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1、生物物理教研室生物物理教研室陈丽娜陈丽娜1讲课课件 激光扫描共聚焦显微镜激光扫描共聚焦显微镜 （LSCMLSCM） 2讲课课件 授课内容授课内容 一、一、LSCMLSCM的发展与现状的发展与现状 二、二、LSCMLSCM的成像原理及组成的成像原理及组成 三、三、LSCMLSCM的使用步骤的使用步骤四、四、LSCMLSCM的基本功能的基本功能 五、五、LSCMLSCM在生物医学领域中的应用在生物医学领域中的应用3讲课课件 19571957年，年，Marvin MinskyMarvin Minsky提出共聚焦原提出共聚焦原理；理； 19781978年，年，BrandengoffBrandengof
2、f在高数值孔径透在高数值孔径透镜装置上改装成功具有高清晰度的共聚焦显镜装置上改装成功具有高清晰度的共聚焦显微镜；微镜； 19821982年，年，BIO-RADBIO-RAD公司第一个推出商品公司第一个推出商品化激光扫描共聚焦显微镜化激光扫描共聚焦显微镜； 19851985年，年，Wijnaendts Van ResandtWijnaendts Van Resandt发表发表了第一篇有关激光扫描共聚焦显微镜在生物了第一篇有关激光扫描共聚焦显微镜在生物学中应用的文章；学中应用的文章； 19871987年，发展成现在通常意义上的第一年，发展成现在通常意义上的第一代激光扫描共聚焦显微镜。代激光扫描共聚
3、焦显微镜。一、激光扫描共聚焦显微镜发展与现状一、激光扫描共聚焦显微镜发展与现状4讲课课件仪仪器名称器名称器名称器名称生生生生产产商商商商型号型号型号型号BD高通量活细胞共聚焦分析系统400系列美国BD公司Pathway415、Pathway435BD 高通量活细胞共聚焦分析系统800系列美国BD公司800系列BD全光谱活细胞共聚焦高速扫描系统美国BD公司CARV尼康共焦显微镜尼康（Nikon)C1共焦激光扫描显微镜徕卡仪器有限公司 LeicaTCS-SP2OLYMPUS激光共聚焦显微镜OLYMPUSFV300OLYMPUS激光共聚焦显微镜OLYMPUSFV1000NIKON共聚焦显微镜尼康（n
4、ikon)尼康（nikon）C1-plusUltraView高速扫描型激光共聚集系统PerkinElmerUltraView高通量共聚焦显徽细胞图像分析测定系统GE HealthcareIN Cell Analyzer 3000时间分辨激光共聚焦显微成像系统德国耶莱公司TauMap德国ZEISS激光共聚焦显微镜德国 ZEISSLSM 510 SYSTEM德国ZEISS激光共聚焦显微镜德国ZEISSLSM 510 PASCAL SYSTEM5讲课课件FluoViewFluoView FV1000 FV1000共聚焦显微镜共聚焦显微镜 FV1000FV1000系统完美地系统完美地整合了两套相互独立
5、的整合了两套相互独立的扫描模块在一套系统内，扫描模块在一套系统内，在一束激光进行实验刺在一束激光进行实验刺激的同时，另一束激光激的同时，另一束激光实时地对样品进行扫描，实时地对样品进行扫描，从而记录完整的动态变从而记录完整的动态变化过程。化过程。 美国美国MeridianMeridian公司的公司的ACAS uLTIMA312ACAS uLTIMA312为同类仪器中为同类仪器中档次最高、功能最全的精密仪器。档次最高、功能最全的精密仪器。 它能达到每秒它能达到每秒120120幅画幅画面的高速扫描激光共聚焦观察，可提供实时，真彩色的激面的高速扫描激光共聚焦观察，可提供实时，真彩色的激光共聚焦原色图
6、象。光共聚焦原色图象。 BIO-RADBIO-RAD公司第七代公司第七代RadianceRadiance21002100型激光扫描共聚型激光扫描共聚焦显微镜是全世界唯一无需人工调整的激光扫描共聚焦扫焦显微镜是全世界唯一无需人工调整的激光扫描共聚焦扫描显微镜描显微镜 6讲课课件7讲课课件 1 1）激光光源）激光光源 2 2）计算机系统）计算机系统 3 3）共聚焦系统）共聚焦系统 4 4）光学探测系统）光学探测系统 5 5）图像分辨率）图像分辨率 6 6）扫描方式）扫描方式激光扫描共聚焦显微镜硬件和软件系统激光扫描共聚焦显微镜硬件和软件系统硬件系统硬件系统软件系统软件系统1 1）、）、Image
7、AnalyzeImage Analyze2 2）、）、Ratio AnalysisRatio Analysis和和 KineticsKinetics3 3）、）、Cell Cell Cell Communication and FRAPCell Communication and FRAP4 4）、）、Cell ListCell List5 5）、）、Cell SortingCell Sorting 6 6）、）、Confocal ImagingConfocal Imaging8讲课课件9讲课课件 激光扫描共聚焦显微镜（激光扫描共聚焦显微镜（Laser Scanning Laser Scann
8、ing Confocal Microscopy Confocal Microscopy ，简称，简称LSCMLSCM）是近代生物医）是近代生物医学图象仪器的最重要发展之一，它是在荧光显微镜学图象仪器的最重要发展之一，它是在荧光显微镜成象的基础上加装激光扫描装置，使用紫外光或可成象的基础上加装激光扫描装置，使用紫外光或可见光激发荧光探针，利用计算机进行图象处理，从见光激发荧光探针，利用计算机进行图象处理，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图象，以及而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图象，以及在亚细胞水平上观察诸如在亚细胞水平上观察诸如Ca2+Ca2+、pHpH值、膜电位等生值、膜电位等生理信号
9、及细胞形态的变化等。已广泛应用于细胞生理信号及细胞形态的变化等。已广泛应用于细胞生物学、生理学、病理学、解剖学、胚胎学、免疫学物学、生理学、病理学、解剖学、胚胎学、免疫学和神经生物学等领域，对生物样品进行定性、定量、和神经生物学等领域，对生物样品进行定性、定量、定时和定位研究具有很大的优越性，成为这些领域定时和定位研究具有很大的优越性，成为这些领域新一代强有力的研究工具。新一代强有力的研究工具。 二、激光扫描共聚焦显微镜成像原理及组成二、激光扫描共聚焦显微镜成像原理及组成10讲课课件1 1、LSCMLSCM的基本结构的基本结构 荧光显微镜系统及样品台荧光显微镜系统及样品台 激光光源激光光源 扫
10、描器扫描器 图象存储及处理系统图象存储及处理系统 计计 算算 机机 控控 制制 系系 统统 控制控制 11讲课课件共聚焦显微镜与普通光学显微镜的比较共聚焦显微镜与普通光学显微镜的比较 计算机数字图象处理分析系统计算机数字图象处理分析系统 普通光学显微镜普通光学显微镜场光源场光源干扰干扰激光扫描共聚焦显微镜激光扫描共聚焦显微镜激光光源激光光源共轭聚焦原理和装置共轭聚焦原理和装置照相照相12讲课课件Light Microscopy A C. elegans EmbryoG at pro-nuclei meetingG stage (before dividing into 2-cell embry
11、o) Differential Interference Contrast(DIC; Nomarski) Laser Scanning Confocal Microscopy (LSCM) Multiphoton Fluorescence Excitation Microscopy (MPFE) 13讲课课件2 2、LSCMLSCM的工作原理的工作原理 激光束激光束 扫描器扫描器 接收器接收器 计算机计算机 载物台的升降载物台的升降 “光学切片光学切片” “细胞细胞CTCT” 14讲课课件 L LS SC CM M组组成成光光路路的的示示意意图图 15讲课课件 Beam path in the
12、 confocal Beam path in the confocal laser scanning microscopelaser scanning microscope 16讲课课件17讲课课件18讲课课件（一）激光光源（一）激光光源 （1 1）、激光谱线、激光谱线（2 2）、激光器开闭和电压调节、激光器开闭和电压调节（3 3）、激光强度回馈稳定电路设计、激光强度回馈稳定电路设计（4 4）、辅助设备）、辅助设备19讲课课件波波长（nmnm） 功率功率(mW) (mW) 激光器激光器类型型 325 325 101030 30 氦氦镉(He-Cd)(He-Cd)激光激光 351 351 300
13、 300 带紫外的水冷式紫外的水冷式氩离子激光离子激光 364 364 20 20 风冷冷氩离子激光（离子激光（Ar-ionAr-ion） 442 442 11 11 氦氦镉激光激光 457457514 514 25 25 小型小型氩离子激光离子激光 543 543 1.25 1.25 绿氦氦氖(He-Ne)(He-Ne)激光激光 630 630 33 33 外外谐振器半振器半导体激光体激光 630 630 3 3 碰撞脉冲染料激光碰撞脉冲染料激光 632 632 3.5 3.5 氦氦氖激光激光 7007001100 1100 2 000 2 000 蓝宝石激光宝石激光 1 152 1 152
14、 1 1 氦氦氖激光激光 20讲课课件（二）扫描器（二）扫描器 扫描器扫描器针孔光栏（针孔光栏（pinholepinhole）分光镜分光镜发射荧光分色镜发射荧光分色镜检测器检测器21讲课课件1 1）针孔光栏）针孔光栏 2 2）分光镜）分光镜 作用作用 位置位置 位置位置 作用作用 22讲课课件3 3）发射荧光分色镜发射荧光分色镜 4 4）检测器检测器 位置位置 作用作用 位置位置 作用作用 23讲课课件扫扫描描装装置置光束扫描光束扫描 台阶扫描台阶扫描 扫描方式扫描方式 原原 理理优缺点优缺点24讲课课件25讲课课件扫描系统扫描系统 （1 1）、激光扫描系统通过照相通道或荧光通道和）、激光扫描
15、系统通过照相通道或荧光通道和显微镜相连，与所接显微镜一体化设计显微镜相连，与所接显微镜一体化设计（2 2）、检测器数量）、检测器数量 （3 3）、共聚焦针孔）、共聚焦针孔 （4 4）、扫描分辨率及灰度级）、扫描分辨率及灰度级 （5 5）、连续分光设计系统（或其它光谱分离系统）、连续分光设计系统（或其它光谱分离系统）50-30050-300微米微米 （6 6）、光谱扫描功能）、光谱扫描功能 （7 7）、扫描速度及速度调节）、扫描速度及速度调节 26讲课课件（8 8）、扫描方式）、扫描方式 XYZtXYZt任意组合任意组合 点扫描点扫描 线扫描线扫描 XX扫描扫描 平面扫描平面扫描 XYXY、XZ
16、XZ扫描扫描 xyz, xyztxyz, xyzt扫描扫描 局部放大局部放大扫描扫描 光谱模式下，多通道同时扫描。光谱模式下，多通道同时扫描。（9 9）、扫描旋转、光学放大（变倍）、扫描旋转、光学放大（变倍）（1010）、可即时或延时进行扫描）、可即时或延时进行扫描 （1111）、有线和帧方式的多重扫描功能）、有线和帧方式的多重扫描功能ROI(region of interestingROI(region of interesting，感兴趣区域），感兴趣区域） 实时（实时（real timereal time）显示）显示27讲课课件（1212）、在改变扫描分辨率及扫描速度等后，无）、在改变扫
17、描分辨率及扫描速度等后，无须很复杂地对仪器参数重新设置须很复杂地对仪器参数重新设置（1313）、有记忆功能）、有记忆功能 （1414）、有专用的图象数据库）、有专用的图象数据库 （1515）、系统采用模块化设计，便于整个系统）、系统采用模块化设计，便于整个系统的扩展和升级换代的扩展和升级换代28讲课课件29讲课课件Drosophilaembryo,brain,3DProjection-extendeddepthoffocus“(Prof.Reichert,LaborNeurobiologieUniversityofBasel)30讲课课件（三）光学系统（显微镜）（三）光学系统（显微镜） 、倒置
18、荧光万能显微镜、倒置荧光万能显微镜 、显微镜上的外接接口、显微镜上的外接接口 、荧光显微镜的载物台上装有微量步进马达、荧光显微镜的载物台上装有微量步进马达 、荧光镜座要装有防振动装置、荧光镜座要装有防振动装置 、装有光路转换装置、装有光路转换装置 、配备高数值孔径的油浸或水浸物镜、配备高数值孔径的油浸或水浸物镜 、载物台支架和附件的配置、载物台支架和附件的配置 31讲课课件(10)(10)、4 4位显微镜荧光滤色片组，置换方便，位显微镜荧光滤色片组，置换方便，覆盖紫外和可见光波长覆盖紫外和可见光波长、荧光显微镜的参数要与光路系统、计、荧光显微镜的参数要与光路系统、计算机控制软件系统相匹配算机控
19、制软件系统相匹配、汞灯光线的强度可调、汞灯光线的强度可调 32讲课课件33讲课课件 荧光源荧光源 单光子激励（左），多光子激励（右）单光子激励（左），多光子激励（右）激发荧光能量图激发荧光能量图 34讲课课件单光子（单光子（单光子（单光子（1 1 1 1）单光子（单光子（单光子（单光子（2 2 2 2）双光子（双光子（双光子（双光子（2 2 2 2）单、双光子激发产生荧光过程的示意图单、双光子激发产生荧光过程的示意图 荧光荧光荧光荧光35讲课课件 荧光光谱荧光光谱 36讲课课件37讲课课件 分隔发射的荧光分隔发射的荧光 38讲课课件 Separation of fluorescence emi
20、ssions Separation of fluorescence emissions by means of dichroic filtersby means of dichroic filters39讲课课件（四）计算机系统（四）计算机系统 控制硬件的软件功能：控制硬件的软件功能： 控制电动显微镜；控制电动显微镜； 选择激光波长，调节激光强度；选择激光波长，调节激光强度； 拍摄拍摄2-52-5维图像；维图像； 选择光谱拍摄范围，分辨率，激发光选择光谱拍摄范围，分辨率，激发光挡片位置。挡片位置。 40讲课课件应用软件功能（图象处理、数据分析、生物学应用软件功能（图象处理、数据分析、生物学应用
21、等）：应用等）： 多通道叠加，三维重建，旋转，生成多通道叠加，三维重建，旋转，生成AVIAVI文文件，件，AverageAverage拍摄模式提高信噪比；拍摄模式提高信噪比；荧光强度动荧光强度动态分析，动态显示，态分析，动态显示，RatioRatio值测量（钙离子等）；值测量（钙离子等）；FRAP/FLIPFRAP/FLIP；线性光谱拆分，自定义染料光谱线性光谱拆分，自定义染料光谱数据库，背景扣除；数据库，背景扣除；图像调节图像调节 亮度，对比度，亮度，对比度，GammaGamma；单个通道分别调节或多个通道同时调节；单个通道分别调节或多个通道同时调节；图像处理：旋转，裁剪，多种滤镜图像处理：
22、旋转，裁剪，多种滤镜（Kirsh/Laplace/Low pass/MedianKirsh/Laplace/Low pass/Median），添加标尺，），添加标尺，箭头，文字等；箭头，文字等；图像分析：直方图，距离，强度，图像分析：直方图，距离，强度，强度断面分布；强度断面分布；VBAVBA模块：宏功能，可以录制，模块：宏功能，可以录制，编辑，回放，实现自动操作；编辑，回放，实现自动操作；多种视图：多种视图：1D1D，2D2D，正交视图，图片叠加等；，正交视图，图片叠加等；光谱分析具有多种方光谱分析具有多种方式选择，支持盲法拆分，方便用户使用；式选择，支持盲法拆分，方便用户使用；具有专具有专
23、业的业的FRAPFRAP（荧光漂白），（荧光漂白），FRETFRET（荧光能量共振转移）（荧光能量共振转移）软件包。软件包。 41讲课课件42讲课课件三、激光扫描共聚焦显微镜的使用步骤三、激光扫描共聚焦显微镜的使用步骤（一）样品制备（一）样品制备1 1组织切片切片标本本 实验标本要求本要求单层，并能很好地，并能很好地贴附在附在样品池中。所以，品池中。所以，组织标本无本无论是石蜡切片是石蜡切片还是是冰冰冻切片，均切片，均为越薄越好。越薄越好。2 2细胞胞标本本 细胞种胞种类和和纯度，度，细胞密度和形胞密度和形态。3 3承承载细胞的器皿胞的器皿 PetriPetri皿和玻片。皿和玻片。43讲课课件
24、44讲课课件（二）荧光探针的选择（二）荧光探针的选择标记生物样品的探针标记生物样品的探针大约大约分为：分为：1）蛋白质、单糖和多糖探针；）蛋白质、单糖和多糖探针；2）细胞器探针；）细胞器探针；3）核酸探针；）核酸探针；4）细胞活性探针；）细胞活性探针；5）膜和受体探针；）膜和受体探针；6）细胞膜电位和细胞内）细胞膜电位和细胞内pH探针；探针；7）金属探针；）金属探针；8）分子的特殊基团结合探针；）分子的特殊基团结合探针；9）其他）其他45讲课课件46讲课课件47讲课课件（4 4）、按软件要求设置有关参数，进行）、按软件要求设置有关参数，进行观察和分析。观察和分析。（三）仪器使用步骤（三）仪器使
25、用步骤（1 1）、选择激光器类型）、选择激光器类型 （2 2）、选择相应的滤片）、选择相应的滤片 （3 3）、根据实验目的选择适当软件）、根据实验目的选择适当软件 48讲课课件XyXy观察模式的图象获得观察模式的图象获得设置染色方法设置染色方法显微镜和扫描的配置显微镜和扫描的配置设置物镜放大率设置物镜放大率设置变焦率为设置变焦率为1x1x设置所需通道设置所需通道设置最高扫描速度设置最高扫描速度设置设置xyxy观察模式观察模式执行重复扫描执行重复扫描校正对于确定校正对于确定z z位置观察所需复合的各部分条件位置观察所需复合的各部分条件设置观察范围设置观察范围校正图象亮度校正图象亮度设置较低的扫描
26、速度设置较低的扫描速度重新校正图象亮度重新校正图象亮度停止重复扫描停止重复扫描获得获得图象图象图象图象储存图象储存图象49讲课课件50讲课课件51讲课课件52讲课课件1 1） DNADNA用用Hoechst33342Hoechst33342标标记（蓝），记（蓝），2 2）细胞膜用）细胞膜用 NBD-PCNBD-PC染色（绿）染色（绿），3 3）线粒体用）线粒体用MitotrackerMitotracker标标记（红）记（红）三重荧光染色图谱：活三重荧光染色图谱：活HTHT细胞细胞53讲课课件1 1、“更多信号！更多信号！” 1 1）、）、 通过减慢扫描速度通过减慢扫描速度 2 2）、）、 使用
27、使用“平均平均”方法方法 3 3）、）、 增加发射滤镜的带宽增加发射滤镜的带宽 4 4）、）、 加大针孔直径；加大针孔直径； 注意：光学切片的厚度也会相应地增大。注意：光学切片的厚度也会相应地增大。 5 5）、）、 增大激发能（激光功率）；增大激发能（激光功率）； 注意：漂白效应、饱和效应和光毒效应。注意：漂白效应、饱和效应和光毒效应。如何改善图像质量如何改善图像质量54讲课课件3 3、“更可靠！更可靠！” 1 1）、使用多轨）、使用多轨 2 2）、提供预定义配置。）、提供预定义配置。 3 3）、可同时定义和使用任何形状的多）、可同时定义和使用任何形状的多个研究区。个研究区。2 2、“更多细节
28、！更多细节！” 1 1）、使用较高数值孔径）、使用较高数值孔径 (NA) (NA) 的物镜的物镜 2 2）、增加）、增加“帧大小帧大小” = = 每条线的像素值每条线的像素值 + + 每帧的线条数每帧的线条数 3 3）、优化扫描焦距）、优化扫描焦距 (Z)(Z) 4 4）、增加动态范围）、增加动态范围55讲课课件56讲课课件57讲课课件Cultured cells, multiple Cultured cells, multiple fluorescence (Prof. Wunderli- fluorescence (Prof. Wunderli- Allenspach, ETH ZAlle
29、nspach, ETH Z rich) rich) Cellculture,3DshadowprojectionCellculture,3Dshadowprojection(calculatedbyImaris,Bitplane(calculatedbyImaris,BitplaneAG,Zrich)showingtightAG,Zrich)showingtightjunctions(red)andcytoskeletonjunctions(red)andcytoskeletonstructures(green)(Prof.Wunderli-structures(green)(Prof.Wun
30、derli-Allenspach,ETHZrich)Allenspach,ETHZrich)58讲课课件四、激光扫描共聚焦显微镜的基本功能四、激光扫描共聚焦显微镜的基本功能 主要功能主要功能 采集图像采集图像 定量测定定量测定相关参数相关参数荧光信号定荧光信号定性定位观察性定位观察59讲课课件（一）采集和处理图像（一）采集和处理图像 1 1、无损伤逐层扫描样品采集二维及三维荧光图像、无损伤逐层扫描样品采集二维及三维荧光图像LSCMLSCM的成像特点：的成像特点：（1 1）、保持样品的完整性。）、保持样品的完整性。（2 2）、采集多重（波长）荧光分解及合成）、采集多重（波长）荧光分解及合成（ov
31、erlayoverlay）图像。）图像。（3 3）、所采集的荧光图像比普通荧光显微镜质量好，）、所采集的荧光图像比普通荧光显微镜质量好，更利于形态学观察。更利于形态学观察。（4 4）、可以只选择出样品中感兴趣的区域（）、可以只选择出样品中感兴趣的区域（regions regions of interestof interest，ROIROI）和深度进行扫描。）和深度进行扫描。（5 5）、获取三维重建图像）、获取三维重建图像2 2、获取透射光及反射光图像、获取透射光及反射光图像有、无荧光的样品均可以用有、无荧光的样品均可以用LSCMLSCM采集到其透射光图像。采集到其透射光图像。60讲课课件（二
32、）荧光分子的定性及定位（二）荧光分子的定性及定位1 1、定性鉴定待测荧光物质、定性鉴定待测荧光物质2 2、荧光信号的定位、荧光信号的定位（1 1）、单荧光定位）、单荧光定位（2 2）、多重荧光标记共定位）、多重荧光标记共定位（3 3）、荧光与透射光共定位）、荧光与透射光共定位61讲课课件Confocal micrograph of milk showing milk protein (green), fat (blue), sugar crystals (black) and cocoa solids (red). Bar = 25 mm 62讲课课件63讲课课件64讲课课件65讲课课件（三）
33、定量测定（三）定量测定 LSCM将所采集的共聚焦图像中的相关信息转将所采集的共聚焦图像中的相关信息转化为定量数据，即称之为定量测定。化为定量数据，即称之为定量测定。（1 1）图像中的任意区域（或线）的荧光强度。）图像中的任意区域（或线）的荧光强度。 （2 2）荧光强度随着时间、空间和波长的变化）荧光强度随着时间、空间和波长的变化曲线和数据。曲线和数据。（1 1）图像中的任意区域（或线）的荧光强度）图像中的任意区域（或线）的荧光强度（3 3）图像内的几何参数，包括面积、厚度、）图像内的几何参数，包括面积、厚度、空间距离、体积等。空间距离、体积等。 按照定量测定中是否含有时间控制程（按照定量测定中
34、是否含有时间控制程（t），将），将扫描模式分为扫描模式分为动态检测和静态测量动态检测和静态测量。66讲课课件67讲课课件The figure shows Ca2+ response to NAADP uncaging in mature Asterina pectinifera oocytes measured with confocal microscope. 68讲课课件（四）（四）LSCM可获取的图像种类可获取的图像种类 LSCM将所采集的光学图像分为两种：荧将所采集的光学图像分为两种：荧光图像和光镜图像。光图像和光镜图像。 1）单独采集荧光和光镜图像；）单独采集荧光和光镜图像； 2）分
35、通道道同时采集多重荧光图像和透射光）分通道道同时采集多重荧光图像和透射光图像，通过这些图像相互组合，同时展示在一幅画图像，通过这些图像相互组合，同时展示在一幅画面上；面上； 3）按照空间（三维）、时间或波长顺序采集）按照空间（三维）、时间或波长顺序采集图像，通过这些图像组合则可完成断层扫描、三维图像，通过这些图像组合则可完成断层扫描、三维重建、时间动态实时检测及波长扫描等功能，从而重建、时间动态实时检测及波长扫描等功能，从而实现空间分辨、时间分辨和波长分辨。实现空间分辨、时间分辨和波长分辨。69讲课课件显微观察方式显微观察方式 70讲课课件71讲课课件72讲课课件73讲课课件74讲课课件（五）
36、光谱交叉干扰及其消除（五）光谱交叉干扰及其消除 两种以上荧光探针之间，如果荧光发射峰很两种以上荧光探针之间，如果荧光发射峰很近，荧光光谱彼此会有部分重叠，这种现象称谓近，荧光光谱彼此会有部分重叠，这种现象称谓光谱交叉（光谱交叉（crosstalkcrosstalk）；一种荧光探针的荧光）；一种荧光探针的荧光信号扩散到另一荧光探针的检测通道，造成光谱信号扩散到另一荧光探针的检测通道，造成光谱交叉干扰。交叉干扰。75讲课课件76讲课课件避免或排除光谱交叉干扰的方法避免或排除光谱交叉干扰的方法 1 1）、同时使用几种荧光探针时，尽量选、同时使用几种荧光探针时，尽量选择相互之间无光谱交叉的荧光探针。择
37、相互之间无光谱交叉的荧光探针。 2 2）、降低标记荧光强度。（采用降低标、降低标记荧光强度。（采用降低标记物浓度、缩短标记时间、调整探针介质等记物浓度、缩短标记时间、调整探针介质等方法）方法） 3 3）、采用顺序扫描方法克服光谱交叉。、采用顺序扫描方法克服光谱交叉。 4 4）、改变检测仪器条件。）、改变检测仪器条件。 5 5）、）、荧光光谱鉴别法荧光光谱鉴别法77讲课课件78讲课课件Different populations of neurofibrillary tangles are present in the CA1 region of the hippocampus in AD79讲课课件五、激光扫描共聚焦显微镜在五、激光扫描共聚焦显微镜在生物医学领域中的应用生物医学领域中的应用（一）在细胞及分子生物学中的应用（一）在细胞及分子生物学中的应用 （二）在基础医学中的应用（二）在基础医学中的应用 （三）在临床医学中的应用（三）在临床医学中的应用 80讲课课件
