中药指纹图谱研(盛习锋)

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1、中中 药药 指指 纹纹 图图 谱谱盛习锋盛习锋 第一章第一章 中药指纹图谱技术与中药质量控制中药指纹图谱技术与中药质量控制 1.1 指纹图谱的起源与发展指纹图谱的起源与发展 现现代代指指纹纹鉴鉴定定始始于于19世世纪纪末末20世世纪纪初初的的范范罪罪学学和和法法医医学学。每每个个人人的的指纹在微小的细节构造上各有不同，可以据以鉴别每个人的特征。指纹在微小的细节构造上各有不同，可以据以鉴别每个人的特征。 指指纹纹图图谱谱技技术术应应用用于于植植物物药药质质量量控控制制，是是从从20世世纪纪70年年代代，色色谱谱技技术术的的发发展展，人人们们大大量量采采用用薄薄层层色色谱谱（TLC）方方法法，将将

2、植植物物中中化化学学成成分分展展载载于于由由各各种种担担体体铺铺成成的的薄薄层层板板上上。根根据据薄薄层层板板上上的的斑斑点点的的位位置置、斑斑点点大大小小、斑斑点点颜颜色色、斑斑点点数数目目的的多多少少进进行行定定性性鉴鉴别别，这这种种薄薄层层鉴鉴别别方方法法具具备备了了指指纹纹图图谱谱的的特特征。征。 20世世纪纪70年年代代及及80年年代代，出出现现薄薄层层扫扫描描仪仪，日日本本和和我我国国部部分分学学者者用用薄薄层扫描仪得到复方成药扫描图作为色谱指纹图尝试应用于药材及成药分析。层扫描仪得到复方成药扫描图作为色谱指纹图尝试应用于药材及成药分析。 20世世纪纪80年年代代及及90年年代代，

3、高高效效液液相相技技术术得得到到发发展展，同同时时植植物物药药中中化化学学成成分分的的分分离离鉴鉴定定、活活性性成成分分的的不不断断阐阐明明，高高效效液液相相广广泛泛应应用用于于定定性性、定定量量分分析。析。 西西方方普普遍遍采采用用高高效效液液相相色色谱谱法法对对植植物物药药中中已已知知及及未未知知组组分分进进行行控控制制，并并形形成成相相应应的的规规范范。目目前前高高效效液液相相色色谱谱法法已已成成为为当当前前研研究究指指纹纹图图谱谱的的主主要要手手段。段。 1.2 中药指纹图谱的定义中药指纹图谱的定义 中药指纹图谱鉴别借用了法医学的指纹鉴定的概念。中药指纹图谱鉴别借用了法医学的指纹鉴定的

4、概念。 定定义义：运运用用现现代代分分析析技技术术对对中中药药化化学学信信息息以以图图形形（图图像像）的方式进行表征并加以描述。的方式进行表征并加以描述。 由由次次生生代代谢谢产产物物组组成成的的中中药药提提取取物物的的色色谱谱指指纹纹图图谱谱不不仅仅具具备备个个体体的的绝绝对对的的惟惟一一性性，更更强强调调的的是是物物种种特特征征的的惟惟一一性性与与同同种种植植物中的相似性。物中的相似性。 现现代代分分析析技技术术：包包括括光光谱谱、波波谱谱、色色谱谱、核核磁磁共共振振、X射射线衍射及各种技术的联用。线衍射及各种技术的联用。 中中药药化化学学信信息息：植植物物药药（包包括括来来源源于于植植物

5、物的的中中药药材材）的的提提取取物物（包包括括中中药药的的汤汤药药）与与化化学学合合成成药药最最根根本本的的区区别别是是，它它（即即使使是是单单味味药药材材）是是多多种种化化学学成成分分的的混混合合体体。这这种种多多种种化化学学成成分分的的综综合合体体构构成成了了“中中药药化化学学信信息息”。由由于于中中药药的的疗疗效效由由多多种种成成分分协协同同作作用用或或“相相克克作作用用”，中中药药中中的的化化学学信信息息有有一一定定的的模模糊糊性性。只只有有部部分分化化学学信信息息（包包括括已已知知的的活活性性成成分分、已已知知的的非非活活性性成成分分、一一部分未知成分）可表征于指纹图谱中。部分未知成

6、分）可表征于指纹图谱中。 表征和描述表征和描述：“表征表征”是将中药化学信息通过色谱图是将中药化学信息通过色谱图（液相色谱图、气相色谱图或薄层色谱图）等方式进行表达；（液相色谱图、气相色谱图或薄层色谱图）等方式进行表达；“描述描述”是对指纹图谱经过计算、分析、比较、评价等过程，是对指纹图谱经过计算、分析、比较、评价等过程，以技术参数、指纹特征等加以说明。以技术参数、指纹特征等加以说明。 中药指纹图谱研究须经过制备、分析、比较、评价和校中药指纹图谱研究须经过制备、分析、比较、评价和校验等过程。验等过程。 分析色谱指纹图要求分析色谱指纹图要求“准确的辨认准确的辨认”，不是，不是“精密的测精密的测量

7、量”；比较供试品与对照品的色谱指纹图谱是要求比较供试品与对照品的色谱指纹图谱是要求“相似相似”，而不是，而不是“相同相同”； 评价色谱比较的结果，是根据色谱指纹图谱的模糊属性，评价色谱比较的结果，是根据色谱指纹图谱的模糊属性，着眼于宏观的规律性的特征分析，即着重辨认完整色谱的着眼于宏观的规律性的特征分析，即着重辨认完整色谱的“图图貌貌”，而不是求索细枝末节。，而不是求索细枝末节。 分析比较的结果，是对供试品与对照品之间的差异或一分析比较的结果，是对供试品与对照品之间的差异或一致性作出评价。致性作出评价。 1.3中中药药指指纹纹图图谱谱与与中中药药安安全全、有有效效、稳稳定定和和可控的关系可控的

8、关系 药药物物研研究究的的主主要要内内容容包包括括药药物物安安全全性性、有有效效性性、稳定性和可控性，四者缺一不可。稳定性和可控性，四者缺一不可。 已已生生产产并并临临床床使使用用的的注注射射剂剂等等中中成成药药，由由于于经经过过了了药药效效学学测测试试、临临床床评评价价，安安全全性性与与有有效效性性没没有有，但但是是，现现有有的的质质量量控控制制方方法法的的不不全全面面性性及及生生产产过过程程中中的的不不稳稳定定性性导导致致各各批批次次产产品品之之间间质质量量出出现现差差异异，在在临临床应用过程中往往出现非正常的医疗事故。床应用过程中往往出现非正常的医疗事故。 指纹图谱研究的直接目的有两个方

9、面：指纹图谱研究的直接目的有两个方面： （1） 对中药质量控制的补充和提高。对中药质量控制的补充和提高。 现现有有中中国国药药典典质质量量控控制制方方法法及及新新药药申申报报资资料料7，往往往往以以1个个或或个个以以上上成成分分为为控控制制指指标标，在在一一定定程程度度上上反反映映了了原原药药材材、中中间间体体及及成成品品的的质质量量，但但任任何何单单一一的的成成分分都都难难以以准准确确、全全面面地地评评价价中中药药质质量量，不不仅仅不不能能进进行行真真伪伪鉴鉴别别和和优优劣劣判判别别，在在很很多多情情况况下下，所所检检测测的的指指标标成成分分（活活性性成成分分）还还不不具具有有“惟惟一一性性

10、”，使用器材比较简单，操作比较粗糙，有时重现性差。，使用器材比较简单，操作比较粗糙，有时重现性差。 中中药药注注射射剂剂指指纹纹图图谱谱研研究究的的技技术术要要求求要要求求将将指指纹纹图图谱谱检检测测指指标标及及持持续续术术要要求求作作为为质质量量标标准准单单列列项项目目，是是对对现现行行中中药质量控制标准的有益补充。药质量控制标准的有益补充。 一个理想的指纹图谱不仅能达到定性鉴别的目的，色一个理想的指纹图谱不仅能达到定性鉴别的目的，色谱图中大部分药谱理应达到基线分离，对大部分成分应可进行谱图中大部分药谱理应达到基线分离，对大部分成分应可进行定量分析。在没有对照品的情况下，也可以已知标准品针对

11、其定量分析。在没有对照品的情况下，也可以已知标准品针对其他未知或无标准品的色谱峰进行定量。因此，中药指纹图谱是他未知或无标准品的色谱峰进行定量。因此，中药指纹图谱是对现行中药质量标准近控制方法的提高。对现行中药质量标准近控制方法的提高。 （2） 控制中间体、成品的一致性，减少批间差异控制中间体、成品的一致性，减少批间差异 中中药药生生产产的的原原材材料料，因因土土壤壤、气气候候等等环环境境因因素素及及采采收收加加工工的的不不同同，实实际际使使用用时时不不能能保保证证药药材材质质量量的的稳稳定定，经经加加工工提提取取得得到到的的中中间间体体，每每个个批批次次在在成成分分含含量量、成成分分组组成成

12、及及各各成分比例方面都不能保持一致。成分比例方面都不能保持一致。 通通过过指指纹纹图图谱谱研研究究，可可以以掌掌握握每每一一个个批批次次的的原原药药材材、中中间间体体中中成成分分变变化化，进进行行有有指指导导的的合合理理“勾勾兑兑“，保保证证成成品品在成分含量、组成比例上一致，减少批间差异。在成分含量、组成比例上一致，减少批间差异。 无无论论是是原原药药材材、中中间间体体还还是是成成品品，因因组组方方已已固固定定、生生产产工工艺艺相相对对恒恒定定，药药品品的的安安全全性性不不可可能能直直接接通通过过指指纹纹图图谱谱来来保保障障，但但中中药药指指纹纹图图谱谱可可直直接接解解决决中中间间体体、成成

13、品品的的批批间间一一致致性性及及稳稳定定性性问问题题，从从而而可可以以间间接接并并最最终终保保障障成成品品的的安安全全性性和有效性。和有效性。一致性一致性安全性安全性指纹图谱指纹图谱可控性可控性有效性有效性 1.4 中药指纹图谱建立的意义与原则中药指纹图谱建立的意义与原则 中中药药指指纹纹图图谱谱建建立立的的是是全全面面反反映映中中药药内内在在化化学学成成分分的的种种类类与与数数量量，进进而而反反映映中中药药的的质质量量。现现阶阶段段中中药药的的有有效效成成分分绝绝大大多多数数没没有有明明确确，采采用用中中药药指指纹纹图图谱谱的的方方式式，将将有有效效地地表表征征中中药药质质量量。指指纹纹图图

14、谱谱已已为为国国际际社会所认可，有利于中药及产品进入国际市场。社会所认可，有利于中药及产品进入国际市场。 中中药药指指纹纹图图谱谱的的建建立立，应应以以系系统统的的化化学学成成分分和和药药理理学学研研究究为为依依托托，应应体体现现系系统统性性、特特征征性性、重重现现性性三个基本原则。三个基本原则。系统性系统性： “系系统统性性“是是指指指指纹纹图图谱谱所所反反映映的的化化学学成成分分应应包包括括中中药药有有效效部部位位所所含含大大部部分分成成妥妥的的种种类类，或或指指标标成成分分的的全部。全部。 如如：中中药药人人参参中中所所含含的的有有效效成成分分多多为为皂皂苷苷类类化化合合物物，则则其其指

15、指纹纹图图谱谱应应尽尽可可能能多多地地反反映映其其中中的的皂皂苷苷成成分分；银银杏杏叶叶中中的的有有效效成成分分是是黄黄酮酮和和银银杏杏内内酯酯类类，则则其其指指纹纹图图谱谱可可采采用用两两种种方方法法针针对对这这两两类类成成分分，分分别别分分析析，以以达达到系统、全面的目的。到系统、全面的目的。特征性特征性： “特特征征性性“是是指指指指纹纹图图谱谱中中反反映映的的化化学学成成分分信信息息（具具体体表表现现为为保保留留时时间间或或位位移移值值）是是具具有有高高度度选选择择性性的的，这这些些信信息息的的综综合合结结果果，将将能能特特征征地地区区分分中中药药的的真真伪与优劣，成为中药自身的伪与优

16、劣，成为中药自身的”化学条码化学条码“。 如如：北北五五味味妇妇的的高高效效液液相相色色谱谱和和薄薄层层色色谱谱指指纹纹图图谱谱，不不仅仅包包括括多多种种已已知知的的五五味味子子木木脂脂素素成成分分，而而且且还还有有很很多多未未知知成成分分，这这些些成成分分之之间间的的顺顺序序、比比值值在在一一定定范范围围内内是是固固定定的的，并并且且随随药药材材品品种种的的不不同同而而不不同同。通通过过这这些些整整体体信信息息，可可以以很很好好地地区区分分北北五五味味子子与与南南五五味味子子以以及及其其它它来来源源的的五五味味子子药药材材，辨辨别别药药材材的的真真伪伪与与优优劣。劣。重现性重现性： “重重现

17、现性性“是是指指所所建建立立的的指指纹纹图图谱谱，在在规规定定的的方方法法与与条条件件下下，不不同同的的操操作作者者和和不不同同的的实实验验室室应应能能作作出出相相同同的的指指纹纹图图谱谱，其其误误差差应应在在允允许许的的范范例例内内，这这样样才才可可以以保保证证指指纹纹图图谱谱的的使使用用具具有有通通用用性性和和实实用用性性，也也是是作作为标准方法所必备的特征之一。为标准方法所必备的特征之一。 实实现现指指纹纹图图谱谱的的重重现现性性，除除在在样样品品制制备备方方法法、分分析析过过程程、结结果果处处理理待待环环节节规规范范操操作作外外，还还应应建建立立相相应应的的评评价价机机制制，对对指指纹

18、纹图图谱谱进进行行客客观观评评价价，并并公公布布标标准准指指纹图谱。纹图谱。 实实现现中中药药指指纹纹图图谱谱的的三三原原则则，保保证证其其标标准准化化，做做到到统统一一规规范范，这这样样才才可可以以使使中中药药指指纹纹图图谱谱得得以以推推广广应应用。用。 1.5 国外植物药指纹图谱的应用国外植物药指纹图谱的应用 美美国国FDA：允允许许草草药药保保健健品品申申报报资资料料可可以以提提供供色色谱指纹图；谱指纹图； WHO：1996年年草草药药评评价价指指导导原原则则中中规规定定，如如果果草草药药的的活活性性成成分分不不明明，可可以以提提供供色色谱谱指指纹纹图图谱谱以以证证明明产产品品质量的一致

19、。质量的一致。 欧欧共共体体：在在草草药药质质量量指指南南中中称称，单单靠靠测测定定某某有有效效成成分分考考察察质质量量的的稳稳定定性性是是不不够够的的，因因为为草草药药及及其其制制剂剂是是以以整整体体为为活活性性物物质质。在在欧欧共共体体药药品品申申请请注注册册表表格格中中植植物物药药制制品品的的“药药物物专专家家报报告告“要要求求通通过过已已知知的的具具有有治治疗疗作作用的活性物质对原料、中间体及成品进行标准化控制。用的活性物质对原料、中间体及成品进行标准化控制。第二章第二章 中药指纹图谱研究方法学中药指纹图谱研究方法学 2.1 常用指纹图谱研究的方法与技术常用指纹图谱研究的方法与技术 研

20、究对象的不同，指纹图谱研究的方法与技术也不同，研究对象的不同，指纹图谱研究的方法与技术也不同，并都随着现代科技技术的发展而发展。并都随着现代科技技术的发展而发展。 中药指纹图谱研究所采用的方法大致分为：色谱法、光中药指纹图谱研究所采用的方法大致分为：色谱法、光谱法及其它。谱法及其它。 色谱法包括：薄层色谱法（色谱法包括：薄层色谱法（TLC）、）、液相色谱法（液相色谱法（LC）、）、气相色谱法（气相色谱法（GC）、）、高效毛细管电泳法（高效毛细管电泳法（CE）；）； 光谱法包括：紫外光谱法（光谱法包括：紫外光谱法（UV）、）、红外光谱法（红外光谱法（IR）、）、近红外光谱法（近红外光谱法（NIR

21、）；）； X射线衍射法、核磁共振法（射线衍射法、核磁共振法（NMR）等。等。 （1） X射线衍射法及核磁共振法射线衍射法及核磁共振法 这这两两种种方方法法能能给给出出药药效效物物质质基基础础的的结结构构信信息息，部部分分信信息息也也可可能能与与特特定定化化学学成成分分直直接接关关联联。但但该该两两种种方方法法所所使使用用的的仪仪器器在在国国内内尚尚未未普普及及，不不适适应应该该方方法法的的应应用用与与推推广广。在在中中药药指指纹纹图图谱谱研研究究过过程程中中不不建建议议采采用用X射线衍射法及核磁共振法。射线衍射法及核磁共振法。 （2） 紫外可见分光光度法和红外光谱法紫外可见分光光度法和红外光谱

22、法 这这两两种种方方法法能能够够给给出出药药效效物物质质基基础础的的结结构构信信息息，但但所所给给出出的的信信息息是是所所有有化化学学物物质质结结构构结结构构信信息息的的加加和和，不不具具备备指指纹纹特特征征，但但可可作作为为中中药药指指纹纹图图谱谱研研究究的的辅辅助助方法。方法。 （3） 近红外光谱法近红外光谱法 此此方方法法与与红红外外光光谱谱法法原原理理相相同同，但但检检测测时时采采用用近近红红外外波波长长，所所给给出出的的信信息息是是所所有有化化学学物物质质结结构构信信息息的的加加和和，通通过过一一系系列列样样本本的的检检测测（必必须须预预先先知知道道样样品品中中相相关关成成分分的的含

23、含量量或或样样本本的的定定性性归归属属），运运用用化化学学计计量量学学手手段段，建建立立了了样样本本与与信信息息之之间间的的数数学学模模型型。运运用用该该模模型型即即可可对对未未知知样样本本（如如：新新近近购购进进的的原原药药材材或或新新生生产产的的成成品品等等）进进行行辨辨别别分分析析（给给出出结结果果：合合格格与与否否、含量多少等）。含量多少等）。 优优点点：检检测测速速度度快快（通通常常为为1 min）、操操作作简简单单、适适宜宜过过程程控制等。控制等。 数据处理需掌握一定的化学计量学知识。数据处理需掌握一定的化学计量学知识。 近红外技术在农药、化工、农业等相关领域已广泛应用，近红外技术

24、在农药、化工、农业等相关领域已广泛应用，方法的成熟度较高，在中药质量控制方面有较好的应用前景，方法的成熟度较高，在中药质量控制方面有较好的应用前景，可大力推广近红外技术在原材料质量控制中的应用。可大力推广近红外技术在原材料质量控制中的应用。 （4） 薄层色谱法薄层色谱法 薄薄层层色色谱谱法法为为传传统统的的定定性性、定定量量分分析析方方法法，广广泛泛应应用用于道地药材的定性鉴定。于道地药材的定性鉴定。 2000版版中中国国药药典典，采采用用薄薄层层色色谱谱法法进进行行定定性性鉴鉴别别，列列于于【鉴鉴别别】项项下下；采采用用薄薄层层扫扫描描法法进进行行含含量量测测定定，列列于于【含量测定】项下。

25、含量测定】项下。 优点：操作简单、分析速度快、一次分析样品数量多。优点：操作简单、分析速度快、一次分析样品数量多。 缺点：重现性、精密度差。缺点：重现性、精密度差。 可作为中药指纹图谱研究的借鉴与补充。可作为中药指纹图谱研究的借鉴与补充。 （5） 液相色谱法液相色谱法 最最常常用用的的指指纹纹图图谱谱研研究究方方法法，其其中中高高效效液液相相色色谱谱法法（HPLC）具具有有分分离离效效能能高高、选选择择性性高高、检检测测灵灵敏敏高高、分分析析速速度快、应用范围广等特点。度快、应用范围广等特点。 中中药药样样品品中中含含有有的的成成分分绝绝大大多多数数可可在在高高效效液液相相色色谱谱仪仪上上进进

26、行行分分析析检检测测，方方法法成成熟熟，中中药药指指纹纹图图谱谱研研究究应应优优先先考考虑虑高效液相色谱法。高效液相色谱法。 （6） 气相色谱法气相色谱法 气气相相色色谱谱法法主主要要用用于于分分析析气气体体、挥挥发发性性和和半半挥挥发发性性液液体体以以及及能能够够产产生生足足够够蒸蒸气气压压的的固固体体，或或者者沸沸点点在在500以以下下，相对分子质量相对分子质量400以下的物质。以下的物质。 在在中中药药质质量量控控制制中中主主要要用用于于挥挥发发油油、极极性性较较小小的的成成分分或衍生化后的可挥发性成分（如脂肪酸的酯）。或衍生化后的可挥发性成分（如脂肪酸的酯）。 特特点点：灵灵敏敏度度高

27、高、分分离离度度好好、分分析析速速度度快快，定定量量分分析析的的精精密密度度优优于于1%，但但分分析析范范围围只只局局限限于于低低沸沸点点成成分分是是其其主主要要不不足。为中药指纹图谱研究的主要方法之一。足。为中药指纹图谱研究的主要方法之一。 （7） 高效毛细管电泳法高效毛细管电泳法 高高效效毛毛细细管管电电泳泳法法是是以以毛毛细细管管为为分分离离通通道道、以以高高压压直直流流电电场场为为驱驱动动力力的的新新型型分分离离分分析析技技术术。适适用用于于中中药药中中带带电电荷荷的的化化合合物物（蛋蛋白白质质、氨氨基基酸酸、黄黄酮酮、生生物物碱碱）、有有机机酸酸、单单糖糖及及一些中性分子的分离分析，

28、可作为中药指纹图谱研究的补充。一些中性分子的分离分析，可作为中药指纹图谱研究的补充。 （8） 其它其它 高高效效液液相相色色谱谱与与质质谱谱联联用用（HPLC-MS）、气气相相色色谱谱与与质谱联用（质谱联用（GC-MS）、）、毛细管电泳与质谱联用（毛细管电泳与质谱联用（CE-MS）等。等。这这些些方方法法可可在在指指纹纹图图谱谱中中的的部部分分色色谱谱峰峰在在无无标标准准物物质质验验证证的的情情况下，起到定性鉴别的作用。况下，起到定性鉴别的作用。最最 常用为：常用为：TLC、HPLC、GC。 2.2 指纹图谱研究常用的仪器与设备指纹图谱研究常用的仪器与设备 2.2.1 薄层扫描仪薄层扫描仪 （

29、1） 薄层扫描流程薄层扫描流程点样点样 洗脱展开洗脱展开 扫描检测扫描检测 数据处理数据处理 （2） 薄层扫描仪主要部件薄层扫描仪主要部件 典典型型的的薄薄层层扫扫描描仪仪主主要要由由机机械械扫扫描描装装置置和和数数据据处处理理两两部部分分组成，新型的薄层扫描仪配有自动点样器等。组成，新型的薄层扫描仪配有自动点样器等。 （3） 主要厂家及仪器型号主要厂家及仪器型号 日本岛津日本岛津CS系列；美国系列；美国Schoeffel SD3000等。等。 2.2.2 高效液相色谱仪高效液相色谱仪2 2.2.3 气相色谱仪气相色谱仪 2.3 指纹图谱研究对高效液相色谱仪的要求指纹图谱研究对高效液相色谱仪的

30、要求 2.3.1 柱外效应柱外效应 应特别注意应特别注意“柱外效应柱外效应”对分析结果的影响。对分析结果的影响。 由由于于样样品品分分子子在在液液体体流流动动相相的的扩扩散散系系数数比比在在气气体体中中小小45个个数数量量级级，液液体体流流动动相相的的流流速速也也比比气气相相慢慢12个个数数量量级级，因因此此，样样品品注注入入色色谱谱柱柱后后，在在柱柱子子以以外外任任何何死死空空间间（如如进进样样器器、柱柱接接连连接接管管和和检检测测器器）中中，样样品品分分子子的的扩扩散散和和滞滞留留都都会会显显著著引引起起色色谱谱峰峰的的扩散，而使柱效降低，所以柱外死体积的影响量不能忽略。扩散，而使柱效降低

31、，所以柱外死体积的影响量不能忽略。 在在制制造造和和使使用用高高效效液液相相色色谱谱仪仪时时，应应使使柱柱外外效效应应减减至至最最小小,以获得理想的分析结果。以获得理想的分析结果。 建议建议：色谱柱及检测器前：色谱柱及检测器前死体积应最小死体积应最小。2.3.2 流动相的脱气流动相的脱气 流流动动相相在在使使用用前前必必须须进进行行脱脱气气处处理理，以以除除去去其其中中溶溶解解的的气气体体（如如O2），防防止止在在洗洗脱脱过过程程中中，因因压压力力降降低低而而产产生生气气泡泡。若若在在低低死死体体积积检检测测池池中中存存在在气气泡泡，会会增增加加基基线线噪噪声声，严严重重时时会会造造成成分析灵

32、敏度下降而无法进行分析。分析灵敏度下降而无法进行分析。 溶解在流动相中的氧气会造成荧光猝灭，影响荧光检测器溶解在流动相中的氧气会造成荧光猝灭，影响荧光检测器的检测；可导致样品中的某些级组分被子氧化或使柱中固定相的检测；可导致样品中的某些级组分被子氧化或使柱中固定相发生降解而改变柱的分离性能。发生降解而改变柱的分离性能。 常用的脱气方法有常用的脱气方法有离线式脱气离线式脱气和和在线式脱气在线式脱气。离离线线式式脱脱气气：吹吹氦氦脱脱气气法法、加加热热回回流流法法、抽抽真真空空脱脱气气法法、超超声声波波脱脱气气法法等等。离离线线式式脱脱气气会会因因流流动动相相存存放放时时间间的的延延长长以以致致有

33、有空空气重新溶解在流动相中；气重新溶解在流动相中；在线式脱气在线式脱气技术是把真空脱气装置串接到贮液系统中，并结合技术是把真空脱气装置串接到贮液系统中，并结合膜过滤器，实现流动相在进入输液泵前的连续脱气。在线式脱膜过滤器，实现流动相在进入输液泵前的连续脱气。在线式脱气法的脱气效果明显优于离线式脱气法，并适用于多元溶剂体气法的脱气效果明显优于离线式脱气法，并适用于多元溶剂体系。系。建议建议：选择：选择在线脱气在线脱气。2.3.3 梯度洗脱梯度洗脱 梯梯度度洗洗脱脱是是流流动动相相中中含含有有两两种种或或两两种种以以上上的的不不同同极极性性的的溶溶剂剂，在在洗洗脱脱过过程程中中连连续续或或间间断断

34、改改变变流流动动相相的的组组成成，以以调调节节它它的的极极性性，使使每每个个流流出出的的组组分分获获得得最最理理想想的的分分离离效效果果，并并使使样样品品中中的的所所有有组组分分可可在在最最短短的的分分析析时时间间内内，以以适适用用的的分分离离度度获获得得圆圆满满的的选选择择性分离。分为高压梯度和低压梯度两种方式进行操作。性分离。分为高压梯度和低压梯度两种方式进行操作。 由由于于高高压压梯梯度度装装置置中中，每每种种溶溶剂剂是是分分别别由由泵泵输输送送的的，进进入入混混合合器器后后，溶溶剂剂的的可可压压缩缩性性和和溶溶剂剂混混合合时时的的热热力力学学体体积积的的变变化化，可可能能影影响响输输入

35、入到到色色谱谱柱柱的的流流动动相相的的组组成成，因因此此高高压压梯梯度度洗洗脱脱过过程程中中为保证流速稳定必须使用恒流泵，否则很难获得重复性结果。为保证流速稳定必须使用恒流泵，否则很难获得重复性结果。 低压梯度是在常压下将多元溶剂输至混合器中。低压梯度是在常压下将多元溶剂输至混合器中。优优点点是是：仅仅需需要要使使用用一一个个高高压压输输液液泵泵；减减小小了了溶溶剂剂可可压压缩缩性性的的影影响响，并并能能完完全全消消除除由由于于溶溶剂剂混混合合引引起起的的热热力力学学体体积积变变化化带带来来的误差。的误差。建议建议：选择：选择低压梯度低压梯度。 2.3.4 样品进样样品进样 进样器有以下几种：

36、进样器有以下几种： （1） 停流进样装置停流进样装置 为为防防止止在在带带压压操操作作下下引引起起流流动动相相泄泄露露，此此装装置置要要求求进进样样前压降至常压下再进样，操作繁琐，已较少使用。前压降至常压下再进样，操作繁琐，已较少使用。 （2） 六通阀进样装置六通阀进样装置 该方法重现性较好，较常用。该方法重现性较好，较常用。 （3） 自动进样器自动进样器 自自动动进进样样器器由由计计算算机机自自动动控控制制定定量量阀阀，按按预预先先编编制制的的注注射射样样品品操操作作程程序序工工作作。取取样样、进进样样、复复位位、样样品品管管路路清清洗洗和和样样品品盘盘的的转转动动，全全部部按按预预定定程程

37、序序自自动动进进行行，一一次次可可进进行行几几十十个个或上百个样品的分析。或上百个样品的分析。 自自动动进进样样的的样样品品量量可可连连续续调调节节，适适合合大大量量样样品品分分析析，节节省人力。省人力。 （4） 建建议议：中中药药指指纹纹图图谱谱研研究究过过程程中中，由由于于对对样样品品的的进进样样量量精精确确度度要要求求不不高高，因因此此对对进进样样器器的的选选择择可可结结合合研研究究者者的的实实际情况，建议选择际情况，建议选择六通阀手动进样装置六通阀手动进样装置。2.3.5 色谱柱色谱柱2.3.6 柱温柱温 不不同同柱柱温温下下同同一一成成分分在在的的保保留留时时间间往往往往发发生生迁迁

38、移移，有时还影响成分之间的分离效果。有时还影响成分之间的分离效果。 由由于于中中药药样样品品成成分分的的复复杂杂性性，尤尤其其是是中中药药指指纹纹图图谱谱技技术术要要求求色色谱谱峰峰的的相相对对保保留留时时间间、峰峰面面积积比比值值的的相相对对恒恒定定，对对柱柱温温的的要要求求应应严严格格控控制制，以以保保证证分分析析方方法法的重现性。的重现性。建议建议：选择：选择柱温箱柱温箱。 2.3.7 检测器检测器 （1） 紫外线检测器紫外线检测器 应用最广，要求分析样品必须在紫外线区有吸收。应用最广，要求分析样品必须在紫外线区有吸收。 特特点点：灵灵敏敏度度高高、线线性性范范围围宽宽，可可做做成成很很

39、小小池池体体积积的的流流通通，对对流流动动相相的的流流速速和和温温度度变变化化不不太太敏敏感感，易易操操作作，不不破破坏坏样样品，波长可以选择及可用于梯度洗脱。品，波长可以选择及可用于梯度洗脱。 （2） 示差折光检测器示差折光检测器 示示差差折折光光检检测测器器是是通通用用型型检检测测器器，对对在在可可见见光光或或紫紫外外线线区区无无吸吸收收的的样样品品一一般般选选用用。不不破破坏坏样样品品，缺缺点点是是对对温温度度变变化化敏感，不能用低梯度洗脱，灵敏度低，不能用于痕量分析。敏感，不能用低梯度洗脱，灵敏度低，不能用于痕量分析。 （3） 荧光检测器荧光检测器 （4） 电化学检测器电化学检测器 （

40、5） 二极管阵列检测器二极管阵列检测器 光光束束通通过过流流通通池池、分分光光系系统统后后，使使所所有有波波长长在在二二级级管管阵阵列列检检测测器器同同时检测器，可得三维的时间时检测器，可得三维的时间-色谱信号色谱信号-吸收光谱图。吸收光谱图。 特特点点：可可进进行行全全波波长长检检测测，一一次次进进样样可可以以检检测测到到样样品品中中不不同同波波长长下下的的所所有有组组分分；光光谱谱分分辨辨率率高高，可可以以检检测测色色谱谱峰峰的的纯纯度度；灵灵敏敏度度高高，线线性性范范围宽，基线噪声小。围宽，基线噪声小。 可可得得到到所所有有组组分分的的全全波波长长扫扫描描图图，可可用用于于定定性性分分析

41、析，通通过过对对三三维维色色谱图的分析，可以优化检测波长。谱图的分析，可以优化检测波长。 （6） 蒸发激光光散射检测器蒸发激光光散射检测器 通通用用性性检检测测器器。可可以以检检测测挥挥发发性性低低于于流流动动相相的的任任何何样样品品，可可作作于于无无生生色色团团物物质质的的检检测测，如如碳碳水水化化合合物物（多多糖糖）、类类脂脂类类（磷磷脂脂）、皂皂苷苷、不不进行衍生化的脂肪酸和氨基酸，以及结构不明又无标准样品的未知物。进行衍生化的脂肪酸和氨基酸，以及结构不明又无标准样品的未知物。 根根据据具具体体情情况况，进进行行选选择择。据据统统计计，95%的的中中药药组组分分在在可可见见光光或或紫紫外

42、线区有吸收，可首选配置可编波长紫外线检测器（外线区有吸收，可首选配置可编波长紫外线检测器（VWD）。）。 建建议议：在在指指纹纹图图谱谱研研究究过过程程中中，由由于于并并不不完完全全了了解解样样品品中中所所含含组组分分的的化化学学结结构构，尤尤其其是是复复方方制制剂剂所所含含组组分分结结构构类类型型不不一一，最最大大吸吸收收波波长长各各不不相同，很难一次成功地选择好检测波长。因此相同，很难一次成功地选择好检测波长。因此最好选用二极管阵列检测器最好选用二极管阵列检测器。第三章第三章 中药色谱指纹图谱研究过程中的中药色谱指纹图谱研究过程中的关键问题关键问题 指纹图谱技术在植物药领域已应用十余年，研

43、究指纹图谱技术在植物药领域已应用十余年，研究方法与研究思路相对成熟，已形成共识，普遍采用方法与研究思路相对成熟，已形成共识，普遍采用HPLC、TLC、GC或或NIR（近红外技术），对植物药近红外技术），对植物药有效组分进行全成分质量控制，即指纹图谱技术。有效组分进行全成分质量控制，即指纹图谱技术。 3.1 方案设计与思路方案设计与思路3.1.1 研究对象的确定研究对象的确定 植物药或中药的成分可分为：蛋白质、脂类、糖及衍生物、有机酸、酚植物药或中药的成分可分为：蛋白质、脂类、糖及衍生物、有机酸、酚类、鞣质、醌类、内酯、香豆精、黄酮类、皂苷类、生物碱类、甾体类、萜类、鞣质、醌类、内酯、香豆精、黄

44、酮类、皂苷类、生物碱类、甾体类、萜类、挥发油等。类、挥发油等。 当当研研究究某某个个注注射射剂剂品品种种的的指指纹纹图图谱谱时时，首首先先必必须须调调研研相相关关的的文文献献、新新药药申申报报资资料料（质质量量部部分分和和工工艺艺部部分分）及及其其它它研研究究结结果果， 尽尽可可能能详详尽尽地地了了解解药药材材、中中间间体体及及成成品品中中所所含含水水量量成成分分的的种种类类及及其其理理化化性性质质，经经综综合合分分析析后后找找出出成成品品中中的的药药效效成成妥妥或或有有效效成成分分，作作为为成成品品或或中中间间体体指指纹纹图图谱谱的的研研究究对对象象，即即分析检测目标。分析检测目标。如如：黄

45、黄芪芪含含黄黄酮酮、皂皂苷苷及及多多糖糖；黄黄芪芪多多糖糖注注射射液液是是以以黄黄芪芪中中的的多多糖糖为为原原料料，因因此此对对黄黄芪芪多多糖糖注注射射液液进进行行指指纹纹图图谱谱研研究究时时应应以以多多糖糖作作为为研研究究对对象象；研研究究其其中中间间体体时时也也应应以以多多糖糖为为研研究究对对象象；研研究究原原药药材材的的指指纹纹图图谱谱时时应应把把黄黄酮酮、皂皂苷苷及多糖作为研究对象。及多糖作为研究对象。 复复方方应应以以君君药药、臣臣药药中中有有效效成成分分作作为为主主要要研研究究对对象象，佐佐使使药药中中的的成成分分可可采用其它指纹图谱方法进行辅助、补充研究。采用其它指纹图谱方法进行

46、辅助、补充研究。3.1.2 研究方法的选择研究方法的选择 主主要要采采用用色色谱谱法法。各各种种色色谱谱法法是是互互补补的的，应应根根据据研研究究对对象象的的实实际际需需要要和和可可能能以以及及按按照照不不同同色色谱谱技技术术的的特特点点和和优优势势而而定定，目目的的是是保保证证方方法法的的重重现现性性和和确确能能反反映映产产品品质量的主要化学成分。质量的主要化学成分。 一一个个中中药药制制剂剂指指纹纹图图谱谱应应可可以以同同时时采采用用两两种种或或更更多多种方法进行研究。种方法进行研究。 指指纹纹图图谱谱研研究究方方法法应应根根据据研研究究对对象象的的物物理理化化学学性性质质来来选选择择，大

47、大多多数数方方法法可可采采用用HPLC法法。通通常常挥挥发发油油类类采采用用GC。一一些些难难以以检检测测或或采采用用上上述述方方法法得得不不到到较较理理想想的的分分离离效果时，可采用效果时，可采用TLC或或CE。3.1.3 研究内容研究内容 根根据据国国家家药药品品监监督督管管理理局局下下发发的的中中药药注注射射剂剂指指纹纹图图谱谱研研究究的的技技术术要要求求（暂暂行行）的的规规定定，主主要要研研究究内内容容有有原原药药材材、中中间间体体、注注射射剂剂的的指指纹纹图图谱谱，涉涉及及样样品品名名称称、来来源源、制制备备、测测定方法、指纹图谱及技术参数等研究项。定方法、指纹图谱及技术参数等研究项

48、。3.2 原药材、中间体及注射剂样品选择与收集原药材、中间体及注射剂样品选择与收集 中中药药是是天天然然产产物物，中中药药的的活活性性成成分分都都是是次次生生的的代代谢谢产产物物，本本身身有有它它内内在在的的不不稳稳定定性性。我我国国药药材材品品种种多多、产产地地广广、分分散散度度大大，造造成成了了中中药药材材基基源源复复杂杂，形形成成许许多多同同名名异异物物的的品品种种，这这些些品品种种在在传传统统中中医医临临床床中中并并未未加加以以细细分分，其其中中多多数数已已收收入入中中华华人人民民共共和和国国药药典典。对对于于中中国国药药典典收收载载的的品品种种，从从中中医医的的角角度度均均可可入入药

49、药，这这种种多多基基源源药药材材增增加加了了色色谱谱指指纹纹图图谱谱研研究究的的难难度。度。 近年由于药材量需求增大，药材资源破坏严重，药材内在质近年由于药材量需求增大，药材资源破坏严重，药材内在质量下降，炮制加工的粗放造成有效成分的流失，人为因素造成量下降，炮制加工的粗放造成有效成分的流失，人为因素造成了药材质量不稳定，不利于色谱指纹图谱的研究与应用。了药材质量不稳定，不利于色谱指纹图谱的研究与应用。 我我国国药药材材GAP工工程程已已起起步步，将将有有利利于于中中药药注注射射剂剂及及其其它它制制剂的质量控制。剂的质量控制。 已已生生产产的的注注射射剂剂，因因生生产产中中药药材材来来源源基基

50、本本确确定定，在在补补充充其其指指纹图谱时，原药材样品的收集应遵循以下原则：纹图谱时，原药材样品的收集应遵循以下原则：药材尽可能固定产地（如道地药材）、采收期、炮制方法；药材尽可能固定产地（如道地药材）、采收期、炮制方法；对对已已往往生生产产使使用用过过的的药药材材应应结结合合临临床床使使用用情情况况选选择择收收集集样样品品，对对工工艺艺稳稳定定、疗疗效效恒恒定定、临临床床使使用用中中很很少少出出现现异异常常医医疗疗事事故故的的药药材批次应重点选择；材批次应重点选择；另另外外还还应应收收集集不不同同产产地地、不不同同采采收收期期的的药药材材，这这些些药药材材虽虽然然含含量量高高低低不不同同，组

51、组成成比比例例各各异异，但但当当正正常常使使用用的的药药材材一一旦旦出出现现偏偏差差时时，可可通通过过这这些些批批次次的的药药材材实实行行合合理理“勾勾兑兑”。通通过过对对指指纹纹图图谱谱的研究，可以对的研究，可以对“勾兑勾兑”过程进行指导。过程进行指导。 中中间间体体、注注射射剂剂因因其其生生产产工工艺艺已已经经恒恒定定，样样品品的的收收集集原原则则也也应应重重点点选选择择工工艺艺稳稳定定、疗疗效效恒恒定定、临临床床使使用用中中很很少少出出现现医医疗疗事事故故的批次。的批次。 根根据据中中药药注注射射剂剂指指纹纹图图谱谱研研究究的的技技术术要要求求（暂暂行行）之之规规定定，原原药药材材、中中

52、间间体体及及注注射射剂剂样样品品至至少少应应收收集集10批批次次。不不可可以以同同一批次的样品分散成数个批次，充当样品。一批次的样品分散成数个批次，充当样品。33 原药材、中间体及注射剂的预处理原药材、中间体及注射剂的预处理 在在指指纹纹图图谱谱研研究究过过程程中中，供供试试品品（原原药药材材、中中间间体体及及注注射射剂剂）溶溶液液的的制制备过程不是关键性的技术问题，但操作烦琐。备过程不是关键性的技术问题，但操作烦琐。 原原药药材材的的供供试试品品制制备备最最为为复复杂杂。原原药药材材所所含含的的多多种种组组分分混混杂杂在在一一起起，样样品品制制备备时时，应应根根据据所所含含成成分分和和物物理

53、理化化学学性性质质，通通过过萃萃取取、沉沉淀淀、吸吸附附或或通通过过化学反应，分离富集样品。化学反应，分离富集样品。 如如：黄黄芪芪药药材材中中的的黄黄酮酮类类成成分分通通过过碱碱水水萃萃取取，皂皂苷苷类类成成分分通通过过大大孔孔树树脂脂吸附；苦参中的总生物碱通过阳离子树脂吸附与解吸附。吸附；苦参中的总生物碱通过阳离子树脂吸附与解吸附。中中间间体体是是原原药药材材经经过过了了多多步步处处理理而而得得，已已经经滤滤过过了了大大部部分分成成分分，只只保保留留一一小小 部部分分有有效效组组分分，样样品品制制备备时时，可可针针对对有有效效成成分分处处理理，并并参参照照原原药药材材的的制制备备方方法。法

54、。 样样品品富富集集后后，尚尚需需过过氧氧化化铝铝预预柱柱、C18预预柱柱、硅硅胶胶预预柱柱、聚聚酰酰胺胺预预柱柱等等，以除去色素等杂质，避免干扰或对色谱柱的损耗。以除去色素等杂质，避免干扰或对色谱柱的损耗。 注注射射液液中中除除少少数数品品种种添添加加助助溶溶剂剂外外，所所含含化化学学成成分分均均具具有有较较好好的的水水溶溶解解性性能能，面面且且研研究究生生产产工工艺艺时时考考虑虑到到色色素素、生生物物大大分分子子等等因因素素，生生产产过过程程中中已已通过微孔滤膜、脱色等操作，因此，样品无需特殊处理，可直接分析检测。通过微孔滤膜、脱色等操作，因此，样品无需特殊处理，可直接分析检测。3.4 色

55、谱条件选择色谱条件选择 指纹图谱的色谱条件是研究检测方法过程中最重要、关键性的内容。指纹图谱的色谱条件是研究检测方法过程中最重要、关键性的内容。 我们以我们以HPLC法为例，阐述各影响因素及解决途径。法为例，阐述各影响因素及解决途径。3.4.1 流动相流动相 可可用用作作流流动动相相的的溶溶剂剂有有：乙乙腈腈、甲甲醇醇、乙乙醇醇、四四氢氢呋呋喃喃、氯氯仿仿、二二氯氯甲甲烷烷、正正已已烷烷等等。反反相相高高效效液液相相，以以乙乙腈腈-水水系系统统比比较较适适合合梯梯度度洗洗脱脱。醇醇-水系统由于热力学和可压缩性因素，在梯度洗脱时易导致基线漂移。水系统由于热力学和可压缩性因素，在梯度洗脱时易导致基

56、线漂移。 在在流流动动相相中中可可加加入入磷磷酸酸、乙乙酸酸、三三乙乙胺胺、二二乙乙胺胺、正正丁丁基基溴溴化化胺胺、十十二二烷烷基基磺磺酸酸钠钠等等各各种种改改性性剂剂，或或采采用用磷磷酸酸-磷磷酸酸氢氢二二钠钠/磷磷酸酸二二氢氢钠钠、乙乙酸酸-乙酸钠缓冲溶液，以达到改善色谱峰分离程度及改善峰形的目的。乙酸钠缓冲溶液，以达到改善色谱峰分离程度及改善峰形的目的。样样品品中中如如有有部部分分成成分分的的极极性性较较小小，在在流流动动相相中中可可加加入入少少量量异异丙丙醇醇、四四氢氢呋呋喃喃、氯氯仿仿、环环糊糊精精等等，增增加加流流动动相相对对样样品品的的溶溶解解性性，一一方方面面改改善善峰峰形形，

57、另另一方面可快速洗脱。一方面可快速洗脱。对对黄黄酮酮类类、酚酚酸酸类类成成分分可可参参考考选选择择乙乙膊膊-水水-酸酸系系统统的的流流动动相相；对对皂皂苷苷类类成成分分可可参参考考选选择择乙乙腈腈-水水系系统统的的流流动动相相，生生物物碱碱类类成成分分可可参参考考选选择择乙乙腈腈-水水-三三乙胺等系统的流动相。乙胺等系统的流动相。3.4.2 检测波长检测波长选择有以下方法：选择有以下方法：参照样品的全波长紫外线吸收图，选择吸收峰值；参照样品的全波长紫外线吸收图，选择吸收峰值；参照对照品的全波长紫外线吸收图，选择吸收峰值；参照对照品的全波长紫外线吸收图，选择吸收峰值；根根据据君君、臣臣、佐佐、使

58、使的的组组方方理理论论，在在尽尽可可能能兼兼顾顾佐佐使使药药的的同同时，主要选择君、臣药中有效成妥的及收峰值。时，主要选择君、臣药中有效成妥的及收峰值。一个检测波长下的色谱图如不能达到控制质量的目的，可建立一个检测波长下的色谱图如不能达到控制质量的目的，可建立多个检测波长下的指纹图谱。多个检测波长下的指纹图谱。 3.4.3 柱温柱温 柱柱温温的的选选择择与与恒恒定定是是影影响响指指纹纹图图谱谱技技术术稳稳定定的的主主要要因因素素之之一一。适适宜宜的的柱柱温温不不仅仅影影响响色色谱谱峰峰的的分分离离效效果果，而而且且柱柱温温发发生生变变化化将将导导致致色色谱谱峰峰保保留留时时间间的的迁迁移移，技

59、技术参数的设置就失去了意义，因此，柱温必须限定。术参数的设置就失去了意义，因此，柱温必须限定。 当当色色谱谱图图某某个个色色谱谱峰峰因因溶溶解解度度差差而而峰峰形形较较“钝钝”时时，可可适适当当提提高高柱柱温温（3050）；如如样样品品中中组组分分在在常常温温或或高高温温下下不不稳稳定定，易易发发生生水水解解、分分解解等等变变化化时时，可可降降低低柱温。柱温。3.4.4 色谱柱色谱柱 不不同同厂厂家家的的色色谱谱柱柱由由于于采采用用的的填填料料不不同同，柱柱效效相相差差较较大大。即即使使流流动动相相条条件件一一致致，用用不不同同填填料料的的色色谱谱柱柱重重复复测测试试时时，不不仅仅分离效果大不

60、相同，而且保留时间的迁移程度也比较明显。分离效果大不相同，而且保留时间的迁移程度也比较明显。可可供供选选择择的的色色谱谱柱柱填填料料型型号号：Zorbax、Polaris、Kromasil、MataSil、Nucleosil。 由由于于中中药药样样品品的的复复杂杂性性，一一方方面面所所含含成成分分极极性性高高低低不不等等，另另一一方方面面部部分分成成分分结结构构相相似似，极极性性相相差差不不大大，分分离离比比较较困困难难，因因此此选选择择色色谱谱柱柱时时应应以以主主要要成成分分得得到到分分离离为为目目的的，柱柱效效不不易易过过高。高。 同同时时要要考考虑虑填填料料的的稳稳定定性性和和载载样样量

61、量。指指纹纹图图谱谱一一般般选选用用510mC18填填料料柱柱，以以4。6mm*250mm较较适适宜宜，其其它它特特殊殊的的色色谱谱柱柱，如如氨氨基基柱柱、腈腈基基柱柱、酸酸性性柱柱、碱碱性性柱柱等等，可可视视研研究究对对象的不同而采用。象的不同而采用。3.4.5 进样量进样量 进进样样量量对对指指纹纹图图谱谱的的结结果果影影响响不不大大，但但加加大大进进样样量量，可可以以减减弱弱梯梯度度洗洗脱脱时时基基线线漂漂移移的的程程度度；然然而而色色谱谱柱柱的的载载样样量量有有一一定定的的限限度度，进进样样量量过过大大，色色谱谱柱柱超超载载，导导致致色色谱谱峰峰峰峰宽宽增增加加或或色色谱谱峰峰尖尖钝钝

62、化化，并并影影响响柱柱的的寿寿命命。研研究究发发现现，进进样样量量应应控控制制最最高高色色谱谱峰峰的的吸吸收收值值在在1000mAU以以下下适适合合。当当等等度度洗洗脱脱时时，基基线线平平稳稳，进进样样量量较较平平稳稳，进进样样量量应应尽尽量量减减少少，一一般般控控制制最最高高色色谱谱峰峰的的吸吸收收值值在在100mAU左左右右，不不宜宜超超过过500mAU。3.4.6 色谱条件的优化色谱条件的优化 当当一一个个指指纹纹图图谱谱初初步步建建立立后后，尚尚需需进进一一步步优优化化。首首先先应应选选择择不不同同操操作作者者、不不同同型型号号的的仪仪器器进进行行测测试试；其次应在其它实验室、研究单位

63、进行测试。其次应在其它实验室、研究单位进行测试。 国国外外一一个个成成熟熟的的指指纹纹图图谱谱在在形形成成法法规规之之前前，选选择择世世界界各各地地有有名名的的检检测测机机构构（分分布布于于公公司司、医医院院、大大学学等等的的独独立立分分析析检检测测室室）进进行行复复核核，以以保保证证所所建建立立的的指指纹图谱技术稳定、可靠。纹图谱技术稳定、可靠。3.5 指纹特征选择指纹特征选择 指指纹纹图图谱谱一一量量建建立立，按按照照中中药药注注射射剂剂指指纹纹图图谱谱研研究究的的技技术术要要求求（暂暂行行）规规定定，除除提提供供指指纹纹图图谱谱外外，还还应应说说明明相相应应的的技技术术参参数数。但但大大

64、量量的的相相对对保保留留时时间间、共共有有峰峰峰峰面面积积比比值值等等技技术术参参数数，不不能能直直观观地地用用来来鉴鉴定定、判判别。别。 通通过过大大样样本本的的指指纹纹图图谱谱的的挖挖掘掘，找找出出隐隐藏藏其其中中的的指指纹纹特特征征，是是指指纹纹图图谱研究的直接目的。谱研究的直接目的。 如如：欧欧美美植植物物药药领领域域普普遍遍采采用用以以人人参参皂皂苷苷Rg1和和人人参参皂皂苷苷Re的的峰峰面面积积作作为为鉴鉴别别中中国国人人参参、朝朝鲜鲜人人参参、越越南南人人参参、西西洋洋参参及及三三七七参参的的特特征征参参数数；淫淫羊羊藿藿中中的的“五五指指峰峰”是是中中国国药药典典收收载载品品种

65、种Epimedium breuvicornum Maxim。的的典典型型特特征征，根根据据“五五指指峰峰”特特征征区区色色谱谱峰峰的的组组成成及及相相互互间间峰峰面面积积的的比比值值，可可定定性性鉴鉴别别、定定量量分分析析不不同同产产地地、不不同同提提取取工工艺艺及及不不同同品品种种的的淫羊藿。淫羊藿。 指指纹纹图图谱谱研研究究的的建建立立、分分析析、比比较较、评评价价和和校校验验应应逐逐渐渐形形成成规规范范并并取取得得共共识识。指指纹纹图图谱谱的的研研究究应应结结合合当当前前的的实实际际情情况况，同同时时结结合合生生产产工工艺艺的的筛筛选选及及药药效效和和临临床床观观察察，当当前前阶阶段段宜

66、宜简简不不宜宜繁繁、宜宜易易不不宜宜难难，基基本本保保证证产产品品质量的基本稳定和一致质量的基本稳定和一致.第四章第四章 中药色谱指纹图谱的建立与评价中药色谱指纹图谱的建立与评价 按按技技术术要要求求分分析析/抽抽检检成成品品，并并与与对对照照色色谱谱指指纹纹图图谱谱及及技技术术参参数数比比较较，判判别别检检测测产产品品是是否否合合格格，是是实实施施中药指纹图谱的最终目的。中药指纹图谱的最终目的。 实实现现中中药药指指纹纹国国库库券券谱谱技技术术革革新新，除除了了研研究究中中药药色色谱谱指指纹纹图图谱谱，还还包包括括对对照照指指纹纹图图谱谱及及其其技技术术参参数数的的建立与指纹图谱评价等过程。

67、建立与指纹图谱评价等过程。 4. 1 对照指纹图谱的建立与指纹图谱评价对照指纹图谱的建立与指纹图谱评价 目目前前对对中中药药材材、中中间间体体及及成成品品（主主要要为为注注射射剂剂）的的指指纹纹图图谱谱研研究究大大多多采采用用图图谱谱法法，经经分分析析检检测测得得到到了了大大量量的的色色谱谱数数据据。按按中中药药注注射射剂剂指指纹纹图图谱谱研研究究的的技技术术要要求求（暂暂行行），需需对对以以上色谱数据进行处理，才能得到指纹图谱技术参数。上色谱数据进行处理，才能得到指纹图谱技术参数。 如：相对保留时间、峰面积比值、相对标准偏差等。如：相对保留时间、峰面积比值、相对标准偏差等。 目目前前多多采采

68、用用人人工工手手动动计计算算的的方方法法或或借借助助于于Microsoft Excell等等应应用用软软件件计计算算这这些些参参数数，繁繁琐琐，易易出出差差错错，计计算算操操作作的过程了也不规范。现在已对计算公式及计算过程要求规范。的过程了也不规范。现在已对计算公式及计算过程要求规范。4.1.1 有关技术参数的计算公式有关技术参数的计算公式（1）相对保留时间）相对保留时间RRT RT（i） RT（S）RT（i）各色谱峰的保留时间各色谱峰的保留时间RT（i）为各色谱峰的保留时间为各色谱峰的保留时间（2）积分相对比值）积分相对比值RA A（i） RA= A（s）A（i）为各色谱峰积分面积；为各色谱

69、峰积分面积； A（s）为参考峰积分面积。为参考峰积分面积。 R RRTRT（i i）= =（3）相对标准偏差）相对标准偏差RSD% （ Xi X ）2n - 1n - 1RSD%= XXi为样品相应参数；为样品相应参数；X为均值；为均值；n为样品数量（个）为样品数量（个）。4.1.2 中药色谱对照指纹图谱的建立与中药色谱指纹图中药色谱对照指纹图谱的建立与中药色谱指纹图谱评价的原则谱评价的原则 中药指纹图谱及技术参数一旦建立，就可以作为中药指纹图谱及技术参数一旦建立，就可以作为“标准标准”或或“对照对照”/“参照参照”，所起作用如同对照药材，样品的色谱图，所起作用如同对照药材，样品的色谱图谱可与

70、对照指纹图谱进行比较。在对照指纹图谱建立及与中药谱可与对照指纹图谱进行比较。在对照指纹图谱建立及与中药指纹图谱评价过程中须综合考虑以下原则。指纹图谱评价过程中须综合考虑以下原则。4.1.2.1 整体性整体性 对照指纹图谱的建与评价应注意指纹特征的整体性。对照指纹图谱的建与评价应注意指纹特征的整体性。 一一个个品品种种的的对对照照指指纹纹图图谱谱是是由由各各个个具具有有指指纹纹意意义义的的峰峰组组成成的的完完整整图图谱谱构构成成的的，各各个个有有指指纹纹意意义义的的峰峰（或或薄薄层层色色谱谱的的斑斑点点）其其位位置置（保保留留时时间间或或比比移移值值）、大大小小或或高高你你（积积分分面面积积或或

71、峰峰高高）、各各峰峰之之间间相相对对的的比比例例是是指指纹纹图图谱谱的的综综合合参参数数，建建立立和和评评价价时时从从整整体体的的角角度度综综合合考考虑虑，注注意意各各有有指指纹纹意意义义的的峰峰相相互互的的依依存存关关系。系。 中药色谱指纹图谱在一定程度上与临床疗效的稳定性及用中药色谱指纹图谱在一定程度上与临床疗效的稳定性及用药安全性方面有相关性，因此对照指纹图谱中所有色谱峰在样药安全性方面有相关性，因此对照指纹图谱中所有色谱峰在样品指纹图谱中均应体现且可追溯。只有在对照指纹图谱中所有品指纹图谱中均应体现且可追溯。只有在对照指纹图谱中所有色谱峰的稳定体现，才是保证产品真正稳定可控的前提。为保

72、色谱峰的稳定体现，才是保证产品真正稳定可控的前提。为保证色谱指纹图谱在整体上相似，在建立对照指纹图谱时：证色谱指纹图谱在整体上相似，在建立对照指纹图谱时：应应尽尽可可能能包包含含所所有有具具有有指指纹纹意意义义的的特特征征峰峰，尤尤其其是是含含量量少少面面指纹意义显著的色谱峰、指纹特征区、共有特征区；指纹意义显著的色谱峰、指纹特征区、共有特征区；排排除除溶溶剂剂峰峰及及其其他他可可以以追追溯溯的的杂杂质质峰峰，供供试试品品的的制制备备应应与与工工业生产相似，并尽可能采用流动相来溶解。业生产相似，并尽可能采用流动相来溶解。通过比较指纹图谱在整体上的相似，楞以判断出样品的真实性。通过比较指纹图谱在

73、整体上的相似，楞以判断出样品的真实性。4.1.2.2 模糊性模糊性 在实际过程中由于受到各种因素的影响，样品指纹图谱中在实际过程中由于受到各种因素的影响，样品指纹图谱中有可能出现个别色谱峰的增加有可能出现个别色谱峰的增加/减少，色谱峰图谱行为可能发生减少，色谱峰图谱行为可能发生改变，如峰形、峰宽、峰高发生变化及保留时间发生偏移等，改变，如峰形、峰宽、峰高发生变化及保留时间发生偏移等，不可机械性地通过色谱图的叠加来评价反指纹色谱图和相似。不可机械性地通过色谱图的叠加来评价反指纹色谱图和相似。 增加增加/减少的色谱峰对指纹图谱整体相似的贡献，不是单纯减少的色谱峰对指纹图谱整体相似的贡献，不是单纯性

74、的降低，有可能出现相互消长的现象。对于难以把握的色谱性的降低，有可能出现相互消长的现象。对于难以把握的色谱峰，建议由软件去进行判别评价，尽可能避免人为判别评价。峰，建议由软件去进行判别评价，尽可能避免人为判别评价。 4.2 对照指纹图谱的建立方法对照指纹图谱的建立方法4.2.1 典型指纹图谱的建立模式典型指纹图谱的建立模式4.2.1 .1典型指纹图谱选择法典型指纹图谱选择法 通过一组或一系列样品的指纹图谱研究，从中选择一个具通过一组或一系列样品的指纹图谱研究，从中选择一个具有典型意义或有代表性的指纹图谱作为对照指纹图谱。有典型意义或有代表性的指纹图谱作为对照指纹图谱。 当样品间指纹特征相近时，

75、该方法较好。但所选择的典型当样品间指纹特征相近时，该方法较好。但所选择的典型指纹图谱只包含单个样品的特征，选择旱过程可能出现随意指纹图谱只包含单个样品的特征，选择旱过程可能出现随意性。当样品间指纹特征差异较大时，典型指纹图谱的选择就性。当样品间指纹特征差异较大时，典型指纹图谱的选择就很困难。很困难。4.2.1.2 共有模式生成法共有模式生成法 通通过过对对一一批批色色谱谱指指纹纹图图谱谱的的研研究究，模模拟拟出出对对照照指指纹纹图图谱谱或生成对照指纹图谱数据，即共有模式生成法。或生成对照指纹图谱数据，即共有模式生成法。 由由于于共共有有模模式式生生成成法法综综合合了了所所有有样样品品的的指指纹

76、纹图图谱谱信信息息，因此因此建议使用共有模式生成法建议使用共有模式生成法。 4.3指纹图谱评价方法指纹图谱评价方法 指纹图谱相似性的评价从两个方面考虑：指纹图谱相似性的评价从两个方面考虑： （1） 色色谱谱的的整整体体“面面貌貌”，即即有有指指纹纹意意义义的的峰峰的的数数目目、峰峰的的位位置置和和顺顺序序、各各峰峰之之间间的的大大致致比比例例（薄薄层层色色谱谱还还有有斑斑点点的颜色）等是否相似，以判断样品的真实性。的颜色）等是否相似，以判断样品的真实性。 （2） 以以样样品品与与对对照照样样品品或或“标标准准图图谱谱”之之间间或或不不同同批批次次样样品品指指纹纹图图谱谱之之间间总总积积分分值值

77、作作量量化化比比较较。如如总总积积分分面面积积相相差差较较大大（如如+20%），则则说说明明同同样样量量的的样样品品含含有有的的内内在在物物质质上上有有明明显显差差异异，这这种种差差异异是是否否允允许许，应应视视具具体体品品种种、具具体体工工艺艺的的实际情况，并结合含量测定项目综合判断。实际情况，并结合含量测定项目综合判断。能能 比比较较应应在在同同一一台台仪仪器器平平行行进进行行测测定定，评评价价的的结结果果可可能能陈陈致致误误判判或或不不同同评评价价者者得得到到不不同同的的评评价价结结果果，建建议议通通过过计计算算机机辅助指纹图谱相似度评价软件来进行。辅助指纹图谱相似度评价软件来进行。4.

78、3.1 评价指标评价指标 采用相似度作为指纹图谱评价的指标。采用相似度作为指纹图谱评价的指标。4.3.1 引用变量引用变量 根根据据中中药药注注射射剂剂指指纹纹图图谱谱研研究究的的技技术术要要求求（暂暂行行）之之规规定定，与与中中药药指指纹纹图图谱谱有有关关的的技技术术参参数数如如下下：保保留留时时间间（RT）；峰峰高高（height）；峰峰面面积积（area）；峰峰面面积积比比（A%）；相相对对保保留留时时间间（RRT）；积积分分面面积积相相对对比比值值（RA）。）。 相相对对保保留留时时间间（RRT）和和积积分分面面积积相相对对比比值值（RA）是是中中药药指指纹图谱的两个核心参数，可作为指

79、纹相似度评价的重要变量。纹图谱的两个核心参数，可作为指纹相似度评价的重要变量。 参参照照国国外外实实验验室室的的做做法法，现现选选择择积积分分面面积积相相对对比比值值（RA）作为计算指纹图谱相似度的变量。作为计算指纹图谱相似度的变量。 4.3.3 数据获取途径数据获取途径 将将中中药药色色谱谱指指纹纹图图通通过过扫扫描描仪仪等等设设备备，即即可可将将图形图形/图像转化成图像转化成ASCII数据。数据。 从从色色谱谱软软件件中中均均可可采采集集到到截截片片数数据据，即即时时间间与与电信号响应值。电信号响应值。 从从色色谱谱软软件件中中均均可可直直接接读读取取色色谱谱数数据据（如如保保留留时间、峰面积等）。时间、峰面积等）。 4.3.4 相似度算法相似度算法 （1） 相关系数算法相关系数算法 （2） 夹角余弦算法。夹角余弦算法。 重要文件：重要文件： （1） 关关于于印印发发中中药药注注射射剂剂指指纹纹图图谱谱研研究的技术要求（暂行）的通知究的技术要求（暂行）的通知 （2） 中中药药注注射射剂剂指指纹纹图图谱谱研研究究的的技技术术要求（暂行）要求（暂行） （3） 中中药药注注射射剂剂指指纹纹图图谱谱实实验验研研究究技技术指南（试行）术指南（试行）