INS,HSA牛牛SavingsandClone,Infigen,PharmingAT,tPA,tPA,单抗抗,GH,1-,GH,1-抗胰蛋白抗胰蛋白酶酶 山羊山羊 Genzyme Transgenics,Nexia Genzyme Trans
55、genics,Nexia Biotechnologies,PPL therapeutics Biotechnologies,PPL therapeutics纤维蛋白原表面蛋白蛋白原表面蛋白B,原胶原重原胶原重组抗体抗体小鼠小鼠Abgenix,Medarex凝血因子凝血因子，蛋白，蛋白C,血血红蛋白蛋白猪猪Alexion,Biotransplant,PPLTherapeuticsCT,IGF-1,IL-2,EPO,GH,细胞外胞外SOD,兔兔Pharming,PPLTherapeuticsa2-葡糖苷葡糖苷酶酶,糖原糖原样肽兔兔Pharming,PPLTherapeutics1-1-抗胰蛋白抗胰
56、蛋白酶酶, ,凝血因子凝血因子, , 绵羊羊 PPLTherapeuticsIGF-1, ,纤维蛋白原蛋白原绵羊羊PPLTherapeuticsNATURE Biotechnology, October,2000NATURE Biotechnology, October,2000表表1.部分已表达的蛋白质部分已表达的蛋白质利用基因工程技术表达蛋白质课件蛋白蛋白/肽 公司公司 开开发现状状 治治疗疾病疾病国外公司已开发的部分转基因动物产品国外公司已开发的部分转基因动物产品Developmentstatusofaselectedlistofproteinsproducedbytransgenica
57、nimalsABX-IL8 mAb Abgenix 临床床 I/II 牛皮牛皮癣ABX-EGF mAb Abgenix Preclinical EGF-依依赖性癌症性癌症a-1-抗胰蛋白抗胰蛋白酶 PPL Therapeutics Phase II 胆囊胆囊纤维化化a-1蛋白蛋白酶抑制抑制剂 Genzyme Transgenics R&D 遗传缺陷缺陷- IFN Genzyme Transgenics R&D 多多发性硬化性硬化胶原胶原 II Pharming Preclinical 风湿性关湿性关节炎炎因子因子 VII PPL Therapeutics Preclinical 出血出血时因子
58、因子 XI PPL Therapeutics Preclinical B型血友病型血友病纤维蛋白原蛋白原 PPL Therapeutics Preclinical 外外伤和手和手术时作作组织胶粘胶粘剂胰高血素胰高血素样肽-1 PPL Therapeutics R&D II-型糖尿病型糖尿病人人 GH Genzyme Transgenics R&D 身体生身体生长发育，脂肪育，脂肪动员HAS Genzyme Transgenics R&D 血血浆膨膨胀剂和和药物物赋形形剂MSP-1 (疟疾苗疾苗) Genzyme Transgenics R&D 疟疾疾蛋白蛋白 C PPL Therapeutic
59、s Preclinical 防止深部静脉的血栓形成防止深部静脉的血栓形成降降钙素素 (salmon) PLL Therapeutics Preclinical 骨骨质疏松疏松tPA Genzyme Transgenics R&D 心肌梗塞和非栓塞心肌梗塞和非栓塞利用基因工程技术表达蛋白质课件（三）提高真核表达效率的技术方法（三）提高真核表达效率的技术方法1. 1. 选用强启动子，如选用强启动子，如CMV、EF1等；等；2. 2. 组成型表达（可诱导表达）；组成型表达（可诱导表达）；3. 3. 增强子，如增强子，如MARMAR序列；序列；4. poly(A)4. poly(A)；5. Dhfr5
60、. Dhfr加压筛选系统；加压筛选系统；6. 6. 串联表达；串联表达；7. 7. 稳定表达（瞬时表达）；稳定表达（瞬时表达）；8. Kozak8. Kozak序列。序列。利用基因工程技术表达蛋白质课件基因组序列的选择性扩增基因组序列的选择性扩增染色体扩增染色体扩增以以dhfr基因的扩增为例，说明基因组序列的选择性基因的扩增为例，说明基因组序列的选择性扩增机制。扩增机制。二氢喋啶二氢喋啶FH2FH4CoF衍生物衍生物合成嘌呤或嘧合成嘌呤或嘧啶啶注：注：（1）合成酶；合成酶；（2）还原酶。还原酶。（1）（2）染色体扩增的本质是细胞内特定基因拷贝数的专一染色体扩增的本质是细胞内特定基因拷贝数的专一
61、性大量扩增性大量扩增(amplification)。（Amplificationreferstotheproductionofadditionalcopiesofachromosomalsequence,foundasintrachromosomalorextrachromosomalDNA.）利用基因工程技术表达蛋白质课件叶叶酸酸四氢叶酸四氢叶酸利用基因工程技术表达蛋白质课件MammaliangenesforDHFR(dihydrofolatereductase)havethesamerelativeorganizationofrathershortexonsandverylongintro
62、ns,butvaryextensivelyinthelengthsofcorrespondingintrons.利用基因工程技术表达蛋白质课件1.类型：类型： Unstablelines andStablelinesInunstablelines,theamplifiedgenesareatleastpartiallylostwhentheselectivepressureisreleased,becausetheamplifiedgenesexistasanextra-chromosomalarray.Instablelines,theamplifiedgenesareretained,be
63、causetheyresideonthechromosome,atthesiteusuallyoccupiedbythesingledhfrgene.Usuallytheotherchromosomeretainsitsnormalsinglecopyofdhfr.利用基因工程技术表达蛋白质课件Figure17.28Thedhfrgenecanbeamplifiedtogiveunstablecopiesthatareextra-chromosomal(doubleminutes)orstable(chromosomal).Extra-chromosomalcopiesariseatearly
64、times.利用基因工程技术表达蛋白质课件2.2.特点特点A.在用在用MTX加压筛选的初期，细胞大部分或全部是不稳加压筛选的初期，细胞大部分或全部是不稳定的；定的；B.dhfr基因的单细胞拷贝数的变化范围为基因的单细胞拷贝数的变化范围为40400，随着，随着加压程度的提高，拷贝数逐渐增加（可达加压程度的提高，拷贝数逐渐增加（可达1000个），对个），对MTX的耐受力也相应提高；的耐受力也相应提高；C.dhfr基因的长度为基因的长度为31kb，但被扩增的，但被扩增的DNA长度可达长度可达5001000kb；D.当当MTX压力解除后，压力解除后，dhfr基因将逐渐减少；基因将逐渐减少；E.当与当与
65、dhfr基因相连的外源基因相连的外源DNA导入细胞后，有整合到导入细胞后，有整合到内源内源dhfr基因位点的趋势。基因位点的趋势。利用基因工程技术表达蛋白质课件3.dhfr加压系统的应用加压系统的应用EPO（促红细胞生成素）的高效表达。（促红细胞生成素）的高效表达。pCMV/EPOCHOcellline/dhfr -StableHighExpressionMTXTransformationEPOExtraction利用基因工程技术表达蛋白质课件八、整合与表达的鉴定八、整合与表达的鉴定（一）整合鉴定（一）整合鉴定1.PCR；2.SouthernandDotblot；3.Sequencing（二）
66、表达鉴定（二）表达鉴定1.RT-PCRandNorthernblot2.RIA3.SDS-PAGE(Tricine-SDS-PAGE)4.HPLC5.Westernblot（三）蛋白结构鉴定：（三）蛋白结构鉴定：序列；立体构象。序列；立体构象。（四）功能检测（四）功能检测 活性测定；机体生理生化功能、性状的改变。活性测定；机体生理生化功能、性状的改变。利用基因工程技术表达蛋白质课件九、其他重要技术九、其他重要技术如何研究某种生物未知蛋白质的结构与功能？如何研究某种生物未知蛋白质的结构与功能？1. 1. 首先明确该蛋白的来源：原核或真核生物。首先明确该蛋白的来源：原核或真核生物。 2. 2. 将该蛋白提取纯化，纯度达将该蛋白提取纯化，纯度达97%97%以上，氨基酸序列测定；以上，氨基酸序列测定； 或利用该纯化蛋白免疫动物，例如兔子或利用该纯化蛋白免疫动物，例如兔子/ /豚鼠等，制备特豚鼠等，制备特异性抗体。异性抗体。3. 3. 表达表达cDNAcDNA文库文库+in situ immunoblot+in situ immunoblot方法。方法。4. RT-PCR4. RT-PCR法。法。利用基因工程技术表达蛋白质课件如何研究某种已知蛋白的调控序列如何研究某种已知蛋白的调控序列的结构与功能？的结构与功能？利用基因工程技术表达蛋白质课件
