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1、微量残留病检测在急性白血病微量残留病检测在急性白血病分层治疗中的意义分层治疗中的意义 1 MRD:The leukemic population undectable by morpglogic methodshas been defined as MRD Minimal Residual Disease (MRD)MRD is a term used when there is evidence( immunophenotypic, molecular, or cytogenetic) that leukemic cells remain in the BM but there are in
2、sufficient cells to be detected by routine examination under the microscope.2 MRD检测的方法检测的方法MRD监测的临床意义监测的临床意义 MRD 检测在分层治疗中的意义检测在分层治疗中的意义FCM-MRD检测的结果检测的结果3 MRD检测方法检测方法a.PCR: 基因基因-定性、定性、 定量（定量（RQ-PCR）b.多参数多参数FCM：免疫标志免疫标志发病时寻找免疫标志和基因标志进行检测发病时寻找免疫标志和基因标志进行检测4 目的基因：目的基因：融合基因：融合基因：BCR/ABL,AML1/ETO,PML/RAR
3、基因重排：基因重排： IgH，TCR(10-4-10-5) 基因突变：基因突变：FLT3-ITD,NPM1(10-5) 基因表达增加：基因表达增加：WT1,PRAME(10-3)优点：优点： 灵敏度高灵敏度高-10-5-10-6/5 copes /10-5 特异性强特异性强缺点缺点: 1. 融合基因：应用范围有限：融合基因：应用范围有限： ALL:10-30%，AML:30-50% 2. IgH/TCR : 90%, 操作复杂，费时操作复杂，费时,需要基因测序，特异引需要基因测序，特异引 物物/探针探针(每例患者特异）每例患者特异） 3.容易污染，出现假阳性。容易污染，出现假阳性。RQ-PCR
4、检测检测MRD特点特点5 优点：优点： 灵敏：灵敏：ALL-10-4 , AML-10-3-10-4 （获取细胞相关）（获取细胞相关） 定量单位：细胞定量单位：细胞% 快速：检测当天即可知结果快速：检测当天即可知结果 操作简便操作简便 应用范围广：应用范围广：90%缺点缺点： 表型的变化表型的变化:假阴性假阴性 受前体受前体B细胞细胞(Hematogones)的干扰：的干扰： 形态幼稚，表达形态幼稚，表达CD34,TDT 在小儿、化疗后、在小儿、化疗后、SCT后比例增加后比例增加5% 需要较高的分析水平和技能需要较高的分析水平和技能 应用不够广泛，需要建立标准化操作应用不够广泛，需要建立标准化
5、操作FCM MRD检测的特点检测的特点6 定义：正常骨髓定义：正常骨髓/PB中不表达或表达比例较低的中不表达或表达比例较低的 免疫表型免疫表型 白血病相关的免疫表型白血病相关的免疫表型(LAIP)（Leukemia Associated ImmunoPhenotype）FCM-MRD：白血病细胞的特异抗原：白血病细胞的特异抗原：NG2(7.1)IM/MRD检测的抗原检测的抗原CD34,CD33-：正常分化抗原：表达于正：正常分化抗原：表达于正常细胞的不同系列、分化阶段常细胞的不同系列、分化阶段（非非白血病细胞所特异）白血病细胞所特异）7 交叉系列抗原交叉系列抗原: B、T、髓、髓、NK细胞抗原
6、细胞抗原 非同期抗原共表达非同期抗原共表达: CD15/CD117 CD34/CD64 抗原表达量异常：表达强度过高、过低或不表达抗原表达量异常：表达强度过高、过低或不表达 异常的光散射信号：异常的光散射信号：FSC和和SSC LAIP的分类的分类基础：熟悉正常细胞不同分化阶段抗原出现的基础：熟悉正常细胞不同分化阶段抗原出现的顺序顺序 和表达和表达量量的规律的规律8 9 Cytometry (communications in Clinical cytometry)38:139-152(1999)10 诱导缓解后诱导缓解后MRD水平与累计复发率水平与累计复发率Coustan-Smith E.B
7、LOOD,2000;96:269111 Johns HopkinsMost information displays No. of cases(%) A CD19/CD45/CD20/CD10 (N=82)CD45 vs CD10 48(59)FSC vs CD10 13(16)FSC vs CD20 11(13)CD10 vs CD20 4(5) 76(93)B CD19/CD45/CD9/CD34 (N=77) CD45 vs CD34 27(35) FSC vs CD34 17(22)CD34 vs CD9 16(21) 72(94)A+B 81(99) Leukemia(1999)13
8、,558-56712 A Childrens Oncology Group Study（FCM-MRD) Blood.2008;111:5477 诱导缓解后诱导缓解后MRD检测的意义（检测的意义（D29）, N=213413 诱导后诱导后 MRD水平对早期和晚期复发的影响水平对早期和晚期复发的影响Relapse-free survivalYears14 NCI SR 伴好遗传学特性患者伴好遗传学特性患者MRD与与EFS关系关系YearsYears4,1015 8 天天PB MRD的意义的意义16 多变量分析多变量分析17 鉴别预后非常好的一组患者鉴别预后非常好的一组患者NCI-SR+DTTEL
9、-AML1+MRD- D8and D2912%18 成人成人-ALL-FCM19 Blood.2003;10:4695 CD7/CD5/CD3CD4/CD8/CD3CD7/CD2/CD3CD7/CD34/CD38CD19/CD34/CD45CD10/CD13/CD19CD5/CD33/CD20CD34/CD38/CD19TDT/CD10/CD19CD34/CD22/CD19B-ALL N=73T-ALL N=29Spain20 0.05%N=440.5%,N=42Day +33Day +14MRD水平与水平与RFS11.76%(n=12/102), Day 14 MRD-/0.03%, RFS
10、 OF 90% at 5 years21 UnivariateUnivariateMultivariateMultivariateWholeWholeCRCRVariableVariableP PP PP PAgeAge30/6030/600.0020.0020.050.05N NWBCWBC30000ul30000ul0.030.030.050.05N NPh Ch.Ph Ch.+/-+/-0.040.04N N0.040.04Time to mCRTime to mCRD14/D33D14/D330.00010.0001N NN ND35-MRDD35-MRD0.05%0.05%0.001
11、0.0010.010.010.020.02对对RFS的多变量分析的多变量分析22 Status of minimal residual disease after induction predictsoutcome in both standard and high-risk Ph-negative adult acutelymphoblastic leukaemia. The Polish Adult Leukemia GroupALL 4-2002 MRD Study N=116British Journal of Haematology, 2008:142, 227CD7/CD2/CD3
12、CD7/CD5/CD3CD7/CD38/CD34CD7/CD4/CD8TDT/CD7/Ccd3CD7/CD1a/CD3cCD3/CD7/CD3CD10/CD20/CD19CD34/CD22/CD19CD34/CD38/CD19CD45/CD34/CD19TDT/CD10/CD19CD58/CD52/CD19CD33/CD13/CD19CD15/CD117/CD19CD65/CD56/CD19CD7/CD2/CD10B-ALLT-ALL23 诱导缓解后诱导缓解后 MRD与复发关系与复发关系 24 诱导后诱导后 MRD状态与治疗的关系状态与治疗的关系 25 对复发率和对复发率和leukaemia
13、free-survival的多变量分析的多变量分析26 Risk and response-based classification of childhood B-ALLChildrens Oncology Group (COG)Blood: 2007; 109: 926935. Retrospective,CCG:1988-1995,POG:1986-1999,N=6238,Age:1-22yCOG risk classification schemeRisk factors: Age:10 y WBC:50000/ L Cytogenetics:TEL/AML1,Trisomies(4,1
14、0.17),BCR/ABL,MLL, Day-14 marrow response:M125% blast Day-29 MRD-FCM CNS/TD27 Childhood B-Precursor-ALL Age:10,WBC:50000/ L :High Risk :Standard RiskTEL/Tris,D8/15,29 BM,D29MRD, CNSorTD/MLL+, M1,M10.1%.-/nLow Risk-, M1,M10.1-1.0%.+/+SRHRD8/15 BM,D29BM/MRD,CNS orTD/MLL+,M1,M10.1-.0%.+/+HRHRRandomized
15、AugmentedAugmentedBCR/ABL.MLL+SER.DI1.0%+D43-M2,3/MRD1.0%,VHR28 Risk and response-based classification of childhood B-ALLBlood: 2007; 109: 926935. Pediatric Oncology Group (POG)Childrens Cancer Group (CCG)Risk and response-based classification of childhood B-ALL29 Precursor-B-ALLPrecursor-B-ALLT-ALL
16、T-ALLALLALLN=2854N=2854N=422N=422N=3341N=3341No target54(2%)54(2%)29(7%)29(7%)88(3%)88(3%) 1 target2800(96%)2800(96%)393(93%)393(93%)3253(97%)3253(97%) 2 targets2662(93%)2662(93%)379(88%)379(88%)3089(92%)3089(92%) 3 targets2189(77%)2189(77%)281(67%)281(67%)2510(75%)2510(75%)No sensitive target173(6%
17、)173(6%)38(9%)38(9%)217(6%)217(6%)1 sensitive target561(20%)561(20%)95(22%)95(22%)671(20%)671(20%) 2 sensitive targets2066(72%)2066(72%)260(62%)260(62%)2365(71%)2365(71%)IgH TCR基因的阳性率和敏感性基因的阳性率和敏感性T Flohr，Leukemia (2008) 22, 771782AIEOP-BFM ALL 2000PCR MRD指导的危险度分层指导的危险度分层30 AIEOP-BFM ALL 2000化疗流程化疗流
18、程31 MRD指导的分层标准指导的分层标准HR:PPR;NR,BCR/ABL,MLL/AF432 QR-PCR 检测检测MRD流程流程33 Event-free survivalcumulative incidence of relapseBlood.2010;115:3206Molecular response to treatment redefines all prognostic factors in children and adolescents with B-cell precursor acute Lymphoblastic leukemia:results in 3184 p
19、atients of the AIEOP-BFM ALL 2000 study34 TEL/AML1+favorable DNA index ( 1.16 and 1.6)PCR-MRD对预后好患者的影响对预后好患者的影响35 PCR-MRD 对对Ph+ 患者的影响患者的影响36 SRIRHRPCR-MRD 对对Ph-患者的影响患者的影响37 多变量分析多变量分析38 CML欧洲白血病网欧洲白血病网(ELN) 最新推荐最新推荐 伊马替尼伊马替尼400mg/d初始治疗初始治疗失败的定义失败的定义: 3个月未达到个月未达到CHR, 6 个月未达到任何个月未达到任何CyR,12个月未达到个月未达到P
20、CyR,18个月未达到个月未达到CCyR,任何时间任何时间, 丢失之前达到的丢失之前达到的CCyR或或CHR 疾病进展或出现耐药的疾病进展或出现耐药的Abl激酶突变激酶突变 推荐采用第二代推荐采用第二代TKI尼洛替尼治疗尼洛替尼治疗慢性期慢性期加速加速/急变期急变期39 NCCN最新版治疗指南推荐最新版治疗指南推荐对于伊马替尼对于伊马替尼400mg/d初始治疗患者，出现以下事件初始治疗患者，出现以下事件推荐患者接受尼洛替尼治疗推荐患者接受尼洛替尼治疗: 3个月未达到血液学反应或者血液学复发个月未达到血液学反应或者血液学复发, 6 个月未达到任何个月未达到任何CyR, 12个月未达到个月未达到P
21、CyR或者细胞遗传学复发或者细胞遗传学复发, 18个月未达到个月未达到CCyR或者细胞遗传学复发或者细胞遗传学复发, 40 CMLCML患者患者CCRCCR后后BCR-ABL mRNABCR-ABL mRNA动态变化与动态变化与imatinibimatinib应用应用Qin YZ,Liu YR,Zhu HH,et al. Int J Lab Hematol 2008;30:317Qin YZ,Liu YR,Zhu HH,et al. Int J Lab Hematol 2008;30:317“”：CCR“”：Ph+41 其中其中1 1例患者由例患者由CCRCCR进展至急变期，进展至急变期，BC
22、R-ABLBCR-ABL升高升高2.5log,2.5log,但未检测出但未检测出PhPh染色体染色体Qin YZ,Liu YR.Zhu HH.et al. Int J Lab Hematol 2008;30:317Qin YZ,Liu YR.Zhu HH.et al. Int J Lab Hematol 2008;30:317CML患者患者CCR后的后的BCR-ABLmRNA水平提示复发水平提示复发空心：空心：CCR，实心：实心：Ph +42 正常正常B细胞的分化规律细胞的分化规律北京大学人民医院血液病研究所北京大学人民医院血液病研究所 43 CD10 CD34 CD19CD10 CD34 C
23、D19与与 CD45 CD45 关系关系44 CD22 CD20 CD19CD22 CD20 CD19与与 CD45CD45关系关系45 CD38 CD58 CD19CD38 CD58 CD19与与 CD45CD45关系关系46 I: CD34+CD10+ cIg- sIg- (Com-B-ALL)II:CD34-CD10+ cIg+ sIg- (pre-B-ALL)III: CD34-CD10- cIg+ sIg+(mature B-ALL)Note : no CD19+CD10-CD34+(Pro-B-ALL)47 成人与儿童成人与儿童B-ALLB-ALL各亚型中各亚型中LAIP LAIP
24、 发生率发生率363/403(90.1)236/262(90.1)127/141(90.1)总总8/15(53.3)e8/12(69.2)c0/3(0)a成熟成熟 -/-59/75(78.7)d35/46(76.1)b24/29(82.8)Pre -/+238/255(93.3)148/159(93.1)90/96(93.8)Com +/+58/58(100)45/45(100)13/13(100)Pro +/-总总成人成人儿童儿童CD34/CD10 B-ALL亚型亚型中国实验血液学杂志中国实验血液学杂志 2006；14：85348 Campana. Cytometry 38:139-152(
25、1999)49 MRD+0.1%CD45-CD10st+CD34s+分析全部分析全部CD19+的细胞，的细胞，以以Hematogones作为内作为内对照对照观察每个双参数的图形，观察每个双参数的图形，无僵硬设门无僵硬设门优点：避免表型改变所优点：避免表型改变所致假阴性致假阴性不依赖于发病时的不依赖于发病时的IM缺点：不易掌握缺点：不易掌握50 4 4色色FCMFCM检测检测B-ALL MRDB-ALL MRD的临床意义的临床意义9898例：儿童例：儿童7878，成人，成人20 20 ，671671份标本，份标本，6.8 次/人，10.8月月 /人， 3.1月/次中国血液学杂志中国血液学杂志 2
26、006；27：302有有无无总体总体初次初次IMIM7272例例2626例例9898BMBM复发复发12127 71919复发前复发前MRD+MRD+9 96 61515复发前复发前MRD-MRD-1 10 01 1复发前复发前MRD+%MRD+%90%90%100%100%93.70%93.70%复发前复发前4M NT4M NT2 21 13 3 两组四色抗体：通用：两组四色抗体：通用：CD34/CD10/CD45/CD19 个体化：个体化：CD38,CD123,CD13,CD33,CD58,CD20/CD45/CD19 无无IM: CD20/CD22/CD45/CD19 or CD20/C
27、D38/CD45/CD19连续监测，间隔连续监测，间隔3M。如。如MRD+？,需要证实时，在需要证实时，在FCM RQ-PCR BCR/ABL 与与FCM MRD的相关性的相关性FCM+FCM-TOTAL符合率符合率PCR+1192714681.51%PCR-210610898.15%TOTAL121133254符合率符合率98.35%79.70%88.50%Ph+ALL65 FCM与与AML1/ETO RQ-PCR的比较的比较相关系数为相关系数为0.76（P=0.0000） 说明说明 FCM+时，时， 98.41%PCR+ PCR-时，时， 97.56%FCM- FCM-时，时， 40.40
28、%PCR- PCR+时，时， 51.24%FCM+FCM的准确性和特异性的准确性和特异性PCR灵敏度灵敏度FCMFCM+FCM-TOTAL符合率符合率PCR+625912151.24%PCR-1404197.56%TOTAL6399162符合率符合率98.41%40.40%62.90%AML-M266 BM=10%NRIM+16.9%女女 19岁岁 B-ALL, WBC 110X109/L万万 染色体染色体-22,-9复杂异常复杂异常MRD-MRD+0.10%1M:In-1X52D:In-2X4M:C-2X67 MRD+0.002%MRD+0.05%Rel42.5%50d后后SCT+27DSCT+61DSCT+82DSCT+137DMRD-68 69
