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1、第四章第四章 酶的分离纯化酶的分离纯化1 1、酶分离纯化的原因（、酶分离纯化的原因（3 3条）条）2 2、酶分离纯化鉴定的依据蛋白质的物理化、酶分离纯化鉴定的依据蛋白质的物理化学特性（学特性（9 9条）条）内内 容容1 1 1 1、酶的提取与分离纯化技术路线、酶的提取与分离纯化技术路线、酶的提取与分离纯化技术路线、酶的提取与分离纯化技术路线2 2 2 2、细胞破碎、细胞破碎、细胞破碎、细胞破碎3 3 3 3、酶的提取、酶的提取、酶的提取、酶的提取4 4 4 4、酶的分离方法、酶的分离方法、酶的分离方法、酶的分离方法5 5 5 5、酶的组合分离纯化策略、酶的组合分离纯化策略、酶的组合分离纯化策略
2、、酶的组合分离纯化策略6 6 6 6、酶的浓缩、干燥与结晶酶的浓缩、干燥与结晶酶的浓缩、干燥与结晶酶的浓缩、干燥与结晶细胞结构与酶分布3.1 3.1 酶的提取、分离纯化技术路线酶的提取、分离纯化技术路线细胞破碎细胞破碎酶提取酶提取酶分离纯化酶分离纯化酶浓缩酶浓缩酶贮存酶贮存动物、植物或微生物细胞动物、植物或微生物细胞发酵液发酵液离心，过滤、沉离心，过滤、沉淀、层析分离、淀、层析分离、电泳、萃取、结电泳、萃取、结晶等分离方法晶等分离方法酶酶的的纯纯化化过过程，程，约约可分可分为为三三个阶段个阶段：(1) (1) 粗粗蛋白质蛋白质 (crude (crude protein): protein):
3、 采样采样 均均质质打破打破细细胞胞 抽出全蛋白，抽出全蛋白，多使用多使用 盐盐析析沉淀沉淀法；可以法；可以粗略去除蛋白粗略去除蛋白质质以外的物以外的物质质。(2) (2) 部分部分纯纯化化 (partially (partially purified): purified): 初步的初步的纯纯化，化，使用各使用各钟钟 柱柱层层析法。析法。(3) (3) 均均质酶质酶 (homogeneous): (homogeneous): 目标酶目标酶的的进进一步精制一步精制纯纯化，可用化，可用制制备备式式电泳电泳 或或 HPLC HPLC。酶分离纯化不同阶段3.2 细胞破碎细胞破碎许多酶存在于细胞许多酶
4、存在于细胞内。为了提取这些内。为了提取这些胞内酶，首先需要胞内酶，首先需要对细胞进行破碎处对细胞进行破碎处理。理。1）机械破碎）机械破碎2）物理破碎）物理破碎3）化学破碎）化学破碎4）酶解破碎）酶解破碎JY92-II D超声波超声波细细胞粉碎机胞粉碎机细细胞胞破破碎碎珠珠高高压压细细胞胞破破碎碎机机DY89-I型型 电动电动玻璃匀玻璃匀浆浆机机机械破碎机械破碎捣碎法捣碎法研磨法研磨法匀浆法匀浆法 物理破碎物理破碎温度差破碎法温度差破碎法压力差破碎法压力差破碎法超声波破碎法超声波破碎法 化学破碎化学破碎有机溶剂：有机溶剂：甲苯、丙酮甲苯、丙酮丁醇、氯仿丁醇、氯仿表面活性剂：表面活性剂：Trito
5、n、Tween酶促破碎酶促破碎自溶法自溶法外加酶制剂法外加酶制剂法通过机械运动产生的通过机械运动产生的剪切力，使组织、细剪切力，使组织、细胞破碎胞破碎。通过各种物理因素的通过各种物理因素的作用，使组织、细胞作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而的外层结构破坏，而使细胞破碎使细胞破碎。通过各种化学试剂对通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞膜的作用，而使细胞破碎细胞破碎通过细胞本身的酶系或通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎坏，而达到细胞破碎细胞破碎方法及其原理胞破碎方法及其原理n n酶的提取是指在一定的条件下，
6、用适当的溶剂或酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂或酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂或酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。也称为酶的抽提。中的过程。也称为酶的抽提。中的过程。也称为酶的抽提。中的过程。也称为酶的抽提。n n酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂适当
7、的溶剂适当的溶剂适当的溶剂。一般说来，极性物质易溶于极性溶。一般说来，极性物质易溶于极性溶。一般说来，极性物质易溶于极性溶。一般说来，极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中，剂中，非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中，剂中，非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中，剂中，非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中。性溶剂中。性溶剂中。性溶剂中。n n酶都能溶解于水，酶都能溶解于水，酶都能溶解于水，酶都能溶解于水，
8、通常可用水或稀酸、稀碱、稀通常可用水或稀酸、稀碱、稀通常可用水或稀酸、稀碱、稀通常可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取盐溶液等进行提取盐溶液等进行提取盐溶液等进行提取，有些酶与脂质结合或含有较，有些酶与脂质结合或含有较，有些酶与脂质结合或含有较，有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可用有机溶剂提取。多的非极性基团，则可用有机溶剂提取。多的非极性基团，则可用有机溶剂提取。多的非极性基团，则可用有机溶剂提取。 3.3 3.3 酶的提取酶的提取 提高温度，降低溶液粘度、增加扩散面积、縮短扩提高温度，降低溶液粘度、增加扩散面积、縮短扩提高温度，降低溶液粘度、增加扩散面积、縮短扩提高温度，降低溶
9、液粘度、增加扩散面积、縮短扩散距离，增大浓度差等都有利于提高酶分子的扩散距离，增大浓度差等都有利于提高酶分子的扩散距离，增大浓度差等都有利于提高酶分子的扩散距离，增大浓度差等都有利于提高酶分子的扩散速度，从而增大提取效果。散速度，从而增大提取效果。散速度，从而增大提取效果。散速度，从而增大提取效果。为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活，在提取为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活，在提取为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活，在提取为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活，在提取过程中还要注意控制好过程中还要注意控制好过程中还要注意控制好过程中还要注意控制好温度温度温度温度、pHpHpHpH值等提取条
10、件值等提取条件值等提取条件值等提取条件。为了使蛋白质充分溶解并保持蛋白质的结构为了使蛋白质充分溶解并保持蛋白质的结构与活性，蛋白质提取缓冲液常包含的成分与活性，蛋白质提取缓冲液常包含的成分控制溶液控制溶液控制溶液控制溶液pHpHpHpH值的缓冲对；值的缓冲对；值的缓冲对；值的缓冲对；控制溶液离子强度的无机盐；控制溶液离子强度的无机盐；控制溶液离子强度的无机盐；控制溶液离子强度的无机盐；控制溶液氧化还原状态的还原剂；控制溶液氧化还原状态的还原剂；控制溶液氧化还原状态的还原剂；控制溶液氧化还原状态的还原剂；蛋白酶抑制剂蛋白酶抑制剂蛋白酶抑制剂蛋白酶抑制剂离子螯合剂离子螯合剂离子螯合剂离子螯合剂标准
11、牛血清白蛋白标准牛血清白蛋白标准牛血清白蛋白标准牛血清白蛋白去污剂去污剂去污剂去污剂水和防腐剂水和防腐剂水和防腐剂水和防腐剂甘油甘油甘油甘油酶酶的主要提取方法的主要提取方法提取方法提取方法提取方法提取方法使用的溶使用的溶使用的溶使用的溶剂剂或溶或溶或溶或溶液液液液提取提取提取提取对对象象象象盐盐溶液提溶液提溶液提溶液提取取取取0.020.020.020.020.5mol/L0.5mol/L0.5mol/L0.5mol/L的的的的盐盐溶液溶液溶液溶液用于提取在低用于提取在低用于提取在低用于提取在低浓浓度度度度盐盐溶液溶液溶液溶液中溶解度中溶解度中溶解度中溶解度较较大的大的大的大的酶酶酶酶酸溶液提
12、酸溶液提酸溶液提酸溶液提取取取取PH2PH2PH2PH26 6 6 6的水溶液的水溶液的水溶液的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶用于提取在稀酸溶液中溶用于提取在稀酸溶液中溶用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且解度大，且解度大，且解度大，且稳稳定性定性定性定性较较好的好的好的好的酶酶酶酶碱溶液提碱溶液提碱溶液提碱溶液提取取取取PH8PH8PH8PH812121212的水溶液的水溶液的水溶液的水溶液用于提取在稀碱溶液中溶用于提取在稀碱溶液中溶用于提取在稀碱溶液中溶用于提取在稀碱溶液中溶解度大且解度大且解度大且解度大且稳稳定性定性定性定性较较好的好的好的好的酶酶酶酶有机溶有机溶有机溶有机溶剂剂提取提取提取提
13、取可与水混溶的有可与水混溶的有可与水混溶的有可与水混溶的有机溶机溶机溶机溶剂剂用于提取那些与脂用于提取那些与脂用于提取那些与脂用于提取那些与脂质结质结合合合合牢固或含有牢固或含有牢固或含有牢固或含有较较多非极性基多非极性基多非极性基多非极性基团团的的的的酶酶酶酶 大多数蛋白类酶都溶于水，而且在低浓度的盐存大多数蛋白类酶都溶于水，而且在低浓度的盐存大多数蛋白类酶都溶于水，而且在低浓度的盐存大多数蛋白类酶都溶于水，而且在低浓度的盐存在的条件下，酶的溶解度随盐浓度的升高而增加，在的条件下，酶的溶解度随盐浓度的升高而增加，在的条件下，酶的溶解度随盐浓度的升高而增加，在的条件下，酶的溶解度随盐浓度的升高
14、而增加，这称为这称为这称为这称为盐溶现象盐溶现象盐溶现象盐溶现象。3.4 酶的分离方法酶的分离方法1 1、沉淀分离、沉淀分离2 2、离心分离、离心分离3 3、过滤与膜分离、过滤与膜分离4 4、层析分离、层析分离5 5、电泳分离、电泳分离6 6、萃取分离、萃取分离1 1、沉淀分离、沉淀分离沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解度溶解度降低降低，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程。，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程。沉淀分离方法沉淀分离方法沉淀分离方法沉淀分离方法分离原理分离原理分离原理分离原理 盐盐析沉淀法析沉淀
15、法析沉淀法析沉淀法利用不同蛋白利用不同蛋白利用不同蛋白利用不同蛋白质质在不同的在不同的在不同的在不同的盐浓盐浓度条件下溶解度不同的特性，通度条件下溶解度不同的特性，通度条件下溶解度不同的特性，通度条件下溶解度不同的特性，通过过在在在在酶酶酶酶液中添加一定液中添加一定液中添加一定液中添加一定浓浓度的中性度的中性度的中性度的中性盐盐，使，使，使，使酶酶酶酶或或或或杂质杂质从溶液中析出从溶液中析出从溶液中析出从溶液中析出沉淀，从而使沉淀，从而使沉淀，从而使沉淀，从而使酶酶酶酶与与与与杂质杂质分离分离分离分离等等等等电电点沉淀法点沉淀法点沉淀法点沉淀法利用两性利用两性利用两性利用两性电电解解解解质质在
16、等在等在等在等电电点点点点时时溶解度最低，以及不同的两性溶解度最低，以及不同的两性溶解度最低，以及不同的两性溶解度最低，以及不同的两性电电解解解解质质有不同的等有不同的等有不同的等有不同的等电电点点点点这这一特性，通一特性，通一特性，通一特性，通过调节过调节溶液的溶液的溶液的溶液的pHpHpHpH值值，使，使，使，使酶酶酶酶或或或或杂杂质质沉淀析出，从而使沉淀析出，从而使沉淀析出，从而使沉淀析出，从而使酶酶酶酶与与与与杂质杂质分离分离分离分离有机溶有机溶有机溶有机溶剂剂沉淀法沉淀法沉淀法沉淀法利用利用利用利用酶酶酶酶与其它与其它与其它与其它杂质杂质在有机溶在有机溶在有机溶在有机溶剂剂中的溶解度
17、不同，通中的溶解度不同，通中的溶解度不同，通中的溶解度不同，通过过添加一定添加一定添加一定添加一定量的某种有机溶量的某种有机溶量的某种有机溶量的某种有机溶剂剂，使，使，使，使酶酶酶酶或或或或杂质杂质沉淀析出，从而使沉淀析出，从而使沉淀析出，从而使沉淀析出，从而使酶酶酶酶与与与与杂质杂质分分分分离离离离复合沉淀法复合沉淀法复合沉淀法复合沉淀法在在在在酶酶酶酶液中加入某些物液中加入某些物液中加入某些物液中加入某些物质质，使它与，使它与，使它与，使它与酶酶酶酶形成复合物而沉淀下来，从形成复合物而沉淀下来，从形成复合物而沉淀下来，从形成复合物而沉淀下来，从而使而使而使而使酶酶酶酶与与与与杂质杂质分离分
18、离分离分离选择选择性性性性变变性沉淀性沉淀性沉淀性沉淀法法法法选择选择一定的条件使一定的条件使一定的条件使一定的条件使酶酶酶酶液中存在的某些液中存在的某些液中存在的某些液中存在的某些杂质变杂质变性沉淀，而不影响性沉淀，而不影响性沉淀，而不影响性沉淀，而不影响所需的所需的所需的所需的酶酶酶酶，从而使，从而使，从而使，从而使酶酶酶酶与与与与杂质杂质分离分离分离分离在盐浓度达到某在盐浓度达到某一界限后，酶的一界限后，酶的溶解度随盐浓度溶解度随盐浓度升高而降低，这升高而降低，这称为称为盐析盐析现象。现象。盐析的主要原理盐析的主要原理在于高浓度盐离在于高浓度盐离子与蛋白质争夺子与蛋白质争夺水化水，破坏蛋
19、水化水，破坏蛋白质分子表面的白质分子表面的水化膜，同时由水化膜，同时由于反离子作用，于反离子作用，也影响蛋白质分也影响蛋白质分子所带电荷子所带电荷 在一定的温度和在一定的温度和在一定的温度和在一定的温度和pHpHpHpH值条件下（值条件下（值条件下（值条件下（为常数），通过为常数），通过为常数），通过为常数），通过改变离子强度使不同的酶或蛋白质分离的方法称改变离子强度使不同的酶或蛋白质分离的方法称改变离子强度使不同的酶或蛋白质分离的方法称改变离子强度使不同的酶或蛋白质分离的方法称为为为为KsKsKsKs分段盐析分段盐析分段盐析分段盐析； 而在一定的盐和离子强度的条件下（而在一定的盐和离子强度的
20、条件下（而在一定的盐和离子强度的条件下（而在一定的盐和离子强度的条件下（KsKsKsKsI I I I为常数）为常数）为常数）为常数），通过改变温度和，通过改变温度和，通过改变温度和，通过改变温度和pHpHpHpH值，使不同的酶或蛋白质分值，使不同的酶或蛋白质分值，使不同的酶或蛋白质分值，使不同的酶或蛋白质分离的方法，称为离的方法，称为离的方法，称为离的方法，称为分段盐析分段盐析分段盐析分段盐析公式公式公式公式 logS = logSlogS = logSlogS = logSlogS = logS0 0 0 0-KsI=-KsI=-KsI=-KsI=-KsI-KsI-KsI-KsI 在蛋白质
21、的盐析中，通常采用的中性盐有硫在蛋白质的盐析中，通常采用的中性盐有硫在蛋白质的盐析中，通常采用的中性盐有硫在蛋白质的盐析中，通常采用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸钠等。其中以硫酸铵最为常用。这是由于硫酸铵钠等。其中以硫酸铵最为常用。这是由于硫酸铵钠等。其中以硫酸铵最为常用。这是由于硫酸铵钠等。其中以硫酸铵最为常用。这是由于硫酸铵在水中的溶解度大而且温度系数小，不影响酶的在水中的溶解度大而且温度系数小，不影响酶的在水中的溶解度大而且温度系数小，不影
22、响酶的在水中的溶解度大而且温度系数小，不影响酶的活性，分离效果好，而且价廉易得。然而用硫酸活性，分离效果好，而且价廉易得。然而用硫酸活性，分离效果好，而且价廉易得。然而用硫酸活性，分离效果好，而且价廉易得。然而用硫酸铵进行盐析时，缓冲能力较差，而且铵离子的存铵进行盐析时，缓冲能力较差，而且铵离子的存铵进行盐析时，缓冲能力较差，而且铵离子的存铵进行盐析时，缓冲能力较差，而且铵离子的存在会干扰蛋白质的测定，所以有时也用其它中性在会干扰蛋白质的测定，所以有时也用其它中性在会干扰蛋白质的测定，所以有时也用其它中性在会干扰蛋白质的测定，所以有时也用其它中性盐进行盐析。盐进行盐析。盐进行盐析。盐进行盐析。
23、 在盐析时，溶液中硫酸铵的浓度通常以在盐析时，溶液中硫酸铵的浓度通常以在盐析时，溶液中硫酸铵的浓度通常以在盐析时，溶液中硫酸铵的浓度通常以饱和饱和饱和饱和度度度度表示（指溶液中加入的饱和硫酸铵的体积与混表示（指溶液中加入的饱和硫酸铵的体积与混表示（指溶液中加入的饱和硫酸铵的体积与混表示（指溶液中加入的饱和硫酸铵的体积与混合溶液总体积的比值）合溶液总体积的比值）合溶液总体积的比值）合溶液总体积的比值） 解读蛋白质工程解读蛋白质工程解读蛋白质工程解读蛋白质工程p204p204p204p204页表页表页表页表7 7 7 73 3 3 3 有机溶剂之所以能使酶沉淀析出。主要是由于有机有机溶剂之所以能使
24、酶沉淀析出。主要是由于有机有机溶剂之所以能使酶沉淀析出。主要是由于有机有机溶剂之所以能使酶沉淀析出。主要是由于有机溶剂的存在会使溶液的介电常数降低。例如，溶剂的存在会使溶液的介电常数降低。例如，溶剂的存在会使溶液的介电常数降低。例如，溶剂的存在会使溶液的介电常数降低。例如，20202020时水的介电常数为时水的介电常数为时水的介电常数为时水的介电常数为80808080，而，而，而，而82828282乙醇水溶液的乙醇水溶液的乙醇水溶液的乙醇水溶液的介电常数为介电常数为介电常数为介电常数为40404040。 溶液的介电常数降低，就使溶质分子间的静溶液的介电常数降低，就使溶质分子间的静溶液的介电常数
25、降低，就使溶质分子间的静溶液的介电常数降低，就使溶质分子间的静电引力增大，互相吸引而易于凝集，同时，对于电引力增大，互相吸引而易于凝集，同时，对于电引力增大，互相吸引而易于凝集，同时，对于电引力增大，互相吸引而易于凝集，同时，对于具有水膜的分子来说，有机溶剂与水互相作用，具有水膜的分子来说，有机溶剂与水互相作用，具有水膜的分子来说，有机溶剂与水互相作用，具有水膜的分子来说，有机溶剂与水互相作用，使溶质分子表面的水膜破坏，也使其溶解度降低使溶质分子表面的水膜破坏，也使其溶解度降低使溶质分子表面的水膜破坏，也使其溶解度降低使溶质分子表面的水膜破坏，也使其溶解度降低而沉淀析出而沉淀析出而沉淀析出而沉
26、淀析出。 常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等酮、异丙醇、甲醇等酮、异丙醇、甲醇等酮、异丙醇、甲醇等2 2、离心分离、离心分离 离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力，离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力，离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力，离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、不同密度的物质分离的技术过程。使不同大小、不同密度的物质分离的技术过程。使不同大小、不同密度的物质分离的技术过程。使不同大小、不同密度的物质分离的技术过程。
27、在离心分离时，要根据欲分离物质以及杂质在离心分离时，要根据欲分离物质以及杂质在离心分离时，要根据欲分离物质以及杂质在离心分离时，要根据欲分离物质以及杂质的的的的颗粒大小颗粒大小颗粒大小颗粒大小、密度和特性的不同密度和特性的不同密度和特性的不同密度和特性的不同，选择适当的离，选择适当的离，选择适当的离，选择适当的离心机、离心方法和离心条件。心机、离心方法和离心条件。心机、离心方法和离心条件。心机、离心方法和离心条件。 常速离心机又称为低速离心机常速离心机又称为低速离心机常速离心机又称为低速离心机常速离心机又称为低速离心机, , , , 其最大转速其最大转速其最大转速其最大转速在在在在8000 r
28、/min8000 r/min8000 r/min8000 r/min以内，相对离心力（以内，相对离心力（以内，相对离心力（以内，相对离心力（RCFRCFRCFRCF）在）在）在）在1104 1104 1104 1104 g g g g 以下，在酶的分离纯化过程中，主要用于细胞、以下，在酶的分离纯化过程中，主要用于细胞、以下，在酶的分离纯化过程中，主要用于细胞、以下，在酶的分离纯化过程中，主要用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等固形物的分离。也用于细胞碎片和培养基残渣等固形物的分离。也用于细胞碎片和培养基残渣等固形物的分离。也用于细胞碎片和培养基残渣等固形物的分离。也用于酶的结晶等较大颗粒的分离。酶
29、的结晶等较大颗粒的分离。酶的结晶等较大颗粒的分离。酶的结晶等较大颗粒的分离。高速离心机高速离心机高速离心机高速离心机的最大转速为（的最大转速为（的最大转速为（的最大转速为（1 1 1 12.52.52.52.5）104 r/min 104 r/min 104 r/min 104 r/min ，相对离心力达到，相对离心力达到，相对离心力达到，相对离心力达到 1104 1104 1104 11041105 g 1105 g 1105 g 1105 g ，在酶的，在酶的，在酶的，在酶的分离中主要用于沉淀、细胞碎片和细胞器等的分分离中主要用于沉淀、细胞碎片和细胞器等的分分离中主要用于沉淀、细胞碎片和细
30、胞器等的分分离中主要用于沉淀、细胞碎片和细胞器等的分离。离。离。离。有些高速离心机装设有冷冻装置有些高速离心机装设有冷冻装置有些高速离心机装设有冷冻装置有些高速离心机装设有冷冻装置, , , ,谓之高速冷谓之高速冷谓之高速冷谓之高速冷冻离心机冻离心机冻离心机冻离心机超速离心机超速离心机超速离心机超速离心机的最大转速达的最大转速达的最大转速达的最大转速达 (2.5 (2.5 (2.5 (2.512)104 r/min12)104 r/min12)104 r/min12)104 r/min，相对离心力可以高达相对离心力可以高达相对离心力可以高达相对离心力可以高达 5105 g 5105 g 510
31、5 g 5105 g甚至更高。超速离甚至更高。超速离甚至更高。超速离甚至更高。超速离心主要用于心主要用于心主要用于心主要用于DNADNADNADNA、RNARNARNARNA、蛋白质等生物大分子以及、蛋白质等生物大分子以及、蛋白质等生物大分子以及、蛋白质等生物大分子以及细胞器、病毒等的分离纯化；样品纯度的检测；细胞器、病毒等的分离纯化；样品纯度的检测；细胞器、病毒等的分离纯化；样品纯度的检测；细胞器、病毒等的分离纯化；样品纯度的检测；沉降系数和相对分子质量的测定等。沉降系数和相对分子质量的测定等。沉降系数和相对分子质量的测定等。沉降系数和相对分子质量的测定等。超速离心有三种：超速离心有三种：超
32、速离心有三种：超速离心有三种：差速离心差速离心差速离心差速离心：采用不同的离心速度和离心时间，使不：采用不同的离心速度和离心时间，使不：采用不同的离心速度和离心时间，使不：采用不同的离心速度和离心时间，使不同沉降速度的颗粒分批分离的方法同沉降速度的颗粒分批分离的方法同沉降速度的颗粒分批分离的方法同沉降速度的颗粒分批分离的方法密度梯度离心：密度梯度离心：密度梯度离心：密度梯度离心：使沉降系数比较接近的物质得以分使沉降系数比较接近的物质得以分使沉降系数比较接近的物质得以分使沉降系数比较接近的物质得以分离的一种区带分离方法。必须预先配制好适宜的离的一种区带分离方法。必须预先配制好适宜的离的一种区带分
33、离方法。必须预先配制好适宜的离的一种区带分离方法。必须预先配制好适宜的密度梯度系统离心前将样品小心地铺放在预先制密度梯度系统离心前将样品小心地铺放在预先制密度梯度系统离心前将样品小心地铺放在预先制密度梯度系统离心前将样品小心地铺放在预先制备好的密度梯度溶液的表面。（密度相近，分子备好的密度梯度溶液的表面。（密度相近，分子备好的密度梯度溶液的表面。（密度相近，分子备好的密度梯度溶液的表面。（密度相近，分子量不同）梯度较浅，密度较低量不同）梯度较浅，密度较低量不同）梯度较浅，密度较低量不同）梯度较浅，密度较低等密度梯度离心：等密度梯度离心：等密度梯度离心：等密度梯度离心：分离密度不同的颗粒，欲分离
34、颗分离密度不同的颗粒，欲分离颗分离密度不同的颗粒，欲分离颗分离密度不同的颗粒，欲分离颗粒处于密度梯度中的等密度点（平衡）才可停止粒处于密度梯度中的等密度点（平衡）才可停止粒处于密度梯度中的等密度点（平衡）才可停止粒处于密度梯度中的等密度点（平衡）才可停止离心，操作时先把一定浓度的介质溶液与样品液离心，操作时先把一定浓度的介质溶液与样品液离心，操作时先把一定浓度的介质溶液与样品液离心，操作时先把一定浓度的介质溶液与样品液混合均匀混合均匀混合均匀混合均匀。（密度不同，分子量相近）梯度陡峭，。（密度不同，分子量相近）梯度陡峭，。（密度不同，分子量相近）梯度陡峭，。（密度不同，分子量相近）梯度陡峭，密
35、度较高密度较高密度较高密度较高n n密度梯度离心前用密度梯度混合器预先配制密度密度梯度离心前用密度梯度混合器预先配制密度密度梯度离心前用密度梯度混合器预先配制密度密度梯度离心前用密度梯度混合器预先配制密度梯度系统，贮液室与混合室的截面积关系决定梯梯度系统，贮液室与混合室的截面积关系决定梯梯度系统，贮液室与混合室的截面积关系决定梯梯度系统，贮液室与混合室的截面积关系决定梯度类型。度类型。度类型。度类型。n n配制中，配制中，配制中，配制中，将稀溶液置于贮液室将稀溶液置于贮液室将稀溶液置于贮液室将稀溶液置于贮液室B B，浓溶液置于混合，浓溶液置于混合，浓溶液置于混合，浓溶液置于混合室室室室A, A
36、, 如图如图如图如图4-2(4-2(郭勇酶工程郭勇酶工程郭勇酶工程郭勇酶工程p96p96） 流出的梯度液经流出的梯度液经流出的梯度液经流出的梯度液经过导管小心收集于离心管过导管小心收集于离心管过导管小心收集于离心管过导管小心收集于离心管，如果浓溶液置于贮液如果浓溶液置于贮液如果浓溶液置于贮液如果浓溶液置于贮液室室室室B B ，稀溶液置于，稀溶液置于，稀溶液置于，稀溶液置于 A A室，梯度液的导液管必须直室，梯度液的导液管必须直室，梯度液的导液管必须直室，梯度液的导液管必须直插到离心管的管底插到离心管的管底插到离心管的管底插到离心管的管底，让后来流入的浓度高的混合，让后来流入的浓度高的混合，让后
37、来流入的浓度高的混合，让后来流入的浓度高的混合液将先流入的浓度较低的混合液顶浮起来形成由液将先流入的浓度较低的混合液顶浮起来形成由液将先流入的浓度较低的混合液顶浮起来形成由液将先流入的浓度较低的混合液顶浮起来形成由管口到管底逐步升高的密度梯度管口到管底逐步升高的密度梯度管口到管底逐步升高的密度梯度管口到管底逐步升高的密度梯度 超速离心机按照其用途可以分为制备用超速超速离心机按照其用途可以分为制备用超速超速离心机按照其用途可以分为制备用超速超速离心机按照其用途可以分为制备用超速离心机、分析用超速离心机和分析离心机、分析用超速离心机和分析离心机、分析用超速离心机和分析离心机、分析用超速离心机和分析
38、- - - -制备两用超速制备两用超速制备两用超速制备两用超速离心机离心机离心机离心机3 3 3 3种种种种 n n 蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质分子在离心時，其分子在离心時，其分子在离心時，其分子在离心時，其 分子量、分子密度、分子量、分子密度、分子量、分子密度、分子量、分子密度、组成、形状组成、形状组成、形状组成、形状 等，均会影响其沉降速率，等，均会影响其沉降速率，等，均会影响其沉降速率，等，均会影响其沉降速率，沉降系数沉降系数沉降系数沉降系数 即用来描述此沉降性质；即用来描述此沉降性质；即用来描述此沉降性质；即用来描述此沉降性质； 其单位为其单位为其单位为其单位为 S S S S (Sve
39、dberg (Svedberg (Svedberg (Svedberg unit)unit)unit)unit)。n n 每一种的沉降系数与其分子密度或分子量成每一种的沉降系数与其分子密度或分子量成每一种的沉降系数与其分子密度或分子量成每一种的沉降系数与其分子密度或分子量成正比。正比。正比。正比。 不同沉降系数的蛋白质，可利用超高速离不同沉降系数的蛋白质，可利用超高速离不同沉降系数的蛋白质，可利用超高速离不同沉降系数的蛋白质，可利用超高速离心法，在密度梯度中作分离。心法，在密度梯度中作分离。心法，在密度梯度中作分离。心法，在密度梯度中作分离。3 3、过滤与膜分离、过滤与膜分离过滤是借助于过滤是
40、借助于过滤介质过滤介质将不同大小、不同形状将不同大小、不同形状的物质分离的技术过程的物质分离的技术过程。过滤介质多种多样，常用的有滤纸、滤布、纤维、过滤介质多种多样，常用的有滤纸、滤布、纤维、多孔陶瓷、烧结金属和各种高分子膜等，可以根多孔陶瓷、烧结金属和各种高分子膜等，可以根据需要选用。据需要选用。过滤过滤非膜过滤：采用高分子膜以外的物质作非膜过滤：采用高分子膜以外的物质作为过滤介质为过滤介质 膜过滤：采用各种高分子膜为过膜过滤：采用各种高分子膜为过滤介质滤介质 过滤的分的分类及其特性及其特性( (根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同 ) ) 类别类别截留截留截
41、留截留颗颗粒大粒大粒大粒大小小小小截留的主要物截留的主要物截留的主要物截留的主要物质质过滤过滤介介介介质质粗粗粗粗滤滤 2m 2m 2m 2m酵母、霉菌、酵母、霉菌、酵母、霉菌、酵母、霉菌、动动物物物物细细胞、植物胞、植物胞、植物胞、植物细细胞、固形胞、固形胞、固形胞、固形物等物等物等物等滤纸滤纸、滤滤布、布、布、布、纤纤维维多孔陶瓷、多孔陶瓷、多孔陶瓷、多孔陶瓷、烧烧结结金属等金属等金属等金属等微微微微滤滤0.20.20.20.22m2m2m2m细细菌、灰菌、灰菌、灰菌、灰尘尘等等等等微微微微滤滤膜、微孔陶膜、微孔陶膜、微孔陶膜、微孔陶瓷瓷瓷瓷超超超超滤滤202020200.2m0.2m0.
42、2m0.2m病毒、生物大分子等病毒、生物大分子等病毒、生物大分子等病毒、生物大分子等超超超超滤滤膜膜膜膜反渗反渗反渗反渗透透透透 20 20 2020 (40,000) 压力差，压力差，100kPa100kPa 筛分筛分 超滤超滤UF 120 (10,000-40,000) 压力差压力差100kPa100kPa 筛分筛分 纳滤纳滤NF 1 1 (100(1001000)1000) 压力差，压力差，100) 压力差，压力差，1000kPa 优先吸附、优先吸附、溶解扩散溶解扩散 四种常用膜分离技术的基本特征四种常用膜分离技术的基本特征 四种常用膜分离四种常用膜分离过程的截留特性程的截留特性4 4、
43、层析分离、层析分离层析技术，亦称色谱技术，是一种物理的分层析技术，亦称色谱技术，是一种物理的分离方法离方法。它是利用混合物中各组分的物理化它是利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两个相中，其中一个相为固定的两个相中，其中一个相为固定的( (称为固定称为固定相相) )，另一个相则流过此固定相，另一个相则流过此固定相( (称为流动相称为流动相) )并使各组分以不同速度移动，从而达到分并使各组分以不同速度移动，从而达到分离离。 层层析方法析方法析方法析方法分离依据分离依据分离依据分离依据吸附吸附吸附吸附层层析析析析利用吸附利用吸附利用
44、吸附利用吸附剂对剂对不同物不同物不同物不同物质质的吸附力不同而使混的吸附力不同而使混的吸附力不同而使混的吸附力不同而使混合物中各合物中各合物中各合物中各组组分分离（分子表面特性）分分离（分子表面特性）分分离（分子表面特性）分分离（分子表面特性）分配分配分配分配层层析析析析利用各利用各利用各利用各组组分在两相中的分配系数不同，而使分在两相中的分配系数不同，而使分在两相中的分配系数不同，而使分在两相中的分配系数不同，而使各各各各组组分分离（溶解度）分分离（溶解度）分分离（溶解度）分分离（溶解度）离子交离子交离子交离子交换层换层析析析析利用离子交利用离子交利用离子交利用离子交换剂换剂上的可解离基上的
45、可解离基上的可解离基上的可解离基团团（活性基（活性基（活性基（活性基团团）对对各种离子的各种离子的各种离子的各种离子的亲亲和力不同而达到分离目的和力不同而达到分离目的和力不同而达到分离目的和力不同而达到分离目的（带电带电性性性性质质）凝胶凝胶凝胶凝胶层层析析析析以各种多孔凝胶以各种多孔凝胶以各种多孔凝胶以各种多孔凝胶为为固定相，利用流固定相，利用流固定相，利用流固定相，利用流动动相中所相中所相中所相中所含各种含各种含各种含各种组组分的相分的相分的相分的相对对分子分子分子分子质质量不同而达到物量不同而达到物量不同而达到物量不同而达到物质质分离（分子大小）分离（分子大小）分离（分子大小）分离（分子
46、大小）亲亲和和和和层层析析析析利用生物分子与配基之利用生物分子与配基之利用生物分子与配基之利用生物分子与配基之间间所具有的所具有的所具有的所具有的专专一而又一而又一而又一而又可逆的可逆的可逆的可逆的亲亲和力，使生物分子分离和力，使生物分子分离和力，使生物分子分离和力，使生物分子分离纯纯化（分子化（分子化（分子化（分子形状）形状）形状）形状）层层析聚焦析聚焦析聚焦析聚焦将将将将酶酶酶酶等两性物等两性物等两性物等两性物质质的等的等的等的等电电点特性与离子交点特性与离子交点特性与离子交点特性与离子交换层换层析的特性析的特性析的特性析的特性结结合在一起，合在一起，合在一起，合在一起，实现组实现组分分离
47、分分离分分离分分离吸附层析吸附层析 吸附层析是利用吸附剂对不同物质的吸附吸附层析是利用吸附剂对不同物质的吸附吸附层析是利用吸附剂对不同物质的吸附吸附层析是利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中各组分分离的方法力不同而使混合物中各组分分离的方法力不同而使混合物中各组分分离的方法力不同而使混合物中各组分分离的方法吸附层析通常采用柱型装置，将吸附剂装在吸吸附层析通常采用柱型装置，将吸附剂装在吸吸附层析通常采用柱型装置，将吸附剂装在吸吸附层析通常采用柱型装置，将吸附剂装在吸附柱中，装置成附柱中，装置成附柱中，装置成附柱中，装置成吸附层析柱吸附层析柱吸附层析柱吸附层析柱。层析时，欲分离的混合溶液自
48、柱顶加入，当样层析时，欲分离的混合溶液自柱顶加入，当样层析时，欲分离的混合溶液自柱顶加入，当样层析时，欲分离的混合溶液自柱顶加入，当样品液全部进入吸附层析柱后，再加入洗脱剂解品液全部进入吸附层析柱后，再加入洗脱剂解品液全部进入吸附层析柱后，再加入洗脱剂解品液全部进入吸附层析柱后，再加入洗脱剂解吸洗脱。吸洗脱。吸洗脱。吸洗脱。在洗脱时，层析柱内不断发生解吸、吸附、再在洗脱时，层析柱内不断发生解吸、吸附、再在洗脱时，层析柱内不断发生解吸、吸附、再在洗脱时，层析柱内不断发生解吸、吸附、再解吸、再吸附的过程解吸、再吸附的过程解吸、再吸附的过程解吸、再吸附的过程。 n n溶剂洗脱法溶剂洗脱法溶剂洗脱法溶
49、剂洗脱法采用单一或混合的溶剂进行洗脱，采用单一或混合的溶剂进行洗脱，采用单一或混合的溶剂进行洗脱，采用单一或混合的溶剂进行洗脱，各组分按照由弱到强的顺序先后流出，以洗脱液各组分按照由弱到强的顺序先后流出，以洗脱液各组分按照由弱到强的顺序先后流出，以洗脱液各组分按照由弱到强的顺序先后流出，以洗脱液对组分浓度作图呈峰状，两组分之间有一空白。对组分浓度作图呈峰状，两组分之间有一空白。对组分浓度作图呈峰状，两组分之间有一空白。对组分浓度作图呈峰状，两组分之间有一空白。若两峰重叠或拖尾现象出现，可采用按一定规律若两峰重叠或拖尾现象出现，可采用按一定规律若两峰重叠或拖尾现象出现，可采用按一定规律若两峰重叠
50、或拖尾现象出现，可采用按一定规律变化的变化的变化的变化的pHpHpHpH梯度或浓度梯度洗脱梯度或浓度梯度洗脱梯度或浓度梯度洗脱梯度或浓度梯度洗脱n n置换洗脱法置换洗脱法置换洗脱法置换洗脱法置换洗脱液中有一吸附力比被吸附置换洗脱液中有一吸附力比被吸附置换洗脱液中有一吸附力比被吸附置换洗脱液中有一吸附力比被吸附组分更强的物质取代被吸附成分，后者按照吸附组分更强的物质取代被吸附成分，后者按照吸附组分更强的物质取代被吸附成分，后者按照吸附组分更强的物质取代被吸附成分，后者按照吸附力由弱到强的顺序流出，以洗脱液对组分浓度作力由弱到强的顺序流出，以洗脱液对组分浓度作力由弱到强的顺序流出，以洗脱液对组分浓
51、度作力由弱到强的顺序流出，以洗脱液对组分浓度作图，可得到阶梯式的洗脱曲线图，可得到阶梯式的洗脱曲线图，可得到阶梯式的洗脱曲线图，可得到阶梯式的洗脱曲线n n前缘洗脱法前缘洗脱法前缘洗脱法前缘洗脱法用含有各组分的混合溶液本身作洗用含有各组分的混合溶液本身作洗用含有各组分的混合溶液本身作洗用含有各组分的混合溶液本身作洗脱液，连续加入吸附层析柱，吸附剂饱和时吸附脱液，连续加入吸附层析柱，吸附剂饱和时吸附脱液，连续加入吸附层析柱，吸附剂饱和时吸附脱液，连续加入吸附层析柱，吸附剂饱和时吸附力最弱的组分开始最先流出。其洗脱曲线虽然也力最弱的组分开始最先流出。其洗脱曲线虽然也力最弱的组分开始最先流出。其洗脱
52、曲线虽然也力最弱的组分开始最先流出。其洗脱曲线虽然也呈阶梯型，但只有吸附力最弱的组分得以和其它呈阶梯型，但只有吸附力最弱的组分得以和其它呈阶梯型，但只有吸附力最弱的组分得以和其它呈阶梯型，但只有吸附力最弱的组分得以和其它组分分离，仅用于分析前缘组分分析组分分离，仅用于分析前缘组分分析组分分离，仅用于分析前缘组分分析组分分离，仅用于分析前缘组分分析分配层析分配层析定义：分配层析是利用各组分在两相中的分配系数定义：分配层析是利用各组分在两相中的分配系数定义：分配层析是利用各组分在两相中的分配系数定义：分配层析是利用各组分在两相中的分配系数不同，而使各组分分离的方法不同，而使各组分分离的方法不同，而
53、使各组分分离的方法不同，而使各组分分离的方法分配系数分配系数分配系数分配系数：是指一种溶质在两种互不相溶的溶剂中：是指一种溶质在两种互不相溶的溶剂中：是指一种溶质在两种互不相溶的溶剂中：是指一种溶质在两种互不相溶的溶剂中溶解达到平衡时，该溶质在两相溶剂中的浓度的溶解达到平衡时，该溶质在两相溶剂中的浓度的溶解达到平衡时，该溶质在两相溶剂中的浓度的溶解达到平衡时，该溶质在两相溶剂中的浓度的比值。在层析条件确定后，层析系数是一常数比值。在层析条件确定后，层析系数是一常数比值。在层析条件确定后，层析系数是一常数比值。在层析条件确定后，层析系数是一常数 在分配层析中，通常采用一种多孔性固体支在分配层析中
54、，通常采用一种多孔性固体支持物（如滤纸、硅藻土、纤维素等）吸着持物（如滤纸、硅藻土、纤维素等）吸着一种溶剂为一种溶剂为固定相固定相，这种溶剂在层析过程，这种溶剂在层析过程中始终固定在多孔支持物上。另一种与固中始终固定在多孔支持物上。另一种与固定相溶剂互不相溶的溶剂可沿着固定相流定相溶剂互不相溶的溶剂可沿着固定相流动，称为动，称为流动相流动相。当某溶质在流动相的带。当某溶质在流动相的带动下流经固定相时，该溶质在两相之间进动下流经固定相时，该溶质在两相之间进行连续的动态分配行连续的动态分配按固定相的介质分按固定相的介质分 纸上层析纸上层析纸上层析纸上层析 分配薄层层析分配薄层层析分配薄层层析分配薄
55、层层析 分配气相层析分配气相层析分配气相层析分配气相层析分配层析按固定相的极性不同分为分配层析按固定相的极性不同分为 正相分配层析正相分配层析正相分配层析正相分配层析（极性溶剂为固定相）（极性溶剂为固定相）（极性溶剂为固定相）（极性溶剂为固定相） 反相分配层析反相分配层析反相分配层析反相分配层析（非极性有机溶剂为固定相）（非极性有机溶剂为固定相）（非极性有机溶剂为固定相）（非极性有机溶剂为固定相）离子层析离子层析离子交换层析离子交换层析离子交换层析离子交换层析是利用离子交换剂上的是利用离子交换剂上的是利用离子交换剂上的是利用离子交换剂上的可解离基团可解离基团可解离基团可解离基团（活性基团）（活
56、性基团）（活性基团）（活性基团）对各种离子的亲和力不同而达到分对各种离子的亲和力不同而达到分对各种离子的亲和力不同而达到分对各种离子的亲和力不同而达到分离离离离目的的一种层析分离方法。目的的一种层析分离方法。目的的一种层析分离方法。目的的一种层析分离方法。离子交换剂离子交换剂离子交换剂离子交换剂是含有若干活性基团的不溶性高分子物是含有若干活性基团的不溶性高分子物是含有若干活性基团的不溶性高分子物是含有若干活性基团的不溶性高分子物质。通过在不溶性高分子物质（母体）上引入若质。通过在不溶性高分子物质（母体）上引入若质。通过在不溶性高分子物质（母体）上引入若质。通过在不溶性高分子物质（母体）上引入若
57、干可解离基团（活性基团）而制成。干可解离基团（活性基团）而制成。干可解离基团（活性基团）而制成。干可解离基团（活性基团）而制成。离子交换层析介质由三部分组成：离子交换层析介质由三部分组成：离子交换层析介质由三部分组成：离子交换层析介质由三部分组成： 惰性支持物；带电基团；（带电基团的）平衡离惰性支持物；带电基团；（带电基团的）平衡离惰性支持物；带电基团；（带电基团的）平衡离惰性支持物；带电基团；（带电基团的）平衡离子子子子通常所说的离子交换实际上是通常所说的离子交换实际上是通常所说的离子交换实际上是通常所说的离子交换实际上是蛋白质分子与平衡离蛋白质分子与平衡离蛋白质分子与平衡离蛋白质分子与平衡
58、离子间相互交换子间相互交换子间相互交换子间相互交换，他们共同竞争离子交换层析介质，他们共同竞争离子交换层析介质，他们共同竞争离子交换层析介质，他们共同竞争离子交换层析介质中的带电基团中的带电基团中的带电基团中的带电基团 阳离子交换层析阳离子交换层析阳离子交换层析阳离子交换层析平衡离子为阳离子，层析介质平衡离子为阳离子，层析介质平衡离子为阳离子，层析介质平衡离子为阳离子，层析介质的带电基团带有负电的带电基团带有负电的带电基团带有负电的带电基团带有负电 阴离子交换层析阴离子交换层析阴离子交换层析阴离子交换层析平衡离子为阴离子，层析介质平衡离子为阴离子，层析介质平衡离子为阴离子，层析介质平衡离子为阴
59、离子，层析介质的带电基团带有正电的带电基团带有正电的带电基团带有正电的带电基团带有正电1 1、离子交换剂的离子交换剂的选择选择应根据欲分离应根据欲分离组分的特性和要求，组分的特性和要求，过强的吸附以及极过强的吸附以及极端的洗脱条件都可端的洗脱条件都可能造成活性分子的能造成活性分子的变性失活；另外溶变性失活；另外溶液的液的pHpH直接决定离直接决定离子交换剂活性基团子交换剂活性基团及组分离子的解离及组分离子的解离程度，从而影响了程度，从而影响了离子交换剂的交换离子交换剂的交换容量和交换的选择容量和交换的选择性性 选择离子交换剂时考虑因素：选择离子交换剂时考虑因素：选择离子交换剂时考虑因素：选择离
60、子交换剂时考虑因素： 1 1 1 1）离子交换剂和组分离子的物理化学性质；）离子交换剂和组分离子的物理化学性质；）离子交换剂和组分离子的物理化学性质；）离子交换剂和组分离子的物理化学性质； 2 2 2 2）组分离子所带电荷种类；）组分离子所带电荷种类；）组分离子所带电荷种类；）组分离子所带电荷种类； 3 3 3 3）溶液中组分离子的浓度高低；）溶液中组分离子的浓度高低；）溶液中组分离子的浓度高低；）溶液中组分离子的浓度高低； 4 4 4 4）组分离子的质量大小；）组分离子的质量大小；）组分离子的质量大小；）组分离子的质量大小； 5 5 5 5）组分离子与离子交换剂的亲和力大小）组分离子与离子交
61、换剂的亲和力大小）组分离子与离子交换剂的亲和力大小）组分离子与离子交换剂的亲和力大小2 2 2 2、离子交换剂的处理、离子交换剂的处理、离子交换剂的处理、离子交换剂的处理 1 1 1 1）溶胀、洗涤至澄清；）溶胀、洗涤至澄清；）溶胀、洗涤至澄清；）溶胀、洗涤至澄清； 2) 4V 2 mol/L HCl 2) 4V 2 mol/L HCl 2) 4V 2 mol/L HCl 2) 4V 2 mol/L HCl进行酸处理，洗涤；进行酸处理，洗涤；进行酸处理，洗涤；进行酸处理，洗涤； 3) 4V 2 mol/L NaOH 3) 4V 2 mol/L NaOH 3) 4V 2 mol/L NaOH 3
62、) 4V 2 mol/L NaOH进行碱处理，洗涤；进行碱处理，洗涤；进行碱处理，洗涤；进行碱处理，洗涤； 4 4 4 4）装柱）装柱）装柱）装柱 5 5 5 5）用适当的试剂进行转型处理，使离子交换剂上）用适当的试剂进行转型处理，使离子交换剂上）用适当的试剂进行转型处理，使离子交换剂上）用适当的试剂进行转型处理，使离子交换剂上所带的可交换离子转变为所需离子所带的可交换离子转变为所需离子所带的可交换离子转变为所需离子所带的可交换离子转变为所需离子例如，阳离子交换剂（如）用例如，阳离子交换剂（如）用例如，阳离子交换剂（如）用例如，阳离子交换剂（如）用NaOHNaOHNaOHNaOH处理，转变为处
63、理，转变为处理，转变为处理，转变为Na+Na+Na+Na+型，用型，用型，用型，用HClHClHClHCl处理，转变为处理，转变为处理，转变为处理，转变为H+H+H+H+型；型；型；型； 阴离子交换剂用阴离子交换剂用阴离子交换剂用阴离子交换剂用NaOHNaOHNaOHNaOH处理，转变为处理，转变为处理，转变为处理，转变为OH-OH-OH-OH-型，用型，用型，用型，用HClHClHClHCl处理转变为处理转变为处理转变为处理转变为Cl-Cl-Cl-Cl-型型型型 离子交换剂有离子交换树脂、纤维素、凝胶，某离子交换剂有离子交换树脂、纤维素、凝胶，某离子交换剂有离子交换树脂、纤维素、凝胶，某离子
64、交换剂有离子交换树脂、纤维素、凝胶，某些大孔径的离子交换树脂、纤维素、凝胶可用于些大孔径的离子交换树脂、纤维素、凝胶可用于些大孔径的离子交换树脂、纤维素、凝胶可用于些大孔径的离子交换树脂、纤维素、凝胶可用于酶的分离纯化。酶的分离纯化。酶的分离纯化。酶的分离纯化。离子交换层析介质吸附蛋白的量离子交换层析介质吸附蛋白的量离子交换层析介质吸附蛋白的量离子交换层析介质吸附蛋白的量很大很大很大很大，相比于分子筛层析，所用层析柱短而粗，相比于分子筛层析，所用层析柱短而粗，相比于分子筛层析，所用层析柱短而粗，相比于分子筛层析，所用层析柱短而粗 处理好的离子交换剂可以在交换槽中进行处理好的离子交换剂可以在交换
65、槽中进行处理好的离子交换剂可以在交换槽中进行处理好的离子交换剂可以在交换槽中进行分批离分批离分批离分批离子交换子交换子交换子交换，也可以将离子交换剂装进离子交换柱进，也可以将离子交换剂装进离子交换柱进，也可以将离子交换剂装进离子交换柱进，也可以将离子交换剂装进离子交换柱进行行行行连续离子交换连续离子交换连续离子交换连续离子交换离子层析分离过程离子层析分离过程离子层析分离过程离子层析分离过程包括包括包括包括1 1 1 1、装柱装柱装柱装柱：干法装柱和湿法装柱，装填成均匀、无气泡、：干法装柱和湿法装柱，装填成均匀、无气泡、：干法装柱和湿法装柱，装填成均匀、无气泡、：干法装柱和湿法装柱，装填成均匀、
66、无气泡、无裂缝的离子交换柱无裂缝的离子交换柱无裂缝的离子交换柱无裂缝的离子交换柱2 2 2 2、上柱上柱上柱上柱: : : : 转型后，用溶剂或缓冲液进行平衡，然后将转型后，用溶剂或缓冲液进行平衡，然后将转型后，用溶剂或缓冲液进行平衡，然后将转型后，用溶剂或缓冲液进行平衡，然后将欲分离的混合液加入离子交换柱中。上柱时混合液欲分离的混合液加入离子交换柱中。上柱时混合液欲分离的混合液加入离子交换柱中。上柱时混合液欲分离的混合液加入离子交换柱中。上柱时混合液中中中中盐离子浓度盐离子浓度盐离子浓度盐离子浓度不能过高、还要注意混合液的温度和不能过高、还要注意混合液的温度和不能过高、还要注意混合液的温度和
67、不能过高、还要注意混合液的温度和pHpHpHpH值上柱时要控制合适的流速值上柱时要控制合适的流速值上柱时要控制合适的流速值上柱时要控制合适的流速3 3 3 3、洗脱洗脱洗脱洗脱：洗脱液应当含有与离子交换剂的：洗脱液应当含有与离子交换剂的：洗脱液应当含有与离子交换剂的：洗脱液应当含有与离子交换剂的亲和力较大亲和力较大亲和力较大亲和力较大的离子，要通过试验确定的离子，要通过试验确定的离子，要通过试验确定的离子，要通过试验确定洗脱流速洗脱流速洗脱流速洗脱流速。洗脱过程中，。洗脱过程中，。洗脱过程中，。洗脱过程中，组分离子按照与交换剂亲和力由大到小的顺序先后组分离子按照与交换剂亲和力由大到小的顺序先后
68、组分离子按照与交换剂亲和力由大到小的顺序先后组分离子按照与交换剂亲和力由大到小的顺序先后洗出。洗出。洗出。洗出。 对多组分为达到良好的分离效果，对多组分为达到良好的分离效果，对多组分为达到良好的分离效果，对多组分为达到良好的分离效果，常用浓度梯常用浓度梯常用浓度梯常用浓度梯度或度或度或度或pHpHpHpH梯度洗脱法梯度洗脱法梯度洗脱法梯度洗脱法，每一种又可选用阶段梯度洗脱，每一种又可选用阶段梯度洗脱，每一种又可选用阶段梯度洗脱，每一种又可选用阶段梯度洗脱或连续梯度洗脱，后者分辨率更高。或连续梯度洗脱，后者分辨率更高。或连续梯度洗脱，后者分辨率更高。或连续梯度洗脱，后者分辨率更高。离子层析分离过
69、程离子层析分离过程包括包括4 4、收集收集收集收集：与离子层析柱亲和力最小的组分先流出，：与离子层析柱亲和力最小的组分先流出，：与离子层析柱亲和力最小的组分先流出，：与离子层析柱亲和力最小的组分先流出，通过紫外检测器检测从层析柱中流出液体在通过紫外检测器检测从层析柱中流出液体在通过紫外检测器检测从层析柱中流出液体在通过紫外检测器检测从层析柱中流出液体在280nm280nm的光吸收值，同时用部分收集器收集。以的光吸收值，同时用部分收集器收集。以的光吸收值，同时用部分收集器收集。以的光吸收值，同时用部分收集器收集。以洗脱体积为横坐标，以洗脱体积为横坐标，以洗脱体积为横坐标，以洗脱体积为横坐标，以2
70、80nm280nm的光吸收值为纵坐的光吸收值为纵坐的光吸收值为纵坐的光吸收值为纵坐标，绘制洗脱曲线。根据洗脱峰的位置，确定不标，绘制洗脱曲线。根据洗脱峰的位置，确定不标，绘制洗脱曲线。根据洗脱峰的位置，确定不标，绘制洗脱曲线。根据洗脱峰的位置，确定不同大小的蛋白质所在试管，进一步用电泳手段鉴同大小的蛋白质所在试管，进一步用电泳手段鉴同大小的蛋白质所在试管，进一步用电泳手段鉴同大小的蛋白质所在试管，进一步用电泳手段鉴定目标蛋白定目标蛋白定目标蛋白定目标蛋白5 5、交换剂再生：、交换剂再生：、交换剂再生：、交换剂再生： 酸碱酸处理酸碱酸处理酸碱酸处理酸碱酸处理 碱酸碱处理碱酸碱处理碱酸碱处理碱酸碱
71、处理凝胶层析凝胶层析 凝胶层析又称为凝胶层析又称为凝胶层析又称为凝胶层析又称为凝凝凝凝胶过滤胶过滤胶过滤胶过滤，分子排阻分子排阻分子排阻分子排阻层析层析层析层析，分子筛层析分子筛层析分子筛层析分子筛层析等。是指以各种多等。是指以各种多等。是指以各种多等。是指以各种多孔凝胶为固定相，孔凝胶为固定相，孔凝胶为固定相，孔凝胶为固定相，利用流动相中所含利用流动相中所含利用流动相中所含利用流动相中所含各种组分的相对分各种组分的相对分各种组分的相对分各种组分的相对分子质量不同而达到子质量不同而达到子质量不同而达到子质量不同而达到物质分离的一种层物质分离的一种层物质分离的一种层物质分离的一种层析技术析技术析
72、技术析技术凝胶层析的基本原理凝胶层析的基本原理凝胶层析柱中装有凝胶层析柱中装有多孔凝胶多孔凝胶，当含有各种组分的，当含有各种组分的混合溶液流经凝胶层析柱时，大分子物质由于分混合溶液流经凝胶层析柱时，大分子物质由于分子直径大，不能进入凝胶的微孔，只能分布于凝子直径大，不能进入凝胶的微孔，只能分布于凝胶颗粒的间隙中，以较快的速度流过凝胶柱。较胶颗粒的间隙中，以较快的速度流过凝胶柱。较小的分子能进入凝胶的微孔内，不断地进出于一小的分子能进入凝胶的微孔内，不断地进出于一个个颗粒的微孔内外，这就使个个颗粒的微孔内外，这就使小分子物质向下移小分子物质向下移动的速度比大分子的速度慢，动的速度比大分子的速度慢
73、，从而使混合溶液中从而使混合溶液中各组分按照各组分按照相对分子质量由大到小的顺序相对分子质量由大到小的顺序先后流先后流出层析柱出层析柱，而达到分离的目的而达到分离的目的为了定量地衡量混合液中各组分的流出顺序，常常为了定量地衡量混合液中各组分的流出顺序，常常为了定量地衡量混合液中各组分的流出顺序，常常为了定量地衡量混合液中各组分的流出顺序，常常采用采用采用采用分配系数分配系数分配系数分配系数KaKa来量度来量度来量度来量度 VeVe 洗脱体积，表示某一组分从加进层析柱到最高峰洗脱体积，表示某一组分从加进层析柱到最高峰洗脱体积，表示某一组分从加进层析柱到最高峰洗脱体积，表示某一组分从加进层析柱到最
74、高峰出现时，所需的洗脱液体积；出现时，所需的洗脱液体积；出现时，所需的洗脱液体积；出现时，所需的洗脱液体积；VoVo 外体积，即为层析柱内凝胶颗粒空隙之间的体积外体积，即为层析柱内凝胶颗粒空隙之间的体积外体积，即为层析柱内凝胶颗粒空隙之间的体积外体积，即为层析柱内凝胶颗粒空隙之间的体积V VI I 内体积，即为层析柱内凝胶颗粒内部微孔的体积内体积，即为层析柱内凝胶颗粒内部微孔的体积内体积，即为层析柱内凝胶颗粒内部微孔的体积内体积，即为层析柱内凝胶颗粒内部微孔的体积KaVe-V0VI如果某组分的分配系数如果某组分的分配系数如果某组分的分配系数如果某组分的分配系数Ka= 0Ka= 0，即，即，即，
75、即 Ve = VoVe = Vo，说明，说明，说明，说明该组分完全不能进入凝胶微孔，洗脱是最先流出；该组分完全不能进入凝胶微孔，洗脱是最先流出；该组分完全不能进入凝胶微孔，洗脱是最先流出；该组分完全不能进入凝胶微孔，洗脱是最先流出；如果某组分的分配系数如果某组分的分配系数如果某组分的分配系数如果某组分的分配系数Ka=1Ka=1，即，即，即，即 Ve = Vo + VVe = Vo + VI I，说明该组分可以自由地扩散进入到凝胶颗粒内部说明该组分可以自由地扩散进入到凝胶颗粒内部说明该组分可以自由地扩散进入到凝胶颗粒内部说明该组分可以自由地扩散进入到凝胶颗粒内部的所有微孔，洗脱是最后流出；的所有
76、微孔，洗脱是最后流出；的所有微孔，洗脱是最后流出；的所有微孔，洗脱是最后流出；如果某组分的分配系数如果某组分的分配系数如果某组分的分配系数如果某组分的分配系数KaKaKaKa在在在在0 0 0 01 1 1 1，说明该组分分，说明该组分分，说明该组分分，说明该组分分子大小介乎大分子和小分子之间，可以进入凝胶子大小介乎大分子和小分子之间，可以进入凝胶子大小介乎大分子和小分子之间，可以进入凝胶子大小介乎大分子和小分子之间，可以进入凝胶的微孔，但是扩散速度较慢，洗脱时按照的微孔，但是扩散速度较慢，洗脱时按照的微孔，但是扩散速度较慢，洗脱时按照的微孔，但是扩散速度较慢，洗脱时按照KaKaKaKa值由值
77、由值由值由小到大的顺序先后流出。小到大的顺序先后流出。小到大的顺序先后流出。小到大的顺序先后流出。 在凝胶对组分没有吸附作用情况下，且在凝胶对组分没有吸附作用情况下，且在凝胶对组分没有吸附作用情况下，且在凝胶对组分没有吸附作用情况下，且 Ve = Vo + Ve = Vo + VIVI，所有组分都应该被洗脱出来，所有组分都应该被洗脱出来，所有组分都应该被洗脱出来，所有组分都应该被洗脱出来，KaKa最大值为最大值为最大值为最大值为1 1当当当当KaKa大于大于大于大于1 1时，说明此层析不是单纯的凝胶层析，时，说明此层析不是单纯的凝胶层析，时，说明此层析不是单纯的凝胶层析，时，说明此层析不是单纯
78、的凝胶层析，还存在吸附层析或离子交换层析还存在吸附层析或离子交换层析还存在吸附层析或离子交换层析还存在吸附层析或离子交换层析对同一类型的化合物，凝胶层析的洗脱特性与组分对同一类型的化合物，凝胶层析的洗脱特性与组分对同一类型的化合物，凝胶层析的洗脱特性与组分对同一类型的化合物，凝胶层析的洗脱特性与组分的相对分子量呈函数关系，洗脱时组分按相对分子的相对分子量呈函数关系，洗脱时组分按相对分子的相对分子量呈函数关系，洗脱时组分按相对分子的相对分子量呈函数关系，洗脱时组分按相对分子质量由大到小的顺序先后流出。质量由大到小的顺序先后流出。质量由大到小的顺序先后流出。质量由大到小的顺序先后流出。Ve=K1-
79、K2 lgM在实际应用中，常以相在实际应用中，常以相对洗脱体积对洗脱体积Kav对对lgM作曲线作曲线，称为称为选择曲线选择曲线相对洗脱体积相对洗脱体积是指组分是指组分洗脱体积与层析柱内凝洗脱体积与层析柱内凝胶床总体积之比值胶床总体积之比值KavVe/VtlgMKav3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.001.00.5选择曲线的斜率说选择曲线的斜率说明凝胶的特性。每明凝胶的特性。每一类型化合物都有一类型化合物都有其各自特定的选择其各自特定的选择曲线。如此图所示，曲线。如此图所示，可以通过凝胶层析可以通过凝胶层析测定物质的相对分测定物质的相对分子质量子质量凝胶的选择与处理凝胶的选择与处理
80、常用的凝胶材料主要有常用的凝胶材料主要有常用的凝胶材料主要有常用的凝胶材料主要有葡聚糖凝胶、琼脂凝葡聚糖凝胶、琼脂凝葡聚糖凝胶、琼脂凝葡聚糖凝胶、琼脂凝胶与琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶胶与琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶胶与琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶胶与琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶，层析用的微，层析用的微，层析用的微，层析用的微孔凝胶是由凝胶材料与交联剂交联聚合而成，交孔凝胶是由凝胶材料与交联剂交联聚合而成，交孔凝胶是由凝胶材料与交联剂交联聚合而成，交孔凝胶是由凝胶材料与交联剂交联聚合而成，交联剂有环氧氯丙烷联剂有环氧氯丙烷联剂有环氧氯丙烷联剂有环氧氯丙烷 选择凝胶主要是依据欲分离组分的分子质量大选择凝
81、胶主要是依据欲分离组分的分子质量大选择凝胶主要是依据欲分离组分的分子质量大选择凝胶主要是依据欲分离组分的分子质量大小。凝胶颗粒直径大小对层析柱内溶液的流速有小。凝胶颗粒直径大小对层析柱内溶液的流速有小。凝胶颗粒直径大小对层析柱内溶液的流速有小。凝胶颗粒直径大小对层析柱内溶液的流速有一定影响，应选择大小比较均匀的商品凝胶，使一定影响，应选择大小比较均匀的商品凝胶，使一定影响，应选择大小比较均匀的商品凝胶，使一定影响，应选择大小比较均匀的商品凝胶，使用前需将凝胶于洗脱液中充分溶胀。溶胀通常采用前需将凝胶于洗脱液中充分溶胀。溶胀通常采用前需将凝胶于洗脱液中充分溶胀。溶胀通常采用前需将凝胶于洗脱液中充
82、分溶胀。溶胀通常采用热水溶胀（用热水溶胀（用热水溶胀（用热水溶胀（2 2 2 23 3 3 3小时），这样也达到消毒和排小时），这样也达到消毒和排小时），这样也达到消毒和排小时），这样也达到消毒和排出凝胶内气泡的目的出凝胶内气泡的目的出凝胶内气泡的目的出凝胶内气泡的目的 溶胀后凝胶用倾泻法除去小颗粒，经减压排溶胀后凝胶用倾泻法除去小颗粒，经减压排溶胀后凝胶用倾泻法除去小颗粒，经减压排溶胀后凝胶用倾泻法除去小颗粒，经减压排气即可装柱气即可装柱气即可装柱气即可装柱凝胶层析操作过程凝胶层析操作过程凝胶层析的操作一般包括装柱、上柱、洗脱等过程凝胶层析的操作一般包括装柱、上柱、洗脱等过程凝胶层析的操作一
83、般包括装柱、上柱、洗脱等过程凝胶层析的操作一般包括装柱、上柱、洗脱等过程装柱装柱装柱装柱：柱内先充满洗脱剂，然后一边搅拌一边缓慢：柱内先充满洗脱剂，然后一边搅拌一边缓慢：柱内先充满洗脱剂，然后一边搅拌一边缓慢：柱内先充满洗脱剂，然后一边搅拌一边缓慢而连续地加入浓稠的凝胶悬浮液，让其自然沉降，而连续地加入浓稠的凝胶悬浮液，让其自然沉降，而连续地加入浓稠的凝胶悬浮液，让其自然沉降，而连续地加入浓稠的凝胶悬浮液，让其自然沉降，分布均匀无气泡和裂缝，直至所需高度。装好后分布均匀无气泡和裂缝，直至所需高度。装好后分布均匀无气泡和裂缝，直至所需高度。装好后分布均匀无气泡和裂缝，直至所需高度。装好后洗脱液浸
84、没凝胶表面。洗脱液浸没凝胶表面。洗脱液浸没凝胶表面。洗脱液浸没凝胶表面。上柱上柱上柱上柱：在洗脱液的液面恰好与凝胶床的表面相平时：在洗脱液的液面恰好与凝胶床的表面相平时：在洗脱液的液面恰好与凝胶床的表面相平时：在洗脱液的液面恰好与凝胶床的表面相平时加入混合液。混合液体积通常为凝胶床体积的加入混合液。混合液体积通常为凝胶床体积的加入混合液。混合液体积通常为凝胶床体积的加入混合液。混合液体积通常为凝胶床体积的10%10%10%10%左右，浓度可高些，黏度应低。左右，浓度可高些，黏度应低。左右，浓度可高些，黏度应低。左右，浓度可高些，黏度应低。洗脱洗脱洗脱洗脱：洗脱液应与干燥凝胶溶胀时及装柱平衡时使
85、洗脱液应与干燥凝胶溶胀时及装柱平衡时使洗脱液应与干燥凝胶溶胀时及装柱平衡时使洗脱液应与干燥凝胶溶胀时及装柱平衡时使用的一致，用的一致，用的一致，用的一致，体积一般为凝胶床体积的体积一般为凝胶床体积的体积一般为凝胶床体积的体积一般为凝胶床体积的120%120%120%120%，洗脱，洗脱，洗脱，洗脱流出液分步收集。流出液分步收集。流出液分步收集。流出液分步收集。凝胶层析操作过程凝胶层析操作过程（详见蛋白质工程（详见蛋白质工程（详见蛋白质工程（详见蛋白质工程p213p213） 洗脱完毕后，凝胶柱已经恢复酶液上样前的洗脱完毕后，凝胶柱已经恢复酶液上样前的状态，状态，不需再生不需再生处理就可以重复进行
86、下一处理就可以重复进行下一批分离纯化。如果使用次数较多，或要纯批分离纯化。如果使用次数较多，或要纯化不同样品时，用化不同样品时，用2 23 3倍柱体积非离子去倍柱体积非离子去污剂除去吸附在凝胶中的杂质，或卸下凝污剂除去吸附在凝胶中的杂质，或卸下凝胶，用胶，用0.2mol/L NaOH0.2mol/L NaOH浸泡，再水洗。然后浸泡，再水洗。然后加入加入20%20%乙醇或乙醇或0.04% NaN30.04% NaN3在在4 488长期保长期保存存亲和层析亲和层析n n亲和层析是利用生物分子与配基之间所具有的亲和层析是利用生物分子与配基之间所具有的亲和层析是利用生物分子与配基之间所具有的亲和层析是
87、利用生物分子与配基之间所具有的专专专专一而又可逆一而又可逆一而又可逆一而又可逆的亲和力，而使生物分子分离纯化的的亲和力，而使生物分子分离纯化的的亲和力，而使生物分子分离纯化的的亲和力，而使生物分子分离纯化的技术技术技术技术。n n酶与底物、酶与竞争性抑制剂、酶与辅助因子、酶与底物、酶与竞争性抑制剂、酶与辅助因子、酶与底物、酶与竞争性抑制剂、酶与辅助因子、酶与底物、酶与竞争性抑制剂、酶与辅助因子、抗原与抗体、酶抗原与抗体、酶抗原与抗体、酶抗原与抗体、酶RNARNA与互补的与互补的与互补的与互补的RNARNA分子或片段、分子或片段、分子或片段、分子或片段、RNARNA与互补的与互补的与互补的与互补
88、的DNADNA分子或片段等之间分子或片段等之间分子或片段等之间分子或片段等之间，都是具有，都是具有，都是具有，都是具有专一而又可逆亲和力的生物分子对。故此专一而又可逆亲和力的生物分子对。故此专一而又可逆亲和力的生物分子对。故此专一而又可逆亲和力的生物分子对。故此, ,亲和层亲和层亲和层亲和层析在酶的分离纯化中有重要应用析在酶的分离纯化中有重要应用析在酶的分离纯化中有重要应用析在酶的分离纯化中有重要应用亲和层析技术的特点是亲和层析技术的特点是亲和层析技术的特点是亲和层析技术的特点是选择性很高选择性很高选择性很高选择性很高，可减少提纯可减少提纯可减少提纯可减少提纯步骤步骤步骤步骤 在亲和层析中在亲
89、和层析中在亲和层析中在亲和层析中, , , ,作为固定相的一方称为作为固定相的一方称为作为固定相的一方称为作为固定相的一方称为配基配基配基配基(Ligand)(Ligand)(Ligand)(Ligand)，配基必须偶联于不溶性母体配基必须偶联于不溶性母体配基必须偶联于不溶性母体配基必须偶联于不溶性母体(Matrix)(Matrix)(Matrix)(Matrix)上，母体又称为载体或担体。一般采用琼脂糖凝上，母体又称为载体或担体。一般采用琼脂糖凝上，母体又称为载体或担体。一般采用琼脂糖凝上，母体又称为载体或担体。一般采用琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、纤维素作母胶、葡聚糖凝胶、聚丙烯
90、酰胺凝胶、纤维素作母胶、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、纤维素作母胶、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、纤维素作母体体体体当小分子物质当小分子物质当小分子物质当小分子物质( ( ( (金属离子等无机辅助因子、有机辅金属离子等无机辅助因子、有机辅金属离子等无机辅助因子、有机辅金属离子等无机辅助因子、有机辅助因子等助因子等助因子等助因子等) ) ) )作为配基时，由于空间位阻作用，难以作为配基时，由于空间位阻作用，难以作为配基时，由于空间位阻作用，难以作为配基时，由于空间位阻作用，难以与配对的大分子亲和吻合，需要在母体与配基之与配对的大分子亲和吻合，需要在母体与配基之与配对的大分子亲和吻合，需要在母体与配基
91、之与配对的大分子亲和吻合，需要在母体与配基之间引入适当长度的间引入适当长度的间引入适当长度的间引入适当长度的连接臂连接臂连接臂连接臂（space armspace armspace armspace arm） 要使不溶性母体与配基偶联或通过连接臂与配基要使不溶性母体与配基偶联或通过连接臂与配基要使不溶性母体与配基偶联或通过连接臂与配基要使不溶性母体与配基偶联或通过连接臂与配基偶联，都必须进行偶联，都必须进行偶联，都必须进行偶联，都必须进行母体活化母体活化母体活化母体活化。即通过某种方法，。即通过某种方法，。即通过某种方法，。即通过某种方法，如溴化氰法、叠氮法、高碘酸氧化法、环氧化法、如溴化氰法
92、、叠氮法、高碘酸氧化法、环氧化法、如溴化氰法、叠氮法、高碘酸氧化法、环氧化法、如溴化氰法、叠氮法、高碘酸氧化法、环氧化法、甲苯磺酰氯法、双功能试剂法等，使母体引入某甲苯磺酰氯法、双功能试剂法等，使母体引入某甲苯磺酰氯法、双功能试剂法等，使母体引入某甲苯磺酰氯法、双功能试剂法等，使母体引入某种活泼基团，才能以共价键与配基偶联种活泼基团，才能以共价键与配基偶联种活泼基团，才能以共价键与配基偶联种活泼基团，才能以共价键与配基偶联由于亲和结合专一性强，由于亲和结合专一性强，由于亲和结合专一性强，由于亲和结合专一性强，洗脱条件要求高洗脱条件要求高洗脱条件要求高洗脱条件要求高。在亲。在亲。在亲。在亲和层析
93、过程中，应控制好和层析过程中，应控制好和层析过程中，应控制好和层析过程中，应控制好温度温度温度温度（0 0 0 010101010）、）、）、）、pHpHpHpH等等等等条件，以免酶变性失活，亲和层析剂免遭破坏。条件，以免酶变性失活，亲和层析剂免遭破坏。条件，以免酶变性失活，亲和层析剂免遭破坏。条件，以免酶变性失活，亲和层析剂免遭破坏。亲和介质昂贵，处理量不大，制备时只是在纯化亲和介质昂贵，处理量不大，制备时只是在纯化亲和介质昂贵，处理量不大，制备时只是在纯化亲和介质昂贵，处理量不大，制备时只是在纯化后期使用后期使用后期使用后期使用亲和层析的四个要素亲和层析的四个要素常用的亲和介质及专一性配体
94、常用的亲和介质及专一性配体根据欲分离组分与配基的结合特性根据欲分离组分与配基的结合特性, ,亲和层析可亲和层析可以分为：以分为：共价亲和层析共价亲和层析疏水层析疏水层析( (要区别疏水层析与反相层析要区别疏水层析与反相层析) )金属离子亲和层析金属离子亲和层析（实验方法见蛋白质工程（实验方法见蛋白质工程p218p218）免疫亲和层析免疫亲和层析染料亲和层析染料亲和层析凝集素亲和层析凝集素亲和层析 金属离子亲和层析金属离子亲和层析 金属离子亲和层析是利用蛋白类酶和其它蛋白表金属离子亲和层析是利用蛋白类酶和其它蛋白表金属离子亲和层析是利用蛋白类酶和其它蛋白表金属离子亲和层析是利用蛋白类酶和其它蛋白
95、表面的组氨酸的咪唑基团、半胱氨酸的巯基基团、面的组氨酸的咪唑基团、半胱氨酸的巯基基团、面的组氨酸的咪唑基团、半胱氨酸的巯基基团、面的组氨酸的咪唑基团、半胱氨酸的巯基基团、色氨酸的吲哚基团可与金属离子发生可逆性亲和色氨酸的吲哚基团可与金属离子发生可逆性亲和色氨酸的吲哚基团可与金属离子发生可逆性亲和色氨酸的吲哚基团可与金属离子发生可逆性亲和结合的特性，用螯合在母体上的金属离子对混合结合的特性，用螯合在母体上的金属离子对混合结合的特性，用螯合在母体上的金属离子对混合结合的特性，用螯合在母体上的金属离子对混合液中的目标蛋白进行纯化。液中的目标蛋白进行纯化。液中的目标蛋白进行纯化。液中的目标蛋白进行纯化
96、。要将酶或蛋白从亲和层析柱上洗脱下来，要将酶或蛋白从亲和层析柱上洗脱下来，要将酶或蛋白从亲和层析柱上洗脱下来，要将酶或蛋白从亲和层析柱上洗脱下来，可改变盐可改变盐可改变盐可改变盐浓度或浓度或浓度或浓度或pHpHpHpH（降低金属离子和蛋白质间的亲和常数）（降低金属离子和蛋白质间的亲和常数）（降低金属离子和蛋白质间的亲和常数）（降低金属离子和蛋白质间的亲和常数），或采用，或采用，或采用，或采用竞争性的试剂竞争性的试剂竞争性的试剂竞争性的试剂将蛋白置换下来，可采用将蛋白置换下来，可采用将蛋白置换下来，可采用将蛋白置换下来，可采用分级洗脱或梯度洗脱方式分级洗脱或梯度洗脱方式分级洗脱或梯度洗脱方式分级
97、洗脱或梯度洗脱方式金属离子亲和层析的主要优点是可用不同的金属离金属离子亲和层析的主要优点是可用不同的金属离金属离子亲和层析的主要优点是可用不同的金属离金属离子亲和层析的主要优点是可用不同的金属离子结合到螯合载体上，实现子结合到螯合载体上，实现子结合到螯合载体上，实现子结合到螯合载体上，实现母体再生母体再生母体再生母体再生。 层析聚焦层析聚焦层析聚焦层析聚焦将酶等两性物质的等电点特性与离子将酶等两性物质的等电点特性与离子将酶等两性物质的等电点特性与离子将酶等两性物质的等电点特性与离子交换层析结合在一起，实现组分分离的层析技术交换层析结合在一起，实现组分分离的层析技术交换层析结合在一起，实现组分分
98、离的层析技术交换层析结合在一起，实现组分分离的层析技术5 5、电泳分离、电泳分离带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的过程称为电泳。电极移动的过程称为电泳。颗粒在电场中的移动速度主要决定于其颗粒在电场中的移动速度主要决定于其本身所带的本身所带的净电荷量净电荷量，同时受颗粒形状和颗粒大小的影响。此，同时受颗粒形状和颗粒大小的影响。此外，还受到电场强度、溶液外，还受到电场强度、溶液pHpH值、离子强度及支持值、离子强度及支持体的特性等外界条件的影响体的特性等外界条件的影响。 纸电泳纸电泳自由电泳自由电泳薄层电泳薄层电泳凝胶电泳凝胶电泳薄膜电泳
99、薄膜电泳等电聚焦电泳等电聚焦电泳聚丙烯聚丙烯酰胺凝酰胺凝胶电泳胶电泳琼脂糖琼脂糖电泳电泳连续凝胶电泳连续凝胶电泳梯度凝胶电泳梯度凝胶电泳不连续凝胶电泳不连续凝胶电泳SDS-凝胶电泳凝胶电泳电电泳泳制备式电泳通常以不含制备式电泳通常以不含 SDS SDS 的原态的原态 disc-PAGE disc-PAGE 进行，以便回收进行，以便回收具有活性的蛋白质；蛋白质样本要先经过部分纯化，否则效果不具有活性的蛋白质；蛋白质样本要先经过部分纯化，否则效果不佳，并先以分析式电泳确定所要色帶的位置。佳，并先以分析式电泳确定所要色帶的位置。电极缓冲液应根据欲分离组分而定。电极缓冲液应根据欲分离组分而定。电极缓冲
100、液应根据欲分离组分而定。电极缓冲液应根据欲分离组分而定。一种为阴离子电泳系统，缓冲液一种为阴离子电泳系统，缓冲液一种为阴离子电泳系统，缓冲液一种为阴离子电泳系统，缓冲液pHpHpHpH为为为为8 8 8 89 9 9 9，上槽接，上槽接，上槽接，上槽接负极，下槽接正极，用溴酚蓝为指示剂，适用于负极，下槽接正极，用溴酚蓝为指示剂，适用于负极，下槽接正极，用溴酚蓝为指示剂，适用于负极，下槽接正极，用溴酚蓝为指示剂，适用于一般蛋白质和核酸的分离；一般蛋白质和核酸的分离；一般蛋白质和核酸的分离；一般蛋白质和核酸的分离；一种为阳离子电泳系统，缓冲液一种为阳离子电泳系统，缓冲液一种为阳离子电泳系统，缓冲液
101、一种为阳离子电泳系统，缓冲液pHpHpHpH为为为为4 4 4 4左右，上槽接左右，上槽接左右，上槽接左右，上槽接正极，下槽接负极，用亚甲基绿为指示剂，适用正极，下槽接负极，用亚甲基绿为指示剂，适用正极，下槽接负极，用亚甲基绿为指示剂，适用正极，下槽接负极，用亚甲基绿为指示剂，适用于碱性蛋白质的电泳分离于碱性蛋白质的电泳分离于碱性蛋白质的电泳分离于碱性蛋白质的电泳分离电泳的实验方法主要要求看电泳的实验方法主要要求看电泳的实验方法主要要求看电泳的实验方法主要要求看SDSSDSSDSSDSPAGEPAGEPAGEPAGE和双向电泳和双向电泳和双向电泳和双向电泳（详见蛋白质工程（详见蛋白质工程（详见
102、蛋白质工程（详见蛋白质工程p220-223p220-223p220-223p220-223）凝胶层析详见蛋白质工程凝胶层析详见蛋白质工程凝胶层析详见蛋白质工程凝胶层析详见蛋白质工程p213p213p213p213金属离子亲和层析见蛋白质工程金属离子亲和层析见蛋白质工程金属离子亲和层析见蛋白质工程金属离子亲和层析见蛋白质工程 p218p218p218p218高效液相色谱（高效液相色谱（HPLC）高效液相色谱，将常规层析介质制备成特殊的高效高效液相色谱，将常规层析介质制备成特殊的高效高效液相色谱，将常规层析介质制备成特殊的高效高效液相色谱，将常规层析介质制备成特殊的高效液相色谱柱，它使用的基质珠更
103、小，孔径更均一，液相色谱柱，它使用的基质珠更小，孔径更均一，液相色谱柱，它使用的基质珠更小，孔径更均一，液相色谱柱，它使用的基质珠更小，孔径更均一，基质填充比常规层析柱更致密，因此可以耐受更基质填充比常规层析柱更致密，因此可以耐受更基质填充比常规层析柱更致密，因此可以耐受更基质填充比常规层析柱更致密，因此可以耐受更大的压力，采用更快的洗脱速度，具有更高的分大的压力，采用更快的洗脱速度，具有更高的分大的压力，采用更快的洗脱速度，具有更高的分大的压力，采用更快的洗脱速度，具有更高的分辨率和重复性。辨率和重复性。辨率和重复性。辨率和重复性。高效液相色谱根据凝胶介质的分离原理不同，又可高效液相色谱根据
104、凝胶介质的分离原理不同，又可高效液相色谱根据凝胶介质的分离原理不同，又可高效液相色谱根据凝胶介质的分离原理不同，又可分为高效凝胶过滤色谱、高效离子交换色谱、高分为高效凝胶过滤色谱、高效离子交换色谱、高分为高效凝胶过滤色谱、高效离子交换色谱、高分为高效凝胶过滤色谱、高效离子交换色谱、高效疏水色谱、高效亲和色谱效疏水色谱、高效亲和色谱效疏水色谱、高效亲和色谱效疏水色谱、高效亲和色谱6 6、萃取分离、萃取分离萃取分离是利用萃取分离是利用物质在两相中的溶解度不同物质在两相中的溶解度不同而使其分离的技术。萃取分离中的两相一般而使其分离的技术。萃取分离中的两相一般为互不相溶的两个液相。有时也可采用其它为互
105、不相溶的两个液相。有时也可采用其它流体。流体。按照两相的组成不同，萃取可以分为：按照两相的组成不同，萃取可以分为：有机溶剂萃取有机溶剂萃取双水相萃取双水相萃取超临界萃取超临界萃取反胶束萃取反胶束萃取 有机溶剂萃取有机溶剂萃取在酶的萃取过程中，有机溶剂要预冷至在酶的萃取过程中，有机溶剂要预冷至在酶的萃取过程中，有机溶剂要预冷至在酶的萃取过程中，有机溶剂要预冷至0 0 0 010101010，萃，萃，萃，萃取过程在取过程在取过程在取过程在0 0 0 010101010低温条件下进行，并尽量缩短酶低温条件下进行，并尽量缩短酶低温条件下进行，并尽量缩短酶低温条件下进行，并尽量缩短酶与有机溶剂接触时间与
106、有机溶剂接触时间与有机溶剂接触时间与有机溶剂接触时间双水相萃取双水相萃取 双水相系统一般是指将两种亲水性的聚合物双水相系统一般是指将两种亲水性的聚合物双水相系统一般是指将两种亲水性的聚合物双水相系统一般是指将两种亲水性的聚合物都加在水溶液中，当超过某一浓度时，产生两相，都加在水溶液中，当超过某一浓度时，产生两相，都加在水溶液中，当超过某一浓度时，产生两相，都加在水溶液中，当超过某一浓度时，产生两相，两种聚合物分别溶于互不相溶的两相中（每种聚两种聚合物分别溶于互不相溶的两相中（每种聚两种聚合物分别溶于互不相溶的两相中（每种聚两种聚合物分别溶于互不相溶的两相中（每种聚合物在上下相中的分配比率不同）
107、合物在上下相中的分配比率不同）合物在上下相中的分配比率不同）合物在上下相中的分配比率不同） 成相是由于聚合物分子的空间阻碍作用，无成相是由于聚合物分子的空间阻碍作用，无成相是由于聚合物分子的空间阻碍作用，无成相是由于聚合物分子的空间阻碍作用，无法相互渗透，不能形成均一相，从而具有相分离法相互渗透，不能形成均一相，从而具有相分离法相互渗透，不能形成均一相，从而具有相分离法相互渗透，不能形成均一相，从而具有相分离的倾向。的倾向。的倾向。的倾向。 双水相形成的条件和定量关系可用相图表示，双水相形成的条件和定量关系可用相图表示，双水相形成的条件和定量关系可用相图表示，双水相形成的条件和定量关系可用相图
108、表示，对于两种聚合物和水相组成的系统，其相图如图对于两种聚合物和水相组成的系统，其相图如图对于两种聚合物和水相组成的系统，其相图如图对于两种聚合物和水相组成的系统，其相图如图4-84-84-84-8所示。所示。所示。所示。各种双水相系各种双水相系统聚合物聚合物P P 聚合物聚合物Q Q或或盐盐聚丙二醇聚丙二醇甲基聚丙二醇，聚乙二醇，聚甲基聚丙二醇，聚乙二醇，聚乙乙烯烯醇，聚乙醇，聚乙烯烯吡咯吡咯烷酮烷酮，羟羟丙基葡聚糖，葡聚糖丙基葡聚糖，葡聚糖聚乙二醇聚乙二醇聚乙聚乙烯烯醇，葡聚糖，聚蔗糖醇，葡聚糖，聚蔗糖甲基甲基纤维纤维素素羟羟甲基葡聚糖，葡聚糖甲基葡聚糖，葡聚糖乙基乙基羟羟乙基乙基纤维纤维
109、素素葡聚糖葡聚糖羟羟丙基葡聚糖丙基葡聚糖葡聚糖葡聚糖聚蔗糖聚蔗糖葡聚糖葡聚糖聚乙二醇聚乙二醇硫酸硫酸镁镁，硫酸，硫酸铵铵，硫酸，硫酸钠钠，甲，甲酸酸钠钠，酒石酸，酒石酸钾钠钾钠图图4 47 7 双水相系统相图双水相系统相图在双节线在双节线TCBTCB下方区域下方区域是单相区，上方是双相是单相区，上方是双相区。区。T T点和点和B B点分别表示点分别表示达到平衡时的上相组成达到平衡时的上相组成和下相组成，在同一直和下相组成，在同一直线上的各点分成的两相，线上的各点分成的两相，具有相同的组成，但体具有相同的组成，但体积比不同积比不同当系线当系线TMBTMB下移，长度下移，长度减小，两相之间的差别减
110、小，两相之间的差别逐渐减小，达到临界点逐渐减小，达到临界点C C点时，系线长度为零，点时，系线长度为零，达到均相。达到均相。聚合物聚合物P%P%BBT TB BC CTT聚聚合合物物Q Q或或盐盐% %M双节线的位置和形状与聚合物的分子质量有关，聚双节线的位置和形状与聚合物的分子质量有关，聚双节线的位置和形状与聚合物的分子质量有关，聚双节线的位置和形状与聚合物的分子质量有关，聚合物分子质量越高，相分离所需的浓度越低。合物分子质量越高，相分离所需的浓度越低。合物分子质量越高，相分离所需的浓度越低。合物分子质量越高，相分离所需的浓度越低。在高分子聚合物上引入亲和配基，可以进行双水相在高分子聚合物上
111、引入亲和配基，可以进行双水相在高分子聚合物上引入亲和配基，可以进行双水相在高分子聚合物上引入亲和配基，可以进行双水相亲和萃取亲和萃取亲和萃取亲和萃取双水相萃取不足：双水相萃取不足：双水相萃取不足：双水相萃取不足： 分离后酶液浓度低分离后酶液浓度低分离后酶液浓度低分离后酶液浓度低 高分子聚合物在分离后需要分离除去高分子聚合物在分离后需要分离除去高分子聚合物在分离后需要分离除去高分子聚合物在分离后需要分离除去超临界萃取超临界萃取 超临界萃取超临界萃取超临界萃取超临界萃取又称超临界流体萃取，是利用又称超临界流体萃取，是利用又称超临界流体萃取，是利用又称超临界流体萃取，是利用欲欲欲欲分离物质与杂质在超
112、临界流体中的溶解度不同分离物质与杂质在超临界流体中的溶解度不同分离物质与杂质在超临界流体中的溶解度不同分离物质与杂质在超临界流体中的溶解度不同而而而而达到分离的一种萃取技术达到分离的一种萃取技术达到分离的一种萃取技术达到分离的一种萃取技术 在相同的压力和温度条件下，同一物质的液在相同的压力和温度条件下，同一物质的液在相同的压力和温度条件下，同一物质的液在相同的压力和温度条件下，同一物质的液相和气相的物理特性是截然不同的。当温度和压相和气相的物理特性是截然不同的。当温度和压相和气相的物理特性是截然不同的。当温度和压相和气相的物理特性是截然不同的。当温度和压力达到某一特定的数值时，气体和液体的物理
113、特力达到某一特定的数值时，气体和液体的物理特力达到某一特定的数值时，气体和液体的物理特力达到某一特定的数值时，气体和液体的物理特性就会趋于相同，这个数值称为性就会趋于相同，这个数值称为性就会趋于相同，这个数值称为性就会趋于相同，这个数值称为超临界点超临界点超临界点超临界点。 当温度和压力超过其超临界点时，两相变为当温度和压力超过其超临界点时，两相变为当温度和压力超过其超临界点时，两相变为当温度和压力超过其超临界点时，两相变为一相，这种状态下的流体称为一相，这种状态下的流体称为一相，这种状态下的流体称为一相，这种状态下的流体称为超临界流体超临界流体超临界流体超临界流体pTGLSSCF图图4-8
114、4-8 超临界系统相超临界系统相超临界流体的显著特点：超临界流体的显著特点：其其物理特性和传质特性物理特性和传质特性介于液体和气体之间，适介于液体和气体之间，适于作萃取溶剂；于作萃取溶剂；其具有和液体同样的溶其具有和液体同样的溶解能力，具有解能力，具有很高的萃取很高的萃取速度速度；随温度和压力变化，其随温度和压力变化，其对物质的萃取具有选择性，对物质的萃取具有选择性，萃取后易分离萃取后易分离；其黏度接近于气体的黏其黏度接近于气体的黏度，度，利于物质的扩散利于物质的扩散；作为萃取剂的超临界流体必须具备以下条件作为萃取剂的超临界流体必须具备以下条件：1. 1.具备良好的化学稳定性，对设备没腐蚀性；
115、具备良好的化学稳定性，对设备没腐蚀性；具备良好的化学稳定性，对设备没腐蚀性；具备良好的化学稳定性，对设备没腐蚀性；2. 2.临界温度不能太高或太低，最好在室温或操作温临界温度不能太高或太低，最好在室温或操作温临界温度不能太高或太低，最好在室温或操作温临界温度不能太高或太低，最好在室温或操作温度附近；度附近；度附近；度附近；3. 3.操作温度应低于被萃取溶质的分解温度；操作温度应低于被萃取溶质的分解温度；操作温度应低于被萃取溶质的分解温度；操作温度应低于被萃取溶质的分解温度；4. 4.临界压力不能太高，节约压缩动力；临界压力不能太高，节约压缩动力；临界压力不能太高，节约压缩动力；临界压力不能太高
116、，节约压缩动力；5. 5.选择性要好，容易制得高纯度制品；选择性要好，容易制得高纯度制品；选择性要好，容易制得高纯度制品；选择性要好，容易制得高纯度制品；6. 6.溶解度要高，可减少溶剂的循环量；溶解度要高，可减少溶剂的循环量；溶解度要高，可减少溶剂的循环量；溶解度要高，可减少溶剂的循环量；7. 7.萃取剂要容易获得，价格便宜萃取剂要容易获得，价格便宜萃取剂要容易获得，价格便宜萃取剂要容易获得，价格便宜CO2CO2CO2CO2超临界萃取的工艺工程由萃取和分离两个步骤组超临界萃取的工艺工程由萃取和分离两个步骤组超临界萃取的工艺工程由萃取和分离两个步骤组超临界萃取的工艺工程由萃取和分离两个步骤组成
117、，按分离方法不同，分离工艺过程分为：成，按分离方法不同，分离工艺过程分为：成，按分离方法不同，分离工艺过程分为：成，按分离方法不同，分离工艺过程分为：等压分离：压力相同，温度升高，溶质在等压分离：压力相同，温度升高，溶质在等压分离：压力相同，温度升高，溶质在等压分离：压力相同，温度升高，溶质在CO2CO2CO2CO2中溶中溶中溶中溶解度降低而分离析出分离解度降低而分离析出分离解度降低而分离析出分离解度降低而分离析出分离等温分离：温度相同，压力下降，溶质在等温分离：温度相同，压力下降，溶质在等温分离：温度相同，压力下降，溶质在等温分离：温度相同，压力下降，溶质在CO2CO2CO2CO2中溶中溶中
118、溶中溶解度降低而分离析出解度降低而分离析出解度降低而分离析出解度降低而分离析出吸附分离：温度压力不变，分离罐中的吸附剂吸吸附分离：温度压力不变，分离罐中的吸附剂吸吸附分离：温度压力不变，分离罐中的吸附剂吸吸附分离：温度压力不变，分离罐中的吸附剂吸附溶质而分离溶质附溶质而分离溶质附溶质而分离溶质附溶质而分离溶质在超临界流体萃取中，为提高分离效果，在超临界在超临界流体萃取中，为提高分离效果，在超临界在超临界流体萃取中，为提高分离效果，在超临界在超临界流体萃取中，为提高分离效果，在超临界流体中添加少量的另一溶剂，称为流体中添加少量的另一溶剂，称为流体中添加少量的另一溶剂，称为流体中添加少量的另一溶剂
119、，称为夹带剂夹带剂夹带剂夹带剂，如水、，如水、，如水、，如水、乙醇、丙酮。乙醇、丙酮。乙醇、丙酮。乙醇、丙酮。某些超某些超临界流体的超界流体的超临界点和超界点和超临界密度界密度流体名称流体名称临临界温度界温度()()临临界界压压力力(Mpa)(Mpa)临临界密度界密度（g/mlg/ml）乙乙烷烷C C2 2H H6 632.332.34.884.880.2030.203丙丙烷烷C C3 3H H8 896.996.94.264.260.2200.220丁丁烷烷C C4 4H H1010152.0152.03.803.800.2280.228戊戊烷烷C C5 5H H1212296.7296.7
120、3.283.280.2320.232乙乙烯烯C C2 2H H4 49.99.95.125.120.2270.227氨氨NHNH3 3132.4132.411.2811.280.2360.236二氧化碳二氧化碳 CO CO2 231.131.17.387.380.460.46二氧化硫二氧化硫 SO SO2 2157.6157.67.887.880.5250.525水水H H2 2O O374.3374.322.1122.110.3260.326笑气笑气N N2 2O O36.536.57.177.170.4510.451氟里昂氟里昂C C28.828.83.903.900.5780.578反胶
121、束萃取反胶束萃取反胶束萃取是利用反胶束将酶或蛋白从混合液中萃反胶束萃取是利用反胶束将酶或蛋白从混合液中萃反胶束萃取是利用反胶束将酶或蛋白从混合液中萃反胶束萃取是利用反胶束将酶或蛋白从混合液中萃取出来的一种分离纯化技术，更具有选择性。取出来的一种分离纯化技术，更具有选择性。取出来的一种分离纯化技术，更具有选择性。取出来的一种分离纯化技术，更具有选择性。反胶束是超过临界胶束浓度的表面活性剂分散于连反胶束是超过临界胶束浓度的表面活性剂分散于连反胶束是超过临界胶束浓度的表面活性剂分散于连反胶束是超过临界胶束浓度的表面活性剂分散于连续有机相中形成的纳米尺度的一种聚集体。续有机相中形成的纳米尺度的一种聚集
122、体。续有机相中形成的纳米尺度的一种聚集体。续有机相中形成的纳米尺度的一种聚集体。反胶束中，表面活性剂的非极性基团在外，与非极反胶束中，表面活性剂的非极性基团在外，与非极反胶束中，表面活性剂的非极性基团在外，与非极反胶束中，表面活性剂的非极性基团在外，与非极性有机溶剂接触，而极性基团排列在内，形成一性有机溶剂接触，而极性基团排列在内，形成一性有机溶剂接触，而极性基团排列在内，形成一性有机溶剂接触，而极性基团排列在内，形成一个极性核，极性核具有溶解极性物质的能力，极个极性核，极性核具有溶解极性物质的能力，极个极性核，极性核具有溶解极性物质的能力，极个极性核，极性核具有溶解极性物质的能力，极性核溶解
123、水后，形成水池。当含有此种反胶束的性核溶解水后，形成水池。当含有此种反胶束的性核溶解水后，形成水池。当含有此种反胶束的性核溶解水后，形成水池。当含有此种反胶束的有机溶剂与蛋白质的水溶液接触后，蛋白质及其有机溶剂与蛋白质的水溶液接触后，蛋白质及其有机溶剂与蛋白质的水溶液接触后，蛋白质及其有机溶剂与蛋白质的水溶液接触后，蛋白质及其它亲水物质能够进入此水池中，酶不会造成失活。它亲水物质能够进入此水池中，酶不会造成失活。它亲水物质能够进入此水池中，酶不会造成失活。它亲水物质能够进入此水池中，酶不会造成失活。反胶束萃取中，首先要选择适宜的表面活性剂（常用反胶束萃取中，首先要选择适宜的表面活性剂（常用反胶
124、束萃取中，首先要选择适宜的表面活性剂（常用反胶束萃取中，首先要选择适宜的表面活性剂（常用阴离子表面活性剂阴离子表面活性剂阴离子表面活性剂阴离子表面活性剂AOTAOTAOTAOT）和有机溶剂）和有机溶剂）和有机溶剂）和有机溶剂此外，反胶束萃取还受下列因素影响：此外，反胶束萃取还受下列因素影响：此外，反胶束萃取还受下列因素影响：此外，反胶束萃取还受下列因素影响：（1 1 1 1）水相）水相）水相）水相pHpHpHpH：对于带正电荷的表面活性剂，水相：对于带正电荷的表面活性剂，水相：对于带正电荷的表面活性剂，水相：对于带正电荷的表面活性剂，水相pHpHpHpH高于蛋白质的等电点（带负电）时，有利于蛋
125、白质高于蛋白质的等电点（带负电）时，有利于蛋白质高于蛋白质的等电点（带负电）时，有利于蛋白质高于蛋白质的等电点（带负电）时，有利于蛋白质溶于反胶束中，对于阴离子表面活性剂则相反溶于反胶束中，对于阴离子表面活性剂则相反溶于反胶束中，对于阴离子表面活性剂则相反溶于反胶束中，对于阴离子表面活性剂则相反（2 2 2 2）离子强度）离子强度）离子强度）离子强度：水相中的离子强度决定带电表面所：水相中的离子强度决定带电表面所：水相中的离子强度决定带电表面所：水相中的离子强度决定带电表面所赋予的静电屏蔽程度：降低表面活性剂头部基团间赋予的静电屏蔽程度：降低表面活性剂头部基团间赋予的静电屏蔽程度：降低表面活性
126、剂头部基团间赋予的静电屏蔽程度：降低表面活性剂头部基团间的静电斥力，导致反胶束颗粒变小；降低了带电蛋的静电斥力，导致反胶束颗粒变小；降低了带电蛋的静电斥力，导致反胶束颗粒变小；降低了带电蛋的静电斥力，导致反胶束颗粒变小；降低了带电蛋白质分子和反胶束带电界面间的静电相互作用白质分子和反胶束带电界面间的静电相互作用白质分子和反胶束带电界面间的静电相互作用白质分子和反胶束带电界面间的静电相互作用3.5 酶的组合分离纯化策略酶的组合分离纯化策略Resolution（分辨率）（分辨率）SpeedCapacity（容量）（容量）Recovery（回（回收率）收率）设计分离纯化工艺的基本要求设计分离纯化工艺
127、的基本要求3.6 3.6 酶的浓缩、干燥与结晶酶的浓缩、干燥与结晶浓缩与干燥都是酶与溶剂（通常是水）分离浓缩与干燥都是酶与溶剂（通常是水）分离的过程。在酶的分离纯化过程中是一个重要的过程。在酶的分离纯化过程中是一个重要的环节。的环节。离心分离、过滤与膜分离、沉淀分离、层析离心分离、过滤与膜分离、沉淀分离、层析分离等都能起到浓缩作用。用各种吸水剂，分离等都能起到浓缩作用。用各种吸水剂，如硅胶、聚乙二醇、干燥凝胶等吸去水分，如硅胶、聚乙二醇、干燥凝胶等吸去水分，也可以达到浓缩效果。也可以达到浓缩效果。 蒸发浓缩是通过加热或者减压方法使溶液中蒸发浓缩是通过加热或者减压方法使溶液中的部分溶剂汽化蒸发，
128、使溶液得以浓缩的的部分溶剂汽化蒸发，使溶液得以浓缩的过程。由于酶在高温条件下不稳定，容易过程。由于酶在高温条件下不稳定，容易变性失活，故酶液的浓缩通常采用变性失活，故酶液的浓缩通常采用真空浓真空浓缩缩即在一定的真空条件下，使酶液在即在一定的真空条件下，使酶液在60以下进行浓缩以下进行浓缩。 在固体酶制剂的生产过程中，为了提高酶的在固体酶制剂的生产过程中，为了提高酶的在固体酶制剂的生产过程中，为了提高酶的在固体酶制剂的生产过程中，为了提高酶的稳定性，便于保存、运输和使用，一般都必须进稳定性，便于保存、运输和使用，一般都必须进稳定性，便于保存、运输和使用，一般都必须进稳定性，便于保存、运输和使用，
129、一般都必须进行干燥。常用的干燥方法有：行干燥。常用的干燥方法有：行干燥。常用的干燥方法有：行干燥。常用的干燥方法有： 真空干燥真空干燥真空干燥真空干燥 ： 边抽真空边加热，边抽真空边加热，边抽真空边加热，边抽真空边加热，温度控制在温度控制在温度控制在温度控制在60606060摄氏度以下酶液蒸发干燥摄氏度以下酶液蒸发干燥摄氏度以下酶液蒸发干燥摄氏度以下酶液蒸发干燥 冷冻干燥：冷冻干燥：冷冻干燥：冷冻干燥：固态冰在低温真空下直接升华为气体固态冰在低温真空下直接升华为气体固态冰在低温真空下直接升华为气体固态冰在低温真空下直接升华为气体喷雾干燥：喷雾干燥：喷雾干燥：喷雾干燥：酶液喷成小雾滴，分散于热气
130、流中，水酶液喷成小雾滴，分散于热气流中，水酶液喷成小雾滴，分散于热气流中，水酶液喷成小雾滴，分散于热气流中，水分在几秒钟内蒸发，雾滴周围空气温度较低，得分在几秒钟内蒸发，雾滴周围空气温度较低，得分在几秒钟内蒸发，雾滴周围空气温度较低，得分在几秒钟内蒸发，雾滴周围空气温度较低，得到干燥酶制剂。要控制好气流进口温度到干燥酶制剂。要控制好气流进口温度到干燥酶制剂。要控制好气流进口温度到干燥酶制剂。要控制好气流进口温度气流干燥：气流干燥：气流干燥：气流干燥：热气流直接与固体或半固态的物料接触热气流直接与固体或半固态的物料接触热气流直接与固体或半固态的物料接触热气流直接与固体或半固态的物料接触使物料水分
131、蒸发得以干燥。干燥时间长，酶活力使物料水分蒸发得以干燥。干燥时间长，酶活力使物料水分蒸发得以干燥。干燥时间长，酶活力使物料水分蒸发得以干燥。干燥时间长，酶活力损失大，要控制气流温度、速度和流向，同时要损失大，要控制气流温度、速度和流向，同时要损失大，要控制气流温度、速度和流向，同时要损失大，要控制气流温度、速度和流向，同时要经常翻动物料，使之干燥均匀经常翻动物料，使之干燥均匀经常翻动物料，使之干燥均匀经常翻动物料，使之干燥均匀吸附干燥：吸附干燥：吸附干燥：吸附干燥：密闭容器中用各种干燥剂吸收物料中的密闭容器中用各种干燥剂吸收物料中的密闭容器中用各种干燥剂吸收物料中的密闭容器中用各种干燥剂吸收物
132、料中的水分达到干燥目的，如硅胶、无水氯化钙、无水水分达到干燥目的，如硅胶、无水氯化钙、无水水分达到干燥目的，如硅胶、无水氯化钙、无水水分达到干燥目的，如硅胶、无水氯化钙、无水硫酸钙等等硫酸钙等等硫酸钙等等硫酸钙等等结晶是溶质以晶体形式从溶液中析出的过程。酶结晶是溶质以晶体形式从溶液中析出的过程。酶结晶是溶质以晶体形式从溶液中析出的过程。酶结晶是溶质以晶体形式从溶液中析出的过程。酶的结晶是酶分离纯化的一种手段。它不仅为酶的的结晶是酶分离纯化的一种手段。它不仅为酶的的结晶是酶分离纯化的一种手段。它不仅为酶的的结晶是酶分离纯化的一种手段。它不仅为酶的结构与功能等的研究提供了适宜的样品，而且为结构与功
133、能等的研究提供了适宜的样品，而且为结构与功能等的研究提供了适宜的样品，而且为结构与功能等的研究提供了适宜的样品，而且为较高纯度的酶的获得和应用创造了条件较高纯度的酶的获得和应用创造了条件较高纯度的酶的获得和应用创造了条件较高纯度的酶的获得和应用创造了条件酶在结晶之前，酶在结晶之前，酶在结晶之前，酶在结晶之前，酶液必须经过纯化达到一定的纯酶液必须经过纯化达到一定的纯酶液必须经过纯化达到一定的纯酶液必须经过纯化达到一定的纯度度度度。如果酶液纯度太低，不能进行结晶。通常酶。如果酶液纯度太低，不能进行结晶。通常酶。如果酶液纯度太低，不能进行结晶。通常酶。如果酶液纯度太低，不能进行结晶。通常酶的纯度应当
134、在的纯度应当在的纯度应当在的纯度应当在50%50%50%50%以上，方能进行结晶。总的趋势以上，方能进行结晶。总的趋势以上，方能进行结晶。总的趋势以上，方能进行结晶。总的趋势是酶的纯度越高，越容易进行结晶。是酶的纯度越高，越容易进行结晶。是酶的纯度越高，越容易进行结晶。是酶的纯度越高，越容易进行结晶。 要说明的是，不同的酶对结晶时的纯度要求要说明的是，不同的酶对结晶时的纯度要求要说明的是，不同的酶对结晶时的纯度要求要说明的是，不同的酶对结晶时的纯度要求不同。不同。不同。不同。 有些酶在纯度达到有些酶在纯度达到有些酶在纯度达到有些酶在纯度达到50%50%50%50%时就可能结晶，而时就可能结晶，而时就可能结晶，而时就可能结晶，而有些酶在纯度很高的条件下也无法析出结晶。所有些酶在纯度很高的条件下也无法析出结晶。所有些酶在纯度很高的条件下也无法析出结晶。所有些酶在纯度很高的条件下也无法析出结晶。所以酶的结晶并非达到绝对纯化，只是达到相当的以酶的结晶并非达到绝对纯化，只是达到相当的以酶的结晶并非达到绝对纯化，只是达到相当的以酶的结晶并非达到绝对纯化，只是达到相当的纯度而已纯度而已纯度而已纯度而已。盐析结晶盐析结晶有机溶剂结晶有机溶剂结晶透析平衡结晶透析平衡结晶 等电点结晶等电点结晶温度差结晶温度差结晶
