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1、离离 心心 分分 离离0 概述概述n固液分离的常用手段n分类：离心沉降离心过滤超离心1 离心沉降原理球形粒子沉降在离心力场中1 离心沉降原理 常速离心机-中速离心机 高速离心离心机的种类与用途离心机的种类与用途按速度和离心力：按速度和离心力：1 1、常速离心机、常速离心机 最大转速最大转速8000rpm(r/min),8000rpm(r/min),相对离心力相对离心力(RCF)10(RCF)104 4g g以下以下, ,用用于细胞、菌体和培养基残渣等分离；于细胞、菌体和培养基残渣等分离；2 2、高速（冷冻）离心机、高速（冷冻）离心机 1101104 4-2.510-2.5104 4rpmrpm
2、，相对离心力，相对离心力10104 410105 5g,g,用用于细胞碎片、较大细胞器、大分子沉淀物等分离；于细胞碎片、较大细胞器、大分子沉淀物等分离；3 3、超速离心机、超速离心机 转速转速2.5-8102.5-8104 4rpmrpm，相对离心力相对离心力5*105*105 5g g；用于；用于DNADNA、RNARNA蛋白质、细胞器、病毒分离纯化；检测纯度；沉降系数和相对分子量测蛋白质、细胞器、病毒分离纯化；检测纯度；沉降系数和相对分子量测定等。定等。n瓶式离心机1 1）斜角式离心机）斜角式离心机v是一类结构最简单的实验室常用离心机，是一类结构最简单的实验室常用离心机，v指离心管腔与转轴
3、成一定倾角的转子；指离心管腔与转轴成一定倾角的转子；v角度越大，沉降越结实，分离效果越好，角度越大，沉降越结实，分离效果越好，v角度越小，颗粒沉降距离短，沉降速度快，但分离效果差。角度越小，颗粒沉降距离短，沉降速度快，但分离效果差。v颗粒在角转子中沉降时，颗粒在角转子中沉降时，先沿离心力方向撞向离心管，先沿离心力方向撞向离心管，然后再沿管壁滑向管底，然后再沿管壁滑向管底，因此管的一侧会出现颗粒沉积。因此管的一侧会出现颗粒沉积。2 2）平抛式离心机平抛式离心机v平平抛抛式式离离心心机机一一类类结结构构简简单单的的实实验验室室常常用用的的低低中速离心机，转速一般在中速离心机，转速一般在 3000-
4、6000rpm3000-6000rpm。v 转子活动管套内的离心管，转子活动管套内的离心管，静止时垂直挂在转静止时垂直挂在转头上，头上，旋转时随着转子转动，从垂直悬吊上升到旋转时随着转子转动，从垂直悬吊上升到水平位置（约水平位置（约200200800rpm800rpm）。）。v颗粒在水平转子中的沉降是沿管子颗粒在水平转子中的沉降是沿管子轴向移动轴向移动。v样品便于收集样品便于收集v受振动和变速搅乱后对流现象小受振动和变速搅乱后对流现象小，v但转头结构复杂，最高转速相对要低但转头结构复杂，最高转速相对要低v容量也小一些。容量也小一些。 平抛式离心机转子平抛式离心机转子2 离心沉降设备n瓶式离心机
5、n也称平抛式离心机n结构最简单的实验室常用的低，中速离心机，n转速一般在 3000-6000rpm。2 离心沉降设备n管式离心机n液-液分离；液-固分离n结构简单n转速很高n可连续操作（液-液）2 离心沉降设备n碟式离心机n固体的沉降距离极短，分离效果较好。n碟片间的距离一般为0.52.5mm,与被分离物料的性质有关。n液-液分离；液-固分离n连续操作2 离心沉降设备多室式离心机多室式离心机n增加了沉降面积，减少了沉降距离n同时还有粒度筛分的作用n常用于抗菌素液液萃取分离n间歇式生产n管式离心机3 离心沉降的计算rz管壁沉 淀 分 离概述n 沉淀（定义）沉淀（定义） 是溶液中的溶质由液相变成固
6、相析出的过程。是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程。n沉淀具有选择性沉淀具有选择性 有选择地沉淀杂质有选择地沉淀杂质 有选择地沉淀所需成分有选择地沉淀所需成分优点：操作简单、经济、浓缩倍数高优点：操作简单、经济、浓缩倍数高优点：操作简单、经济、浓缩倍数高优点：操作简单、经济、浓缩倍数高缺点：针对复杂体系而言，分离度不高、缺点：针对复杂体系而言，分离度不高、缺点：针对复杂体系而言，分离度不高、缺点：针对复杂体系而言，分离度不高、选择性不强选择性不强选择性不强选择性不强概述n 沉淀操作常在发酵液经过过滤和离心（除去沉淀操作常在发酵液经过过滤和离心（除去不溶性杂质及细胞碎片）以后进行。不溶性杂质及
7、细胞碎片）以后进行。n操作方式可分连续法或间歇法两种，规模较小操作方式可分连续法或间歇法两种，规模较小时，常采用间歇法。不管哪一种方式操作步骤时，常采用间歇法。不管哪一种方式操作步骤通常按三步进行：通常按三步进行：蛋白质的溶解特性蛋白质的溶解特性n蛋白质是两性高分子电解质n在水溶液中，多肽链中的疏水性氨基酸残基具有向内部折叠的趋势，一般仍有部分疏水性氨基酸残基暴露在外表面，形成疏水区。疏水性氨基酸含量高的蛋白质的疏水区大，疏水性强。n亲水性氨基酸残基基本分布在蛋白质立体结构的外表面。n蛋白质表面由不均匀分布的荷电基团形成荷电区、亲水区和疏水区构成。概述n沉淀法操步骤沉淀法操步骤 ：沉淀剂粒子生
8、长收集沉淀物过滤离心概述沉淀法（1）盐析法；（2）等电点沉淀法；（3）有机溶剂沉淀法；（4）非离子型聚合物沉淀法；（5）聚电解质沉淀法；（6）高价金属离子沉淀法等。除第（3）种有机溶剂沉淀法也能适用于抗生素等小分子外，其他各种方法只适用蛋白质等大分子。分类蛋白质盐析n因此，可通过降低蛋白质周围的水化层和双电层因此，可通过降低蛋白质周围的水化层和双电层厚度（厚度（电位）降低蛋白质溶液的稳定性，实现电位）降低蛋白质溶液的稳定性，实现蛋白质的沉淀。蛋白质的沉淀。蛋白质稳定因素水化层双电层使蛋白质形成稳定的胶体溶液使蛋白质形成稳定的胶体溶液静电排斥作用静电排斥作用蛋白质盐析中性盐蛋白质脱水中和电荷沉淀
9、盐析法机理盐析法机理（1）破坏水化膜破坏水化膜，分子间易碰撞聚集，分子间易碰撞聚集， 将大量盐将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子有很强的水加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子有很强的水化力，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至化力，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失，使蛋白质分子因热运动碰撞聚集。消失，使蛋白质分子因热运动碰撞聚集。（2）破坏水化膜破坏水化膜，暴露出憎水区域，由于憎水区，暴露出憎水区域，由于憎水区域间作用使蛋白质聚集而沉淀，憎水区域越多，域间作用使蛋白质聚集而沉淀，憎水区域越多，越易沉淀。越易沉淀。（3）中和电荷中和电荷，减少静电斥力，减少静电斥力， 中性盐加入蛋白中性
10、盐加入蛋白质溶液后，蛋白质表面电荷大量被中和，静电斥质溶液后，蛋白质表面电荷大量被中和，静电斥力降低，导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之力降低，导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。间聚集而沉淀。蛋白质盐析盐析用盐的选择盐析用盐的选择n n盐析作用要强盐析作用要强n n盐析用盐需有较大的溶解度盐析用盐需有较大的溶解度n n盐析用盐必须是惰性的盐析用盐必须是惰性的n n来源丰富、经济来源丰富、经济n盐析操作蛋白质盐析直接加入固体直接加入固体(NH(NH4 4) )2 2SOSO4 4 粉末粉末，工业上常采用这种，工业上常采用这种方法，加入速度不能太快，应分批加入，并充分方法，加入速度不
11、能太快，应分批加入，并充分搅拌，使其完全溶解和防止局部浓度过高；搅拌，使其完全溶解和防止局部浓度过高；是加入硫酸铵饱和溶液是加入硫酸铵饱和溶液，在实验室和小规模生产，在实验室和小规模生产中，或中，或(NH(NH4 4) )2 2SOSO4 4 浓度不需太高时，可采用这种方浓度不需太高时，可采用这种方式，它可防止溶液局部过浓，但加量较多时，料式，它可防止溶液局部过浓，但加量较多时，料液会被稀释。液会被稀释。蛋白质盐析n阴离子阴离子：柠檬酸PO43- SO42- CH3COO- Cl- NO3-n阳离子阳离子：NH4+ K+Na+ 高价阳离子n硫酸铵硫酸铵：（1） 价廉 ；（2） 溶解度大，稳定蛋
12、白质 ；（3）水解变酸；（4）高pH 释氨，腐蚀；（5）残留产品有影响。盐析效果n影响因素蛋白质盐析pH 变化变化温度变化温度变化等电点附近有极小值等电点附近有极小值随温度升高减小，热促失水膜随温度升高减小，热促失水膜lgS蛋白质盐析盐析注意事项：盐析注意事项： (1) 稳定稳定pH 用磷酸缓冲液用磷酸缓冲液（2）硫酸铵加入后体积变大）硫酸铵加入后体积变大（3）选择饱和度）选择饱和度（4）分步盐析）分步盐析（5）初始蛋白浓度）初始蛋白浓度 S=-sS蛋白质的溶解度，蛋白质的溶解度，g/L; I离子强度，离子强度， I=1/2mizi2 mi离子离子 i的摩尔浓度；的摩尔浓度；Zi所带电荷所带电
13、荷常数，图中截距常数，图中截距Ks盐析常数，图中直线斜率盐析常数，图中直线斜率Cohn经验式经验式蛋白质溶解度与盐浓度的关系蛋白质溶解度与盐浓度的关系等电点沉淀法n原理：调调pH至等电点，使蛋白质所带净电荷为零，降至等电点，使蛋白质所带净电荷为零，降低了静电斥力，而疏水力能使分子间相互吸引，低了静电斥力，而疏水力能使分子间相互吸引，形成沉淀。形成沉淀。适用于疏水性较强的蛋白质pH=pI等电点沉淀法（1 1）适用于疏水性强的蛋白质）适用于疏水性强的蛋白质（2 2）中性盐浓度增大时，等电点向偏）中性盐浓度增大时，等电点向偏 酸方向移动，同时最低溶解度会有所增大。酸方向移动，同时最低溶解度会有所增大
14、。 （3 3）无机酸通常价格便宜，无毒）无机酸通常价格便宜，无毒（4 4）蛋白质对低）蛋白质对低pH pH 敏感，易失活敏感，易失活操作注意事项等电点沉淀实例n从猪胰脏中提取胰蛋白酶原：从猪胰脏中提取胰蛋白酶原：胰蛋白酶胰蛋白酶原的原的pIpI8.98.9，可先于，可先于pH 3.0pH 3.0左右进行等电点沉淀，左右进行等电点沉淀，除去共存的许多酸性蛋白质除去共存的许多酸性蛋白质( (pIpI=3=3O)O)。n工业生产胰岛素工业生产胰岛素( (pIpI5.3)5.3)时时：先调：先调pHpH至至8.08.0除去碱性蛋白质，再调除去碱性蛋白质，再调pHpH至至3.03.0除去酸性蛋白质除去酸
15、性蛋白质( (同时加入一定浓度的有机溶剂以提高沉淀效果同时加入一定浓度的有机溶剂以提高沉淀效果) )。等电点沉淀法等电点沉淀法细胞色素细胞色素C洗脱液（离交）洗脱液（离交）+ 硫酸胺（饱和度硫酸胺（饱和度86%） 低温离心低温离心 上清液调上清液调 pH4.8- 5.1 产产物物 沉淀（杂蛋白）沉淀（杂蛋白）有机溶剂沉淀法l l概概念念：在在含含有有溶溶质质的的水水溶溶液液中中加加入入一一定定量量亲亲水水的的有有机机溶溶剂剂，降降低低溶溶质质的的溶溶解解度度，使使其其沉沉淀淀析析出。出。优点在于：优点在于：1）分辨能力比盐析法高，即蛋白质等只在一个比较窄的有机溶剂浓度下沉淀；2）沉淀不用脱盐，
16、过滤较为容易；缺点是缺点是1 1）对具有生物活性的大分子容易引起变性失活，2）操作要求在低温下进行。3）成本高nA 降低溶剂介电常数降低溶剂介电常数.nB 破坏水化膜：破坏水化膜：nC 相反力：相反力：有机溶剂沉淀法机理有机溶剂沉淀法机理减小溶剂的极性，从而削弱了溶剂分子与蛋白质减小溶剂的极性，从而削弱了溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，分子间的相互作用力，从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子，破从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子，破坏水化层坏水化层疏水基团暴露并有机溶剂疏水基团结合形疏水基团暴露并有机溶剂疏水基团结合形成疏水层成疏水层降低介电常数破坏水化膜常用的有机溶剂沉析剂选择依据
17、：选择依据：n水溶性要好水溶性要好n介电常数要小介电常数要小n致变性作用要小（甲醇）致变性作用要小（甲醇）n毒性要小、挥发性适中毒性要小、挥发性适中n容易获取容易获取n沉淀蛋白质和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。沉淀蛋白质和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。沉淀核酸、糖、氨基酸和核苷酸最常用的是乙醇。沉淀核酸、糖、氨基酸和核苷酸最常用的是乙醇。乙醇是最常用的沉淀剂乙醇是最常用的沉淀剂n乙醇：沉析作用强，挥发性适中，无毒，常用于乙醇：沉析作用强，挥发性适中，无毒，常用于蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的沉析；蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的沉析；n丙酮：沉析作用更强，用量省，但毒性大，应用丙酮：沉析作用更强
18、，用量省，但毒性大，应用范围不广；范围不广；温度温度使用有机溶剂沉淀时，操作必须在低温下进行，使用有机溶剂沉淀时，操作必须在低温下进行，有机溶剂沉淀法的影响因素有机溶剂沉淀法的影响因素pHpH值：值： pHpH多控制在待沉蛋白质的等电点附近。多控制在待沉蛋白质的等电点附近。 举例：固体发酵生产举例：固体发酵生产-淀粉酶的提取工艺研究淀粉酶的提取工艺研究 -淀粉酶（米曲霉）菌体淀粉酶（米曲霉）菌体 + 水水 过滤过滤 水抽提清液水抽提清液 加乙醇（加乙醇（70%）搅拌）搅拌 -淀粉酶淀粉酶n n* pH影响影响n 收率收率% 酶活酶活 n 收率收率n 酶活酶活n 6.5 pHn * 适宜的适宜的pH 5.6 6.0 * 温度影响温度影响 收率收率% 酶活酶活 酶活酶活 收率收率 10 20 T * 适宜的温度适宜的温度10 20 例：例： 调调pH4.2 上清液上清液胰岛素粗品溶液胰岛素粗品溶液 30 % 丙酮丙酮 沉淀（杂蛋白）沉淀（杂蛋白）调调pH6.0 上清液上清液Zn2+ 胰岛素锌盐胰岛素锌盐
