标准的PCR反应体系

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1、标准的 PCR 反应体系PCR 反应体系与反应条件-标准的 PCR 反应体系：10扩增缓冲液10ul4 种 dNTP 混合物各 200umolL引物各 10100mol模板 DNA012ugTqDNA 聚合酶25ug2+15mmolL加双或三蒸水至100ulPCR 反应五要素：参加 PCR 反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和 g2+引物：引物是PCR 特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA 互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA 序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用 PCR 就可将模板 DNA 在体外大量扩增。设计引物应遵循以下原则：引物长

2、度：15-30b，常用为 20b 左右。引物扩增跨度：以 200-500b 为宜，特定条件下可扩增长至10kb 的片段。引物碱基：G+C 含量以 40-60%为宜，G+C 太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC 最好随机分布，避免5 个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是 3端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。引物 3端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致 PCR 失败。引物中有或能加上合适的酶切位点， 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点， 这对酶切分析或分子克隆很

3、有好处。1 / 15引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。 引物量：每条引物的浓度 011umol 或 10100mol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。酶及其浓度目前有两种 TqDNA 聚合酶供应， 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的 PCR 反应约需酶量 2。5U(指总反应体积为 100ul 时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。dNTP 的质量与浓度dNTP 的质量与浓度和 PCR 扩增效率有密切关系， dNTP 粉呈颗粒状，

4、如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP 溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1NH 或 1Tris。HCL 的缓冲液将其 PH 调节到 7075，小量分装，-20冰冻保存。多次冻融会使 dNTP 降解。在 PCR 反应中，dNTP 应为 50200umolL，尤其是注意 4 种 dNTP 的浓度要相等(等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低 PCR 产物的产量。dNTP 能与 g2+结合，使游离的 g2+浓度降低。模板(靶基因)核酸模板核酸的量与纯化程度，是PCR 成败与否的关键环节之一，传统的 DNA 纯化方法通常采用 SDS 和蛋白

5、酶 K 来消化处理标本。SDS 的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白， SDS 还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶 K 能水解消化蛋白质，特别是与 DNA 结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份， 用乙醇或异丙醇沉淀核酸。 提取的核酸即可作为模板用于 PCR 反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体， 消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR 扩增。RNA 模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶 K 法，要防止 RNse 降解 RNA。g2+浓度g2+对 PCR 扩增的特异性和产量有显著的影响

6、， 在一般的 PCR 反应中， 各种 dNTP 浓度为 200umolL 时， g2+浓度为 1520mmolL 为宜。 g2+浓度过高， 反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低TqDNA 聚合酶的活性，使反应产物减少。PCR 反应条件的选择PCR 反应条件为温度、时间和循环次数。温度与时间的设置： 基于 PCR 原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。 在标准反应中采用三温度点法，双链DNA 在 9095变性，再迅速冷却至 4060，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至 7075，在 TqDNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为 100300b 时)

7、可采用二温度点法， 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94变性，65左右退火与延伸(此温度 TqDNA 酶仍有较高的催化活性)。变性温度与时间： 变性温度低，解链不完全是导致 PCR 失败的最主要原因。一般情况下，9394lmin 足以使模板 DNA 变性，若低于 93则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。 此步若不能使靶基因模板或PCR 产物完全变性，就会导致 PCR 失败。退火(复性)温度与时间： 退火温度是影响 PCR 特异性的较重要因素。 变性后温度快速冷却至 4060，可使引物和模板发生结合。由于模板 DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结

8、合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。 退火温度与时间， 取决于引物的长度、 碱基组成及其浓度， 还有靶基序列的长度。 对于 20 个核苷酸， G+C 含量约 50%的引物，55为选择最适退火温度的起点较为理想。 引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：Tm 值(解链温度)=4(G+C)2(A+T)复性温度=Tm 值-(510)在 Tm 值允许围内， 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高 PCR 反应的特异性。复性时间一般为3060se，足以使引物与模板之间完全结合。延伸温度与时间：TqDNA 聚合酶的生物学活性：7080150 核苷酸 S 酶分子7060 核苷酸

9、 S 酶分子5524 核苷酸 S 酶分子高于 90时，DNA 合成几乎不能进行。PCR 反应的延伸温度一般选择在 7075之间，常用温度为 72，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。 PCR 延伸反应的时间， 可根据待扩增片段的长度而定， 一般 1Kb以内的 DNA 片段，延伸时间 1min 是足够的。34kb 的靶序列需 34min；扩增 10Kb 需延伸至 15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。循环次数循环次数决定 PCR 扩增程度。 PCR 循环次数主要取决于模板DNA 的浓度。一般的循环次数选在3040 次之间，循环次数越多，非特异

10、性产物的量亦随之增多。PCR 技术概论聚合酶链反应(PolymerseCinReion,PCR)是 80 年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一 DNA 片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA 供分析研究和检测鉴定。过去几天几星期才能做到的事情，用PCR 几小时便可完成。PCR 技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。PCR 技术简史PCR 的最早设想核酸研究已有100 多年的历史，本世纪 60 年代末、70

11、 年代初人们致力于研究基因的体外分离技术，Korn 于 1971 年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA 变性，与合适的引物杂交，用DNA 聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆RNA 基因”。PCR 的实现 1985 年美国 PE-Ceus 公司人类遗传研究室的 ullis 等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。 其原理类似于 DNA 的体内复制， 只是在试管中给 DNA 的体外合成提供以致一种合适的条件-摸板 DNA，寡核苷酸引物，DNA 聚合酶，合适的缓冲体系，DNA 变性、复性及延伸的温度与时间。PCR的改进与完善ullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶的Kleno

12、片段，其缺点是：Kleno酶不耐高温，90会变性失活，每次循环都要重新加。引物链延伸反应在 37下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其 PCR 产物特异性较差，合成的DNA 片段不均一。 此种以 Kleno酶催化的PCR技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点，但由于 Kleno 酶不耐热，在 DNA 模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期， 给 PCR 技术操作程序添了不少困难。 这使得 PCR 技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。1988 年初，Keonog 改用 T4DNA 聚合酶进行 PCR，其扩增的DNA 片段很均一，真实性也较高，只有

13、所期望的一种DNA 片段。但每循环一次，仍需加入新酶。1988 年 Siki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(ermusquius)中提取到一种耐热 DNA聚合酶。此酶具有以下特点：耐高温， 在 70下反应 2 后其残留活性大于原来的90%，在93下反应 2 后其残留活性是原来的60%，在95下反应 2 后其残留活性是原来的40%。在热变性时不会被钝化， 不必在每次扩增反应后再加新酶。 大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(20Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率， 因而其灵敏性也大大提高。 为与大肠杆菌多聚酶Kleno 片段区别， 将此酶命名为 TqDNA 多聚酶(TqDNA

14、Polymerse)。此酶的发现使 PCR 广泛的被应用。PCR 技术基本原理PCR 技术的基本原理类似于 DNA 的天然复制过程， 其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR 由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：模板DNA 的变性：模板 DNA 经加热至 93左右一定时间后， 使模板 DNA 双链或经 PCR 扩增形成的双链 DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板DNA 与引物的退火(复性)：模板 DNA 经加热变性成单链后，温度降至 55左右，引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA 模板-引物结合物在 TqDNA 聚合酶的

15、作用下，以 dNTP 为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理， 合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程， 就可获得更多的“半保留复制链”， 而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24 分钟，23 小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Pleu)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。PCR 的反应动力学PCR 的三个反应步骤反复进行，使DNA 扩增量呈指数上升。反应最终的 DNA 扩增量可用 Y(1X)n 计算。Y 代表 DNA 片段扩增后的拷贝数，X 表示平(Y)均每次的扩增效率，n 代表循环次数。平均扩增效率的理

16、论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列DNA 片段的增加呈指数形式，随着PCR 产物的逐渐积累，被扩增的 DNA 片段不再呈指数增加， 而进入线性增长期或静止期， 即出现“停滞效应”， 这种效应称平台期数、 PCR 扩增效率及 DNA 聚合酶 PCR 的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。PCR 扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分。 短产物片段的长度严格地限定在两个引物链 5端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的

17、DNA 为模板，引物是从3端开始延伸，其5端是固定的，3端则没有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链(即“长产物片段”)结合。 引物在与新链结合时， 由于新链模板的 5端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段3端被固定了止点， 保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段” 。不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加，而“长产物片段”则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计，这使得 PCR 的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯 DNA 片段供分析与检测用。PCR 反应体系与反应条件标准的 PCR 反应体系：

18、10扩增缓冲液10ul4 种 dNTP 混合物各 200umolL引物各 10100mol模板 DNA012ugTqDNA 聚合酶25ug2+15mmolL加双或三蒸水至100ulPCR 反应五要素：参加 PCR 反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和 g2+引物：引物是PCR 特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA 互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA 序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用 PCR 就可将模板 DNA 在体外大量扩增。设计引物应遵循以下原则：引物长度：15-30b，常用为 20b 左右。引物扩增跨度：以200-500b 为宜

19、，特定条件下可扩增长至10kb 的片段。引物碱基：G+C 含量以 40-60%为宜，G+C 太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC 最好随机分布，避免5 个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。引物 3端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致 PCR 失败。引物中有或能加上合适的酶切位点， 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点， 这对酶切分析或分子克隆很有好处。引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量：每条引

20、物的浓度 011umol 或 10100mol，以最低引物量产生所需要的结果为好， 引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增， 且可增加引物之间形成二聚体的机会。酶及其浓度目前有两种 TqDNA 聚合酶供应， 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的 PCR 反应约需酶量 25U(指总反应体积为 100ul 时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。dNTP 的质量与浓度dNTP 的质量与浓度和 PCR 扩增效率有密切关系， dNTP 粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP 溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1NH 或 1T

21、ris。HCL 的缓冲液将其 PH 调节到 7075，小量分装，-20冰冻保存。多次冻融会使 dNTP 降解。在 PCR 反应中，dNTP 应为 50200umolL，尤其是注意 4 种 dNTP 的浓度要相等(等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低 PCR 产物的产量。dNTP 能与 g2+结合，使游离的 g2+浓度降低。模板(靶基因)核酸模板核酸的量与纯化程度，是PCR 成败与否的关键环节之一，传统的 DNA 纯化方法通常采用 SDS 和蛋白酶 K 来消化处理标本。SDS 的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏

22、细胞膜，并解离细胞中的核蛋白， SDS 还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶 K 能水解消化蛋白质，特别是与 DNA 结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份， 用乙醇或异丙醇沉淀核酸。 提取的核酸即可作为模板用于 PCR 反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR 扩增。RNA 模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶 K 法，要防止 RNse 降解 RNA。g2+浓度g2+对 PCR 扩增的特异性和产量有显著的影响， 在一般的 PCR 反应中， 各种 dNTP 浓度为 200umolL 时， g2+浓度为 1

23、520mmolL 为宜。 g2+浓度过高， 反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低TqDNA 聚合酶的活性，使反应产物减少。PCR 反应条件的选择PCR 反应条件为温度、时间和循环次数。温度与时间的设置： 基于 PCR 原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。 在标准反应中采用三温度点法，双链DNA 在 9095变性，再迅速冷却至 4060，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至 7075，在 TqDNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为 100300b 时)可采用二温度点法， 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94变性，65左右退火与延伸

24、(此温度 TqDNA 酶仍有较高的催化活性)。变性温度与时间： 变性温度低，解链不完全是导致 PCR 失败的最主要原因。一般情况下，9394lmin 足以使模板 DNA 变性，若低于 93则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。 此步若不能使靶基因模板或PCR 产物完全变性，就会导致 PCR 失败。退火(复性)温度与时间： 退火温度是影响 PCR 特异性的较重要因素。 变性后温度快速冷却至 4060，可使引物和模板发生结合。由于模板 DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。 退火温度与时间， 取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有

25、靶基序列的长度。对于 20 个核苷酸，G+C 含量约 50%的引物， 55为选择最适退火温度的起点较为理想。 引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：Tm 值(解链温度)=4(G+C)2(A+T)复性温度=Tm 值-(510)在 Tm 值允许围内， 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高 PCR 反应的特异性。复性时间一般为3060se，足以使引物与模板之间完全结合。延伸温度与时间：TqDNA 聚合酶的生物学活性：7080150 核苷酸 S 酶分子7060 核苷酸 S 酶分子5524 核苷酸 S 酶分子高于 90时，DNA 合成几乎不能进行。PCR 反应的延伸温度

26、一般选择在 7075之间，常用温度为 72，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。 PCR 延伸反应的时间， 可根据待扩增片段的长度而定， 一般 1Kb以内的 DNA 片段，延伸时间 1min 是足够的。34kb 的靶序列需 34min；扩增 10Kb 需延伸至 15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。循环次数循环次数决定 PCR 扩增程度。 PCR 循环次数主要取决于模板DNA 的浓度。一般的循环次数选在3040 次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。PCR 反应特点特异性强 PCR 反应的特异性决定因素为：引物与模板 DNA 特

27、异正确的结合；碱基配对原则；TqDNA 聚合酶合成反应的忠实性；靶基因的特异性与保守性。其中引物与模板的正确结合是关键。 引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。 聚合酶合成反应的忠实性及TqDNA 聚合酶耐高温性， 使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行， 结合的特异性大大增加， 被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。灵敏度高 PCR 产物的生成量是以指数方式增加的， 能将皮克(g=10-12g)量级的起始待测模板扩增到微克(ug=10-6g)水平。能从 100 万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中

28、，PCR 的灵敏度可达 3 个 RFU(空斑形成单位)；在细菌学中最小检出率为3 个细菌。简便、快速 PCR 反应用耐高温的 TqDNA 聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在 DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在 24 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。对标本的纯度要求低不需要分离病毒或细菌及培养细胞， DNA 粗制品及总 RNA 均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测。PCR 扩增产物分析PCR 产物是否为特异性扩增，其结果是否准确可靠，必须对其进行严格的分析与鉴定，

29、才能得出正确的结论。 PCR 产物的分析， 可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法。凝胶电泳分析：PCR 产物电泳，EB 溴乙锭染色紫外仪下观察，初步判断产物的特异性。PCR 产物片段的大小应与预计的一致，特别是多重PCR，应用多对引物，其产物片断都应符合预讦的大小，这是起码条件。琼脂糖凝胶电泳：通常应用12%的琼脂糖凝胶，供检测用。聚丙烯酰胺凝胶电泳： 610%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好， 条带比较集中，可用于科研及检测分析。酶切分析：根据 PCR 产物中限制性内切酶的位点，用相应的酶切、电泳分离后，获得符合理论的片段，此法既能进行产物的鉴定，又能对靶基因分型，还能进行变异性

30、研究。分子杂交： 分子杂交是检测 PCR 产物特异性的有力证据， 也是检测 PCR 产物碱基突变的有效方法。Souern 印迹杂交： 在两引物之间另合成一条寡核苷酸链(内部寡核苷酸)标记后做探针，与 PCR 产物杂交。此法既可作特异性鉴定， 又可以提高检测 PCR 产物的灵敏度，还可知其分子量及条带形状，主要用于科研。斑点杂交：将 PCR 产物点在硝酸纤维素膜或尼膜薄膜上，再用内部寡核苷酸探针杂交，观察有无着色斑点，主要用于PCR 产物特异性鉴定及变异分析。核酸序列分析：是检测 PCR 产物特异性的最可靠方法。PCR 常见题总结PCR 产物的电泳检测时间一般为48 以内，有些最好于当日电泳检测

31、，大于48 后带型不规则甚致消失。假阴性，不出现扩增条带PCR 反应的关键环节有模板核酸的制备，引物的质量与特异性，酶的质量及活性PCR 循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。模板：模板中含有杂蛋白质，模板中含有Tq 酶抑制剂，模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，在提取制备模板时丢失过多， 或吸入酚。模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病， 因而要配制有效而稳定的消化处理液， 其程序亦应固定不宜随意更改。酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用， 以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时

32、忘加Tq 酶或溴乙锭。引物：引物质量、引物的浓度、 两条引物的浓度是否对称，是PCR 失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。 有些批号的引物合成质量有题，两条引物一条浓度高， 一条浓度低，造成低效率的不对称扩增， 对策为：选定一个好的引物合成单位。引物的浓度不仅要看 D 值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳， 一定要有引物条带出现， 而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带， 此时做 PCR 有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。引物应高浓度小量分装保存， 防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分， 导致引物变质降解失效

33、。引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。g2+浓度： g2+离子浓度对 PCR 扩增效率影响很大， 浓度过高可降低 PCR 扩增的特异性，浓度过低则影响 PCR 扩增产量甚至使 PCR 扩增失败而不出扩增条带。反应体积的改变：通常进行PCR 扩增采用的体积为 20ul、30ul、50ul。或 100ul，应用多大体积进行 PCR 扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如 20ul后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。物理原因：变性对 PCR 扩增来说相当重要，如变性温度低， 变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效

34、率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低 PCR 扩增效率。 有时还有必要用标准的温度计， 检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR 失败的原因之一。靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失， 影响引物与模板特异性结合， 或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR 扩增是不会成功的。假阳性出现的 PCR 扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的 PCR 产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。靶序列或扩增产物的交叉污染： 这种污染

35、有两种原因： 一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。 除酶及不能耐高温的物质外， 所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。 必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。 可互相拼接， 与引物互补后， 可扩增出 PCR 产物， 而导致假阳性的产生，可用巢式 PCR 方法来减轻或消除。出现非特异性扩增带PCR 扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增

36、带。非特异性条带的出现， 其原因：一是引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体。二是g2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR 循环次数过多有关。其次是酶的质和量， 往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现， 酶量过多有时也会出现非特异性扩增。 其对策有：必要时重新设计引物。 减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量， 适当增加模板量，减少循环次数。适当提高退火温度或采用二温度点法(93变性，65左右退火与延伸)。出现片状拖带或涂抹带PCR 扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。 其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP 浓度过高，g2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过

37、多引起。其对策有：减少酶量，或调换另一来源的酶。减少dNTP 的浓度。适当降低g2+浓度。增加模板量，减少循环次数。PCR 污染与对策PCR 反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性，但令人头痛的题是易污染，极其微量的污染即可造成假阳性的产生。污染原因(一)标本间交叉污染标本污染主要有收集标本的容器被污染， 或标本放置时， 由于密封不严溢于容器外， 或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染;标本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染;有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染。(二)PCR 试剂的污染主要是由于在PCR 试剂配制过程中，由于加样枪、容器

38、、双蒸水及其它溶液被 PCR 核酸模板污染(三)PCR 扩增产物污染这是 PCR 反应中最主要最常见的污染题， 因为 PCR 产物拷贝量大(一般为 1013 拷贝 ml)， 远远高于 PCR 检测数个拷贝的极限， 所以极微量的 PCR 产物污染，就可造成假阳就可形成假阳性。还有一种容易忽视，最可能造成 PCR 产物污染的形式是气溶胶污染;在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶， 在操作时比较剧烈地摇动反应管， 开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染据计算一个气溶胶颗粒可含48000 拷贝， 因而由其造成的污染是一个值得特别重视的题(四)实验室中克隆质粒的污染在分子生物学实验室及某

39、些用克隆质粒做阳性对照的检验室，这个题也比较常见。因为克隆质粒在单位容积内含量相当高， 另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂， 而且在活细胞内的质粒， 由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力，其污染可能性也很大。污染的监测一个好的实验室，要时刻注意污染的监测， 考虑有无污染是什么原因造成的污染， 以便采取措施，防止和消除污染。对照试验1阳性对照在建立PCR反应实验室及一般的检验单位都应设有PCR阳性对照， 它是PCR反应是否成功、 产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志。 阳性对照要选择扩增度中等、重复性好，经各种鉴定是该产物的标本，如以重组质粒为阳性对照， 其含量宜低

40、不宜高(100 个拷贝以下)，但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳性标本，其对检测或扩增样品污染的可能性很大。 因而当某一 PCR 试剂经自己使用稳定， 检验人员心中有数时，在以后的实验中可免设阳性对照。2 阴性对照每次 PCR 实验务必做阴性对照。 它包括标本对照被检的标本是血清就用鉴定后的正常血清作对照;被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照。试剂对照在 PCR 试剂中不加模板 DNA 或 RNA，进行 PCR 扩增，以监测试剂是否污染。3 重复性试验4 选择不同区域的引物进行PCR 扩增防止污染的方法(一)合理分隔实验室将样品的处理、配制PCR 反应液、PCR 循环扩增及 PCR 产

41、物的鉴定等步骤分区或分室进行， 特别注意样本处理及 PCR 产物的鉴定应与其它步骤严格分开。 最好能划分标本处理区;PCR反应液制备区;PCR 循环扩增区;PCR 产物鉴定区。 其实验用品及吸样枪应专用，实验前应将实验室用紫外线消毒以破坏残留的DNA 或 RNA。(二)吸样枪吸样枪污染是一个值得注意的题。 由于操作时不慎将样品或模板核酸吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源， 因而加样或吸取模板核酸时要十分小心， 吸样要慢，吸样时尽量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶污染。(三)预混和分装 PCR 试剂所有的 PCR 试剂都应小量分装，如有可能， PCR 反应液应预先配制好，然后小

42、量分装，-20保存。以减少重复加样次数，避免污染机会。另外，PCR 试剂，PCR 反应液应与样品及 PCR 产物分开保存，不应放于同一冰盒或同一冰箱。(四)防止操作人员污染，使用一次性手套、吸头、小离心管应一次性使用。(五)设立适当的阳性对照和阴性对照， 阳性对照以能出现扩增条带的最低量的标准病原体核酸为宜， 并注意交叉污染的可能性， 每次反应都应有一管不加模板的试剂对照及相应不含有被扩增核酸的样品作阴性对照。(六)减少 PCR 循环次数，只要 PCR 产物达到检测水平就适可而止。(七)选择质量好的 Eendor 管，以避免样本外溢及外来核酸的进入，打开离心管前应先离心，将管壁及管盖上的液体甩至管底部。开管动作要轻，以防管内液体溅出。（注：专业文档是经验性极强的领域，无法思考和涵盖全面，素材和资料部分来自网络，供参考。可复制、编制，期待你的好评与关注）