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1、Slide. .- 1 -欢迎光临日程安排HPLC 维护Younglin HPLC 日常维护常见问题解答FAQ日常使用及维护现场演示韩国英麟机器北京代表处技术服务中心 (O)010-65305879 Slide. .- 2 -HPLCHPLC 故障诊断技术故障诊断技术 TroubleshootingSlide. .- 3 -I. I. I. 流流动动相的相相的相关关问题问题检测器背景过高, 有时引起基线溢出.Slide. .- 4 -溶剂的级别及处理方法溶剂的级别及处理方法由于除去了有机或无机污染物，所以使用纯水对系统是非常理想的.现在的纯水系统 都可以给出水中总有机碳的值.Slide. .-
2、 5 -流动相可能引出的问题流动相可能引出的问题梯度洗脱时出现鬼峰!Slide. .- 6 -溶剂级别及处理方法溶剂级别及处理方法如果水的质量很差，在梯度洗脱时，有可能出现鬼峰!Slide. .- 7 -溶剂级别及处理方法溶剂级别及处理方法不同的分析及HPLC流动相级别Slide. .- 8 -溶剂级别及处理方法溶剂级别及处理方法注意HPLC级别的溶剂只允许有低UV吸收的杂质存在. -使用前，所有流动相都应该经0.45um滤膜过滤.如果溶剂有背景吸收,- 线性范围会下降- 噪音会增加- 基线的稳定性会受影响。Slide. .- 9 -溶剂级别及处理方法溶剂级别及处理方法在配置，处理HPLC级别
3、溶剂的注意事项 :1. THF分析级的THF包含butylated hydroxy toluene (BHT) 作为抗氧化抑制剂. 因为 BHT 有很强的紫外吸收, 所以在HPLC级别的THF中没有BHT. 因此, HPLC级别的THF 必须储藏在冷暗的地方，尽量避免氧化.积累了大量的有机氧化物可能会引起爆炸.Slide. .- 10 -溶剂级别及处理方法溶剂级别及处理方法2. 氯仿 Chloroform分析级的氯仿包含 3% 乙醇，以防止产生碳酰氯这样的有毒气体. 然而，像乙醇，水在正相分离中可以使硅胶去活，从而导致保留时间不稳定。HPLC 级的氯仿不包含作为稳定剂的乙醇.因此，一旦打开盖子
4、，就应放到冷暗的地方保存，以避免产生有毒气体 .Slide. .- 11 -流动相可能引出的问题流动相可能引出的问题当流动相中使用了缓冲溶液，那么泵压将会明显增加.Slide. .- 12 -溶剂级别及处理方法溶剂级别及处理方法使用缓冲溶液 使用前必先过滤溶液. 为了避免结晶，系统中不能有残留溶液 : : 对泵的影响 破坏推杆及密封垫 : 对色谱柱的影响 导致柱塌陷 : 对流路的影响 腐蚀不锈钢流路 注意可能长菌: 特别是磷酸缓冲液 - 是细菌，菌类物质生长很好的介质. 理想状态，应该每天配置新鲜的缓冲液（尤其夏天）.Slide. .- 13 -溶剂级别及处理方法溶剂级别及处理方法溶剂过滤装置
5、Slide. .- 14 -流动相可能引出的问题流动相可能引出的问题 当流动相由有机溶剂换成缓冲溶液时，经常会出现沉淀等问题.Slide. .- 15 -溶剂级别及处理方法溶剂级别及处理方法流动相的改变步骤Slide. .- 16 -溶剂级别及处理方法溶剂级别及处理方法缓冲溶液有机溶剂Slide. .- 17 -溶剂级别及处理方法溶剂级别及处理方法在系统更换全部有机流动相之前，应注意以下几点, 系统应用水/有机相（1：1）比例混合，来去除曾经用过的缓冲溶液。否则，当有机相遇到残留的缓冲液时，系统会出现结晶的现象。Slide. .- 18 -流动相可能引出的问题流动相可能引出的问题不同的操作者配
6、置的流动相，可能保留时间会不同.Slide. .- 19 -溶剂级别及处理方法溶剂级别及处理方法溶剂的预混合对于单元系统, 分析前我们经常要预先配好混合溶剂. 例如：要配置 100ml 的50:50 甲醇和水的混合溶剂, 我们可以 : 1. 各称量 50ml 的水和 50ml 甲醇，再把它们混合到一起. 2. 称量50 ml 水，再用甲醇定容到 100ml容器中。 3. 称量50ml 甲醇，用水定容到100ml容器中.所有这三种方法都将获得不同的结果。无论选用哪种，都应一直使用这种方法，以获得较好的重复性。推荐使用第一种方法。Slide. .- 20 -流动相可能引出的问题流动相可能引出的问题
7、 溶剂瓶的问题1. 容器一般使用玻璃，因为塑料增塑剂有可能会导致基线不稳或是污染柱子。当分析高灵敏度无机离子时，应避免使用玻璃容器。2. 容器开口处应尽量小。这样可以避免由于溶剂的快速挥发导致的浓度不稳定，这样也可以降低房间中的挥发物浓度。注意不要将容器完全密封，这样会导致局部真空，泵不上液体。 Slide. .- 21 -溶剂瓶的问题溶剂瓶的问题3. 当使用不太稳定的溶剂时, 或者每天制备新的溶剂，或者在溶剂瓶中充入惰性气体，例如氦气。4. 不要将溶剂直接放在通风口，窗口或是门口；不要直接放在阳光下。这样会导致温度的变化，增加挥发。通常情况下，对RI检测器影响最大，有时候也会影响到UV 检测
8、器。5. 一般情况下，要将溶剂瓶放置在高于溶剂传输系统（泵）的位置，这样可以保证泵有好的虹吸效果，同时避免泵空走。Slide. .- 22 -溶剂瓶的问题溶剂瓶的问题6.通常使用溶剂过滤器，这是一个粗滤，可以保证溶剂中的颗粒不会进入泵头。要保证这个滤头清洁，无菌。如果脏了，可以用异丙醇或是1N的硝酸超声清洗。7. 实验室中好的习惯是在溶剂瓶上贴上标签，表明内部溶剂的名称，组成甚至制备的日期。Slide. .- 23 -II. 样品可能引出的问题样品可能引出的问题进样后，系统压力都会迅速增加。Slide. .- 24 -样品处理问题样品处理问题1. 通常都是将样品溶解在流动相中，流动相中样品的溶
9、解度是最好的. - 减小溶剂峰，尤其是感兴趣的样品洗脱出来离溶剂峰很近的情况。 - 保证样品在流动相中的溶解度，保证在系统，特别是柱子中不出现沉淀凝结的现象。 - 保证样品溶液与流动相之间的可混合性。2. 通常进样前，我们用0.45um的过滤膜过滤样品。 如果预先知道样品很脏，可以在进样前用0.2um的过滤膜过滤Slide. .- 25 -III. 进样可能引出的问题进样可能引出的问题手动进样，重现性不好。Slide. .- 26 -Rheodyne 手动进样器手动进样器1. 部分充满定量环进样方法。 - 进样量要小于定量环体积的一半。2. 全充满定量环进样方法。 -进样量要大于定量环体积的3
10、倍。(Laminar flow effect)Slide. .- 27 -Rheodyne Rheodyne 手动进样器手动进样器进样体积和检测器反映值之间的关系 (峰面积)Slide. .- 28 -正确的进样方法正确的进样方法 (手动手动)样品进样方法 : - 先插入进样针在INJECT 孔处 - 旋到 LOAD位置.上样 - 推入样品. - 旋转到INJECT位置,进样 - 移走进样针. - 清洗进样口 . Slide. .- 29 -正确的进样方式正确的进样方式 (自动进样器自动进样器)1. 至少每天都要清洗流路.2. 至少每周都要改变清洗液.3. 不可以用盐溶液作为清洗液.4. 使用
11、厂家推荐的自动进样瓶瓶垫.5. 瓶垫不可以重复使用.6. 不要把瓶子充满.Slide. .- 30 -进样污染进样污染产生交叉污染!当样品浓度很大，检测器又在一个灵敏的使用范围时，交叉污染很容易出现。Slide. .- 31 -进样器清洗进样器清洗 - 使用标准的针清洗接头清洗 使用后最好清洗Slide. .- 32 -进样器漏液进样器漏液Slide. .- 33 -IV. 色谱柱可能引起的问题色谱柱可能引起的问题当我们拥有了一根新的色谱柱，我们如何检测它的初始柱效能?Slide. .- 34 -检查新柱子检查新柱子1. 柱效检查 柱效的检查可以在色谱柱使用前，根据厂家提供的色谱柱报告上的方法
12、及混合样品来测定。2. 压力检查 正常分析条件下，初始色谱柱操作压力应该记录下来，作为今后实验的参考。3. 保护柱 应尽量使用保护柱，但应注意不要给系统增加过大的压力。Slide. .- 35 -操作中的注意事项操作中的注意事项. .1.作为新色谱柱，最好在使用前，低于分析流速下（0.2-0.3ml/min）过大约30分钟。色谱柱如果长时间没有使用，再次投入使用前，也要做相似的工作。2. 关机时，最好逐步降低流速，不要突然降低压力，这样对色谱柱以及系统都会有影响。3. 当使用缓冲溶液时，切记要先用水冲洗系统，再改用有机溶剂，这样可以避免结晶现象出现，堵塞柱子。Slide. .- 36 -操作中
13、的注意事项操作中的注意事项4.使用前，最好过滤流动相及样品，避免颗粒物产生堵塞。5. 样品最好溶解在流动相中，如果不是，最好也要接近流动相的组成。这样会减少样品在流动相中的不溶物沉淀在柱子中。6. 日常使用后，可用强溶剂冲洗色谱柱。例如：ODS柱每天使用完后，可用乙腈冲洗色谱柱，以除去柱子中强吸收的样品。Slide. .- 37 -色谱柱的问题及解决办法色谱柱的问题及解决办法柱筛板或柱吸附了样品或溶剂的杂质形成化学结晶,或者保存包装不当,使柱子填充材料干燥, 会引起下列问题系统压力增高,峰型不好(拖尾,前伸,分叉),保留时间改变. Slide. .- 38 -色谱柱的问题及解决办法色谱柱的问题
14、及解决办法筛板或色谱柱填料预先要用0.45um的滤膜过滤样品和流动相，如果样品很脏的话，需要用0.25um的滤膜过滤。尽管如此，有时候由于实验时间有限，流动相或是样品处理不彻底，还会有脏东西进入系统，造成堵塞。Slide. .- 39 -色谱柱的问题及解决办法色谱柱的问题及解决办法正常情况下，用强溶剂冲洗色谱柱，可以除去这些颗粒。但有时不溶的颗粒用这种方法很难除去，这时，可以考虑反冲色谱柱。注意：这时不要连接检测器。最终，如果冲洗不能解决问题的话，可以更换过滤筛板。但是更换时要很小心，不要破坏柱床，否则柱效会降低。不锈钢筛板是固定在色谱柱上的，所以尽量不要更换。Slide. .- 40 -吸附
15、样品 & 溶剂杂质色谱柱的问题及解决办法色谱柱的问题及解决办法杂质将会导致峰托尾.可以用强溶剂冲洗色谱柱.Slide. .- 41 -填料的化学腐蚀色谱柱的问题及解决办法色谱柱的问题及解决办法注意：对于基于聚合物的色谱柱，必须要检查每一项的值Slide. .- 42 -填料干枯色谱柱的问题及解决办法色谱柱的问题及解决办法一般来讲，特别对于聚合物色谱柱，填料膨胀的特性依赖于溶剂。因此，当色谱柱干了的时候，填料有可能发生变形。特别是GPC色谱柱，溶剂的选择非常特殊。不仅要避免干枯，而且不能使用错误的溶剂，否则整个聚合物色谱柱的特性（形状及粒径）都有可能发生变化。Slide. .- 43 -V.V.
16、检测器有可能引发的问题检测器有可能引发的问题基线漂移.Slide. .- 44 -废液瓶务必保证废液管没有深入到废液中，否则的话，检测池的压力很容易升高。检测器带来的问题检测器带来的问题Slide. .- 45 -VI. VI. 其他类型的问题其他类型的问题1. 系统大的压力波动.2. 系统高压.3. 基线不稳 A. 漂移 B. 噪音4. 峰形变化 A. 不对称 (前伸 / 拖尾) B. 分叉Slide. .- 46 -1. 1. 系统中大的压力波动系统中大的压力波动. .可能的原因 :1.系统漏液 2.单向阀被污染3.在线过滤器被污染4.柱塞密封圈坏/漏解决办法 :1. 检查连接处或是检测池
17、是否有漏液。特别是任何新出现的连接处（如：新柱子/检测器之间）。有时，特别是用PEEK材质的管线连接时，如果加过高压后，连接部分可能会松，也容易漏。Slide. .- 47 -2.如果没有发现漏液，接下来要检查泵头的后面。在泵头后面，管线连接着洗涤瓶。如果密封垫漏液，液体有时可以流出。如果洗涤瓶的水面看起来上升了，说明泵头漏液。如果漏液可以观察到，那么说明柱塞杆受到破坏。需要更换柱塞杆密封垫。 注意：(A) 更换泵密封垫时，需要半小时老化新垫，在这个期间，可能会出现压力波动，这是正常的。 （B）更换柱塞密封垫时，一定要注意观察柱塞杆，如果出现划痕，应更换柱塞杆，否则密封垫也很容易被损坏。3.如
18、果,没有发现泵头泄露,就要检查单向阀或在线过滤器.它们可以移下来先用IPA(异丙醇)后用水超声波清洗(各15分钟), 对于顽固的污点,可以使用1N的硝酸,如果还不行,更换单向阀. 1.1.系统中大的压力波动系统中大的压力波动Slide. .- 48 -2. 2. 系统压力增高系统压力增高可能的原因 :1. 堵塞 A. 检测池 B. 柱压力慢慢变大 C. 泵 D. 混和气 E. 管线Slide. .- 49 -维护方法 :情况 1 : 压力逐渐升高 (每天或每月) - 最大的可能是色谱柱堵了. - 色谱柱中积累了颗粒或是吸附了杂质解决办法 :1. 使用在色谱柱介绍说明中提到的方法清洗色谱柱。2.
19、 如果可能更换色谱柱的过滤陶瓷片。3. 反冲柱子. (这是最后不得已的办法).通常建议使用保护柱。保护柱比较便宜，在出现堵塞的现象时易于更换，2. 2. 系统压力增高系统压力增高Slide. .- 50 -2. 2. 系统压力增高系统压力增高情况 2 : 系统压力突然增加 - 系统突然堵塞; 可能在系统的某部分突然堵塞.检查方法 :1. 检查系统堵塞的方法 (从尾到头)a. 从检测器端断开色谱柱，压力如果正常，说明检测池或从管线到检测池堵塞。b. 如果压力仍然很高，断开色谱柱（分析柱）。（1ml/min的流速下）带保护柱的正常压力应该是不高于5kgfcm-2。如果压力正常，清洗或是更换色谱柱（
20、分析柱）。c. 如果压力仍然高，除去保护柱。压力正常，更换保护柱。d. 如果压力仍高，就可能使混和气或是泵的问题了。如果管线堵了，可以使用IPA或硝酸高流速冲洗，但此时不要连接色谱柱或是检测器。Slide. .- 51 -3. 3. 基线不稳定基线不稳定1. 漂移通常由于系统污染或是检测器不稳定。2. 噪音通常由于系统污染或是系统存在气泡。首先应检查是否系统或色谱柱脏。移去色谱柱，以两通代替，如果基线稳定，那说明色谱柱脏，按照前面提到的色谱柱清洗办法，清洗色谱柱。如果基线仍然不稳定，如果可以的话，用IPA或1N的硝酸清洗系统，或用其他溶液，或最终流动相清洗系统。对于一些检测器，如示差或电导检测
21、器，如果清洗没有解决问题的话，需要检查一下柱温箱的温度。（对于RI，还要观察流动池的温度）对于有噪音的基线，检查流动池中是否存在气泡。如果气泡存在于色谱柱中，需要长时间冲洗。如果气泡在泵头，一般情况，也会出现压力波动，这时可以做Purge，将气泡移出。A. A. 漂移漂移B. B. 噪音噪音Slide. .- 52 -峰形变化峰形变化 - A. - A. 不对称不对称 ( (前伸前伸 / / 拖尾拖尾) )情况 1 : 方法开发可能的原因 : 1. 不适当的溶剂选择Slide. .- 53 -峰形变化峰形变化 - A. - A. 不对称不对称 ( (前伸前伸 / / 拖尾拖尾) )2. 二级封
22、端的影响:由于硅胶的重金属或硅胶硅醇基残留 3. 样品过载对于每根柱子上样量是有极限和不同的,如果超过了柱子的能力,前伸或拖尾峰就可能出现. (多数情况下拖尾). 4. 调整流动相的PH值. （特别是使用了缓冲溶液）Slide. .- 54 -峰形变化峰形变化 - A. - A. 不对称不对称 ( (前伸前伸 / / 拖拖尾尾) )情况 2 : 在已存在的方法中，峰形突然扭曲1.色谱柱 (Guard/Main) 出现问题. 清洗或更换色谱柱.2.高 PH (7) 使用硅胶柱时，柱子出现溶解. 3.可能是二级封端不完全造成的影响 . 4.特殊情况下,死体积增大,引起谱带加宽. Slide. .- 55 -峰形变形峰形变形 - B. - B. 分叉分叉1. 柱子错误的储藏,造成柱子干燥,会引起峰分叉 2. 柱子中有结晶物或压力震动. 3. 选择溶剂错误.
