《固体平板转化法检测细菌质粒DNA的水平转移现象》由会员分享，可在线阅读，更多相关《固体平板转化法检测细菌质粒DNA的水平转移现象（9页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、固体固体平板转化法检测平板转化法检测细菌细菌质粒质粒DNADNA的水平转移现象的水平转移现象实验目的实验目的1、了解细菌水平基因转移的主要途径、基本原理；、了解细菌水平基因转移的主要途径、基本原理；2、学习大肠杆菌固体平板转化实验的基本方法。、学习大肠杆菌固体平板转化实验的基本方法。 许多细菌可以建立自然感受态，能从环境中许多细菌可以建立自然感受态，能从环境中摄取摄取DNA改变自身遗传结构，获得新的表型。改变自身遗传结构，获得新的表型。细菌转化是水平基因转移的重要途径之一。细菌转化是水平基因转移的重要途径之一。Dubnau, Annu Rev Microbiol, 1999 53:217-44
2、大肠杆菌氯化钙平板转化方法大肠杆菌氯化钙平板转化方法 1、菌种活化：挑取大肠杆菌单菌落接种于、菌种活化：挑取大肠杆菌单菌落接种于 5 mL LB培养基中，培养基中，37振荡培养过夜；振荡培养过夜； 2、菌液准备、菌液准备 （1）按）按1/100转接量，转接于转接量，转接于50 mL新鲜新鲜LB培养基中，培养基中，37振荡培养至振荡培养至OD600 = 0.50.55（3 h 左右）。左右）。 （2）按）按3 mL分装到无菌试管中，置冰浴。分装到无菌试管中，置冰浴。 3、转化选择平板准备、转化选择平板准备 先摇匀融化好的先摇匀融化好的150 mL的的LB，在，在 5060时，加入时，加入150
3、L 100 mg/mL的氨苄青霉素（终浓的氨苄青霉素（终浓度度100 g/mL），混匀，倒），混匀，倒 9块平板（每组块平板（每组4块）；块）； 置置45预热；预热； 4 4、感受态制备及转化（按、感受态制备及转化（按4 4人小组进行）人小组进行）（1）用移液器取）用移液器取1 mL菌液于菌液于1.5 mL 微量离心管微量离心管中，每小组取中，每小组取2支；支；冰浴冷却冰浴冷却510 min； 冰浴很重要！已冰浴的菌液可适当缩短冷却冰浴很重要！已冰浴的菌液可适当缩短冷却时间。时间。（2）12 000 r/min离心离心30 s，弃上清，用移液器吸，弃上清，用移液器吸去残液，保留菌体沉淀；去残液
4、，保留菌体沉淀；（3）每支微量离心管中各加入）每支微量离心管中各加入50 L 新鲜新鲜LB培培养基，重悬细胞；养基，重悬细胞；4 4、感受态制备及转化（按、感受态制备及转化（按4 4人小组进行）人小组进行）（4）合并两支管中的菌悬液，取）合并两支管中的菌悬液，取80 L菌悬液加入菌悬液加入装有装有1 L pDsRED质粒（质粒（620 ng/ L ）微量离心管）微量离心管(500 L )中，混匀，中，混匀，冰浴冰浴510 min ；等体积加入室等体积加入室温氯化钙溶液温氯化钙溶液；冰浴；冰浴510 min ；（5）分别取）分别取20、40、80 L转化混合物涂布于转化混合物涂布于45预热预热的
5、选择平板；的选择平板；（6）步骤（）步骤（4）剩余的）剩余的20 L菌悬液直接涂布于选菌悬液直接涂布于选择平板，作为阴性对照；择平板，作为阴性对照；（7）37倒置培养倒置培养20 h后计算转化频率。后计算转化频率。1 mL1 mL菌液菌液 X2X2冰浴冰浴12 000 r/min12 000 r/min离心离心30 s30 s50 50 L LB*2L LB*2重悬细胞重悬细胞注意平衡！注意平衡！吸弃上清吸弃上清 保留沉淀保留沉淀合并菌悬液合并菌悬液80 80 L L加入到质粒管加入到质粒管20 20 L L细胞悬液细胞悬液冰浴冰浴5 10 min加入等体积氯化钙溶液加入等体积氯化钙溶液冰浴冰浴5 10 min涂布预热的氨涂布预热的氨苄选择平板苄选择平板分别取分别取20、40、80 L20 L结果与分析根根据据平平板板上上转转化化子子数数与与平平板板内内转转化化混混合合物物涂涂布布量量计计算算转转化化频频率率或或效效率率（菌菌浓浓度度按按2 2101010 10 CFU/mLCFU/mL计计 ）；）；转化频率转化频率 = 转化子数转化子数 / 活菌总数活菌总数转化效率转化效率 = 转化子数转化子数 / g转化转化DNA思考题思考题 将将“剩剩余余的的20 20 L L菌菌悬悬液液直直接接涂涂布布于于选选择择平板平板”作为对照的目的是什么？作为对照的目的是什么？
