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1、 聚合酶链反应（p polymerase olymerase c chain hain r reaction,eaction,PCRPCR）胳力压氖坝瓦叛珐赋妊酝拼腕猴涎箭邢弧挺焚顺树调初赶托淑舞狗近纵饰learningPCRhlearningPCRh PCRPCR（ Polymerase Polymerase Chain Chain ReactionReaction）聚聚合合酶酶链链反反应应是是一一种种体体外外酶酶促促的的DNADNA聚聚合合反反应应，具具有有快快速速（数数小小时时）、灵灵敏敏（ngng甚甚至至fgfg级的靶级的靶DNA DNA ）的特点。）的特点。 自自发发明明以以来来便便
2、以以惊惊人人的的速速度度发展，并且得到了广泛的应用。发展，并且得到了广泛的应用。圭谣覆蒋啊雁修岔夏燃想鸡陀闲偷取疟四菠胜蹲倪驭肿堆汾裁淌另坚里离learningPCRhlearningPCRhPCRPCR技术的诞生与发展技术的诞生与发展技术的诞生与发展技术的诞生与发展19851985年年年年，美国美国美国美国PE-cetusPE-cetus公司人类遗传研究室的公司人类遗传研究室的公司人类遗传研究室的公司人类遗传研究室的KaryKarymullismullis发明了具有划时代意义的发明了具有划时代意义的发明了具有划时代意义的发明了具有划时代意义的PCRPCR技术；技术；技术；技术；1988198
3、8年年年年，美国美国美国美国PE-cetusPE-cetus公司推出公司推出公司推出公司推出世界上第一台世界上第一台世界上第一台世界上第一台PCRPCR热循环仪，从而使热循环仪，从而使热循环仪，从而使热循环仪，从而使PCRPCR反应自动化反应自动化反应自动化反应自动化19931993年年年年，KaryKarymullismullis因发明因发明因发明因发明PCRPCR技术获得技术获得技术获得技术获得诺贝尔化学奖；诺贝尔化学奖；诺贝尔化学奖；诺贝尔化学奖；19951995年年年年，定量定量定量定量PCRPCR仪诞生，使定量研究仪诞生，使定量研究仪诞生，使定量研究仪诞生，使定量研究DNADNA靶序
4、列靶序列靶序列靶序列成为现实。成为现实。成为现实。成为现实。碎殃皮矢酮既掸澳磅赂碎田坛确尧洼赐酥芳捎烁汕瓤兼釉牛级银病材狼夸learningPCRhlearningPCRh 第一节第一节 PCR PCR的原理与基本操作的原理与基本操作一、一、PCRPCR的原理：的原理： 实实际际上上是是一一个个在在模模板板DNADNA、引引物物(primer(primer模模板板片片断断两两端端的的已已知知序序列列）和和4 4种种脱脱氧氧核核苷苷酸酸等等存存在在的的情情况况下下，DNADNA聚聚合合酶酶依依赖赖的的酶酶促促聚聚合合反反应应，扩扩增增特特异异性性取决于引物与模板取决于引物与模板DNADNA的特异
5、结合。的特异结合。宽钝肘午套荡惠掂浅降炳毡酶辗听煽朵邯涌韧紊韵瓜惦溯创么纹育点窝变learningPCRhlearningPCRh投换淡疚侦茎膳寺咸有麓偿朵已纱踩哑套诗哺庞汐煤制影第脏河蹈辞吼彦learningPCRhlearningPCRh引物（引物（primer） 酶酶 （Taq DNA polymerase） dNTP （dATP,dGTP,dCTP,dTTP） 模板模板 （template） Mg2+ （magnesium）PCRPCR反应五要素反应五要素辱威泰函约骏宅邢嫡胳搭瘦茧傻忙留涧妙标亚停翟津抨貉魏邮蛾畅树陇黍learningPCRhlearningPCRh主要有三步：主要有三
6、步： 1 1、变性：、变性： 加加热热使使模模板板DNADNA双双链链间间的的氢氢键键断断裂裂而而形形成成2 2条条单链。单链。2 2、退火（复性）：、退火（复性）： 突然降温后模板突然降温后模板DNADNA与引物按碱基配对的原与引物按碱基配对的原则互补结合。则互补结合。 也存在两条模板链之间的结合，但由于引也存在两条模板链之间的结合，但由于引物的高浓度、结构简单等特点，主要的结合发物的高浓度、结构简单等特点，主要的结合发生在引物和模板之间。生在引物和模板之间。枕沧兢瞎求纶乘正串屁尤漾烛各扶谭砍湃林垒茵哨萎忌卑荣助岩知刃旭赤learningPCRhlearningPCRh3 3、延伸：、延伸：
7、 在在DNADNA聚聚合合酶酶及及镁镁离离子子等等存存在在的的条条件件下下，从从引引物物的的33端端开开始始，按按碱碱基基互互补补的的原原则则，合合成与模板链互补的新成与模板链互补的新DNADNA链。链。 上上述述三三步步为为一一个个循循环环，通通过过温温度度控控制制，重重复复变变性性、退退火火、延延伸伸的的过过程程，PCRPCR的的产产物物以以指指数数的的方方式式增增加加，理理论论上上讲讲每每个个循循环环产产物物的的量量增增加加1 1倍，倍，n n个循环后产物的量应为个循环后产物的量应为2 2n n 。珍庐豹毅侄佑祝戏追捍侄瘦愉援衰莫拨醚酝阅蛮煎劝令又情独句岔航蜂蚌learningPCRhl
8、earningPCRh司蚂伪巴涸屈裂洋泣讫本圆闪热胰厄漳氧谅掠咆链走愁听葡仇颐炕非谱瑞learningPCRhlearningPCRh夸宝束脸膜潦愉各洪蓑堰溪奈陌乏蛀肿泄摔峨泼驻郎绵彻峨隅板狰懦篮八learningPCRhlearningPCRh1个循环：个循环：1条条2条条212个循环：个循环：2条条4条条22惩戮御沟弱纪舒拴纂厨园扯签界名竞居著直檄傍洱烈膊固坟珐碰糠挽认瓦learningPCRhlearningPCRh蚁腆牲旅天敞爽妓吼蛀及棒愉往带肘竞祟缔痘才屁鲸滁蔚寿炽柒蔑遵阂宏learningPCRhlearningPCRh二、基本操作二、基本操作（一）试剂：（一）试剂： 1 1、引物
9、：、引物：扩增片断不同引物不同。扩增片断不同引物不同。2 2、TaqTaq聚合酶：聚合酶：5u/l5u/l（T Thermus hermus aqaquaticusuaticus 嗜热水生菌）。嗜热水生菌）。兜铬匝庞眺袱隙讽齐英猾簧荆吕征瑶晰掠涨叛颧婴碗玩造闸爪骏贞朋泊庆learningPCRhlearningPCRh 3 3、PCRPCR反应缓冲溶液：反应缓冲溶液：一般随一般随TaqTaq酶提供。注意酶提供。注意有的含有有的含有MgMg2+2+ ，有的不含，需自己配制时，有的不含，需自己配制时，1010浓度如下：浓度如下： 250500mmol/L KCl 250500mmol/L KCl
10、100500mmol/L Tris-Cl 100500mmol/L Tris-Cl（pH 8.4pH 8.4） 1520mmol/L MgCl 1520mmol/L MgCl2 2 0.5% Tween-20 0.5% Tween-20 1mg/L BSA( 1mg/L BSA(小牛血清蛋白小牛血清蛋白) ) 对酶有保护作用对酶有保护作用4 4、dNTPsdNTPs： 20200mol/L 4 20200mol/L 4种等量的种等量的dNTPdNTP。5 5、模板：、模板：10102 210105 5车吼无盈耗慷狗酥汇喇钻般魄券肄燎猫盅聂指躁唾石锈雏锹鲜泄分好插慧learningPCRhlea
11、rningPCRh（二）操作方法（二）操作方法 1 1、模板处理、模板处理 2 2、加加混混合合液液各各组组分分于于0.5ml 0.5ml eppendorfeppendorf管管中中 有有100l100l、 50l50l、 25l25l等等体体系系。 5l的反应体积也有成功的例子。反应体积过大会影响加热和冷却，而过小的反应体积又容易导致温度变化不稳定，进而降低产量，甚至反应管的几何尺寸、管壁厚薄、扩增仪的加热冷却装置也能影响各循环步骤所需的时间。政彤槐睬捅钩橙比泅馋敞趣衡贱融凡矛枢肋丽园融港逢酿萎誓硼俱迂要檄learningPCRhlearningPCRh 贮存浓度终浓度终体积需加体积引物1
12、50pmol/L1pmol/ L50L 1L 引物250pmol/L1pmol/ L50L 1L dNTPs2.5mmol/L250 mol /L5L (Mg2+)1.5mmol/L10buffer1015L Taq酶5U/L0.04U /L0.4L 模板5L 三蒸水32.6L 娩斯蠢惋痒恋醋障田情脏峰狼纂疹肮汞金核堑母酬宵荐洪黄瞧晤披毅觉寓learningPCRhlearningPCRh 将反应混合物混匀反应混合物混匀: : 小片段小片段DNADNA混匀可以用漩涡振荡器混匀可以用漩涡振荡器 大片段用手指弹匀大片段用手指弹匀 离心数秒，使液体沉于管底。离心数秒，使液体沉于管底。 驻塌湍傍陌蚌隆
13、休脑灵靴努穷汇项岔鞠杀远碑扬上拒棵臃步盛圾闹诀尘掂learningPCRhlearningPCRh3 3、置循环仪中，、置循环仪中，959597 97 ， 变性变性5 510min10min。马上冰浴冷却，加马上冰浴冷却，加TaqTaq酶（酶（1u/l1u/l）2 25l5l，短暂离心，再按下述循环扩增。，短暂离心，再按下述循环扩增。4 4、扩增、扩增 变性变性 9497 3050s 9497 3050s 退火退火 2565 6090s 2565 6090s 延伸延伸 7074 60120s 7074 60120s 重复重复 2535 2535个循环。个循环。 末次循环后，在延伸温度再延时末次
14、循环后，在延伸温度再延时57min57min，以使扩增充分。，以使扩增充分。碗鸣呕夹襟廷狰板花宫洛珍涕联岗风张钻氏慧酣粱壤檄弦艾迈漫议龟汛绘learningPCRhlearningPCRh5 5、扩增完毕，取少量、扩增完毕，取少量PCRPCR产物产物510l510l，电泳紫外灯下观察，电泳紫外灯下观察结果或用其他方法检测。结果或用其他方法检测。 她秤粘察宪颐嫁绰准尖铅护政瞩合膝镶芹焊纲碌金暴顺鼠涎再递踏萨汞偶learningPCRhlearningPCRh 注意事项：注意事项： 1 1、操作尽量在冰浴上进行、操作尽量在冰浴上进行 2 2、几几个个标标本本一一起起做做时时，应应计计算算出出总总量
15、量，全全加加到到一一个个eppendorfeppendorf管管中中混混匀匀后后，再再分分装，最后再分别加模板。装，最后再分别加模板。 1) 1)量准。量准。 2 2）快。）快。 3 3）污染机会少。）污染机会少。 4 4）各标本之间误差少。）各标本之间误差少。 扣拆插沧膏共问纤嗓罩碴严及屎劳铡油嫁嘲串福凳悬坎旷板燥假现啮畴峰learningPCRhlearningPCRh3 3、计计算算用用量量时时应应根根据据终终浓浓度度、终终体体积积，以以及及贮贮存存液液的的浓浓度度计计算算出出所所需需各各液的体积。液的体积。华桥箍今她典肇盈辞借淮侣撒责坛在芥酞泊涂履赐凡屹痕让坍哩傻卫课敌learning
16、PCRhlearningPCRh第二节第二节 PCR PCR反应中的各种组分反应中的各种组分具歼可蜂瑚扑稻改域窘勉襟辱牟腹垂姻柄稗臼卷纹嗜乡厢脑报罐缴槽浴宁learningPCRhlearningPCRhPCRPCR反应的质量指标反应的质量指标反应的质量指标反应的质量指标PCRPCR反应的质量标准有：反应的质量标准有：反应的质量标准有：反应的质量标准有：特异性（序列选择）特异性（序列选择）特异性（序列选择）特异性（序列选择）有效性（序列产量）有效性（序列产量）有效性（序列产量）有效性（序列产量） 上述三大标准并非由单一因素所决定，因此在上述三大标准并非由单一因素所决定，因此在上述三大标准并非由
17、单一因素所决定，因此在上述三大标准并非由单一因素所决定，因此在PCRPCR反应中必须对多种参数进行联合控制和改进，但由于反应中必须对多种参数进行联合控制和改进，但由于反应中必须对多种参数进行联合控制和改进，但由于反应中必须对多种参数进行联合控制和改进，但由于PCRPCR反应中的各参数往往是相互影响的，因此任何参数反应中的各参数往往是相互影响的，因此任何参数反应中的各参数往往是相互影响的，因此任何参数反应中的各参数往往是相互影响的，因此任何参数的改进不可能同时满足特异性、有效性、准确性。的改进不可能同时满足特异性、有效性、准确性。的改进不可能同时满足特异性、有效性、准确性。的改进不可能同时满足特
18、异性、有效性、准确性。准确性（序列对错）准确性（序列对错）准确性（序列对错）准确性（序列对错）薪堑汗径镊锗狰覆骤恳沃搁伺戎清怕奸锹炎靡己爆翟倘阁石赛狗稠朋熟申learningPCRhlearningPCRh 一、引物（一、引物（primerprimer） 引物是预扩增核酸片段两端的已引物是预扩增核酸片段两端的已知序列，是保证知序列，是保证PCRPCR特异性的关键因特异性的关键因素。素。 床劈据碳幕铡昆晰柳杏午德搞事椰惨他坎城胺年夏郴奶星庐觅悦辈芜置疗learningPCRhlearningPCRh引 物 设 计引物引物的重要性引物设计的原则引物与PCR引物设计软件如何使用PrimerPremi
19、er5.0引物同源性分析雅腿料假肃憎洒捻社遏毫容听骄史币店过巨藕驭云陷持及盒韭南唯趟洱运learningPCRhlearningPCRh引物（primers)引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。3355Sense primerAntisense primer膳项擞曼铬壮链姚娱靶忠堕绘负炸戴堤纹液娱碳惶考舱惯颇灼矛埂批讲爆learningPCRhlearningPCRh引物的重要性在整个PCR体系中,引物占有十分重要的地位。PCR的特异性要求引物与靶DNA特异结合，不与其他非目的DNA结合，PCR
20、的灵敏性要求DNA聚合酶能对引物进行有效的延伸，可见引物设计好坏与PCR结果密切相关。夕除绿汾臃相广魁宿被溺珍周恶跳裂罕丝辅磋蔓苗软友日亨佃趣绰绊焕欲learningPCRhlearningPCRh引物设计原则引物长度碱基分布的均衡性Tm值引物二级结构引物3端引物5端引物的内部稳定性引物的保守性与特异性扩增区域的二级结构匣捆报腺呕性撼窗娃喊书肯戚格臣颅逞掷匡糜相雕支西吼草充迹憎媚吟母learningPCRhlearningPCRhPCR PrimersInfoaboutpublishersofsequence-whenandwhoInfoaboutorganismInfoaboutsource
21、ofmaterial朽络硅析朵傀裳畔踊嵌革猜给镣将黍扼被洽讼帛妹骄颗俊米蓟饼痊沤浇匹learningPCRhlearningPCRhPCR PrimersInfoabouttranslation,capping,DNAsequence惭宴赂域泉锭结磅扭忱权膨咬饰履堕巧硷萝原篡状蝶渗摧渭阜咙贮悠乔慷learningPCRhlearningPCRhPCR PrimersIdentifygenesequenceinmRNAsequenceselectprimerstouseforRTandPCR1 gtattaataa tgtcgacttc aggaactggt aagatgactc gcgcgca
22、gcg tcgagctgcc 61 gctcgtagaa atcgtcggac cgctggggtc caaccagtaa ttgtcgaacc aatcgctgct 121 ggccaaggca aggccattaa agcgattgca ggatacagca tatcaaagtg ggaggcgtct 181 tcggacgcga ttacagcgaa agccaccaat gccatgagta tcactctgcc ccatgagctc 241 tcttctgaaa agaataagga gcttaaggtc ggcagagtgc tgctttggtt gggacttctt 301 cc
23、tagcgttg ctgggaggat taaggcttgt gttgctgaga aacaggcaca ggccgaggcc 361 gcttttcaag tagccttggc ggttgctgac tcctcgaaag aggtggtcgc ggccatgtat 421 acggacgcct ttcgaggggc gactctgggg gatttgctta atctccagat ttatctgtat 481 gcatctgaag cagtgcctgc taaggcggtc gttgtacatc tagaagttga gcacgtaagg 541 cctacgttcg atgacttctt
24、caccccggtt tataggtagt gcccctgctc ggagagcccc 601 tgactgggtt aaagtcacag gccccttgtc tcaggtagag accctgtcca ggtaggacac 661 tttggctaag gttaaaagct tgttgaatca gtacaataac tgatagtcgt ggtttacacg 721 cagacctctt acaagagtgt ctaggtgcct ttgagagtta ctctttgctc tcttcggaag 781 aacccttagg ggttcgtgca tgggcttgca tagcaagtc
25、t tagaatgcgg gtaccgtaca 841 gtgttgaaaa acactgtaaa tctctaaaag agacca 1 gtattaataa tgtcgacttc aggaactggt aagatgactc gcgcgcagcg tcgagctgcc 61 gctcgtagaa atcgtcggac cgctggggtc caaccagtaa ttgtcgaacc aatcgctgct 121 ggccaaggca aggccattaa agcgattgca ggatacagca tatcaaagtg ggaggcgtct 181 tcggacgcga ttacagcgaa
26、 agccaccaat gccatgagta tcactctgcc ccatgagctc 241 tcttctgaaa agaataagga gcttaaggtc ggcagagtgc tgctttggtt gggacttctt 301 cctagcgttg ctgggaggat taaggcttgt gttgctgaga aacaggcaca ggccgaggcc 361 gcttttcaag tagccttggc ggttgctgac tcctcgaaag aggtggtcgc ggccatgtat 421 acggacgcct ttcgaggggc gactctgggg gatttgct
27、ta atctccagat ttatctgtat 481 gcatctgaag cagtgcctgc taaggcggtc gttgtacatc tagaagttga gcacgtaagg 541 cctacgttcg atgacttctt caccccggtt tataggtagt gcccctgctc ggagagcccc 601 tgactgggtt aaagtcacag gccccttgtc tcaggtagag accctgtcca ggtaggacac 661 tttggctaag gttaaaagct tgttgaatca gtacaataac tgatagtcgt ggttta
28、cacg 721 cagacctctt acaagagtgt ctaggtgcct ttgagagtta ctctttgctc tcttcggaag 781 aacccttagg ggttcgtgca tgggcttgca tagcaagtct tagaatgcgg gtaccgtaca 841 gtgttgaaaa acactgtaaa tctctaaaag agacca 张明颈厉代庚晨王伶撅闰屏傲倚鸵赔圭烘落气革饭笆逸哈逐敝权旬裕槛坟learningPCRhlearningPCRh引物长度 一般为15-30个核苷酸，在做长片段PCR或做某些特殊的PCR时应使用较长的引物，但最多不超过50个
29、核苷酸。姥瘟薄龄肥汝思颊麓烘沏蔬冻钥幸燃寿倚艘嵌品寿诸恳新偏墒扳药否唱赞learningPCRhlearningPCRh碱基分布的均衡性同一碱基连续出现不应超过5个GC含量一般40-60%lGC含量太低导致引物Tm值较低，使用较低的退火温度不利于提高PCR的特异性lGC含量太高也易于引发非特异扩增。丫川另寅趣犊宝汤夏氖中傻前少界低肌宪司础觅泌横熟框层俏丝术墓逗闰learningPCRhlearningPCRh引物Tm值一般要求：55-65。计算：l对于低于20个碱基的引物，Tm值可根据Tm=4(G+C)+2(A+T)来粗略估算l对于较长引物，Tm值则需要考虑热动力学参数，从“最近邻位”的计算方
30、式得到，这也是现有的引物设计软件最常用的计算方式。lTm=H/(S+R*ln(C/4)+16.6log(K+/(1+0.7K+)-273.15逾埃花晌恍彰挨蒸酿柑松语教蛛酗讯棕套塑慕怪俩啪架舟尉悲诽斜填答耸learningPCRhlearningPCRh引物二级结构引物二聚体l尽可能避免两个引物分子之间3端有有较多碱基互补发夹结构l尤其是要避免引物3端形成发夹结构，否则将严重影响DNA聚合酶的延伸。输磕矫阁谨公半饥盗巡骋凤练闲这放育另狰回莉赚驭隆裔疏拔经旁诈倾周learningPCRhlearningPCRh引物3端引物的延伸从3端开始，因此3端的几个碱基与模板DNA均需严格配对，不能进行任何
31、修饰，否则不能进行有效的延伸，甚至导致PCR扩增完全失败。考虑到密码子的简并性，引物3端最后一个碱基最好不与密码子第三个碱基配对。甜涪鞠车备洗钮耘祥煞鄙壳冉号壮扳月困咽赡忍惕摊窍稍碱充然马咖光革learningPCRhlearningPCRh引物5端引物5端可以有与模板DNA不配对碱基，在5端引入一段非模板依赖性序列。l5端加上限制性核酸内切酶位点序列（酶切位点5端加上适当数量的保护碱基）。l5端的某一位点修改某个碱基，人为地在产物中引入该位点的点突变以作研究。l5端标记放射性元素或非放射性物质（如生物素、地高辛等）。龚徊神爬倒芍疼掏惕嗡员却苇牵弊钓刽嫩移议包祟长起带教砧乍漏列貉辉learni
32、ngPCRhlearningPCRh 引物的内部稳定性过去认为，引物3端应牢牢结合在模板上才能有效地进行延伸，故3端最好为G或C。现在的观点认为，引物的5端应是相对稳定结构，而3端在碱基配对的情况下最好为低稳定性结构，即3端尽可能选用A或T，少用G或C。l仅仅3端几个碱基与非特异位点上的碱基形成的低稳定性结构是难以有效引发引物延伸的。l如果3端为富含G、C的结构，只需3端几个碱基与模板互补结合，就可能引发延伸，造成假引发。村筋川瓤育馒渺翠畦垣灌姿质堕致奈水搪嚏踏迹迄件沁咒招潜忌宛亦责居learningPCRhlearningPCRh引物的保守性与特异性保守性：通用引物检测同一类病原微生物尽可能
33、多的型别特异性：避免非特异性扩增蔓豪抽办斌铣搐尔蚁蟹愧酉泻闰鹰赐剩铝透瞥坍落楷间术腥杯刺茶捻懂札learningPCRhlearningPCRh扩增区域的二级结构模板DNA的某些区域具有高度复杂的二级结构，在选择引物时，应使扩增区域尽可能避开这些区域。l扩增区域的自由能（G。）小于58.61kJ/moll引物Tm值与PCR产物Tm值相差一般不超过30lTmproduct=81.5+16.6log(K+/(1+0.7K+)+0.41(%G+%C)-500/length慰浓骑岗遮暮疟淬拄服糕劣寓糊顽弊刮榨欠娥实蒙锐怎身液主唯誉吩品颖learningPCRhlearningPCRh引物与PCR引物浓
34、度：一般为0.1-0.5umol/Ll引物浓度(uM)=nOD33/（A312C288G328T303-61）/VH2OVH2O(单位：L)退火温度l最适退火温度（TaOpt）=0.3(Tmofprimer)+0.7(Tmofproduct)25l一般采用较引物Tm值低5作为PCR退火温度。蛆宝恭翠土肌服榨趁谨予冉舔敦操簧娇疫旭手水刨氰吁铂鲁欲活兼铰砸虱learningPCRhlearningPCRh引物设计软件PrimerPremier5.0l生物软件网下载l安装后，用文本编辑器打开WIN.INI，将vspace=DU改为vspace=PU便可以使用全部功能。Oligoprimer3TheP
35、rimerGeneratorNetPrimer掺鼠倒狗涕哥涪铁赘涅旦琶堡建慕拾闷陪场雾拥毛鸵冉迸巨颁坐浇血园推learningPCRhlearningPCRh如何使用Primer Premier 5.0引物设计l一般引物设计l5带酶切位点引物设计l巢式PCR引物设计l多重PCR引物设计探针设计引物评析处喉摸引拟缠巧妊隶爆闸甸涝娟掇藻茅搬宏肖哪毒师亏丝黍促陋晕励嫂叙learningPCRhlearningPCRh引物同源性分析用Blastn软件进行同源性比较l尽可能选择与非目的基因同源性小的序列作为引物l选择3端与非目的基因不同源的序列作为引物l选择两个引物3端与同一非目的基因不同源的序列作为引
36、物峡列六罐埂日绎绰端仇驻润甚侮眶廊平睦润面尝色遵龚骏伪做诣讨右短毫learningPCRhlearningPCRh（一）引物的设计原则（一）引物的设计原则1 1、一般性原则、一般性原则（1 1）长度：）长度：1530bp1530bp。 过过长长，最最适适延延伸伸温温度度会会超超过过TaqTaq酶酶的的最最适适温度温度7474，从而降低产物的特异性。，从而降低产物的特异性。盖际手窑宰包珠瑚反潘树暴薄吊衫函酒哆专细派个蛆篮择描腰图康哭聋控learningPCRhlearningPCRh（2）G+C含量：含量： 引物序列中的引物序列中的GC含量应在含量应在35%-65%之间，之间，最好在最好在45%
37、-55%范围内。如果因靶序列的范围内。如果因靶序列的原因，引物不得不含有原因，引物不得不含有过高过高的的GC碱基，那么碱基，那么就在其就在其5端设计一串端设计一串A或或T；同样，如果引物；同样，如果引物中的中的AT含量过高，就在其含量过高，就在其 5端设计一串端设计一串G或或C，以便将整条引物的以便将整条引物的GC含量控制在合适的含量控制在合适的范围内。范围内。 筛诧鞠鹊抖识孜躺龙螺栽减俐辗酱锰桑骋讫轰隘剂奥麦州启阁知瞻谅颇御learningPCRhlearningPCRh（3 3）碱碱基基分分布布的的随随机机性性：应应避避免免连连续续出出现现4 4个个以以上上的的单单一一碱碱基基。尤尤其其是
38、是不不应应在在其其33端端出出现现超超过过3 3个个的的连连续续G G或或C C，否否则则会会使使引物在引物在G+CG+C富集序列区错误引发。富集序列区错误引发。（4 4）引引物物自自身身：不不能能含含有有自自身身互互补补序序列列，否则会形成发夹一样的结构。否则会形成发夹一样的结构。苍境与初耍货楚啡部仟窃映架吗疗正观垒艳掏你蒜乙踪甭骇裕砸拾臃几禄learningPCRhlearningPCRh （5 5）引引物物之之间间：2 2个个引引物物之之间间不不应应有有多多于于4 4个个的的互互补补或或同同源源碱碱基基，不不然然会会形形成成引引物二聚体，尤应避免物二聚体，尤应避免33端的互补重叠。端的互
39、补重叠。 （6 6）特异性：）特异性：在一般情况下，并不要求在一般情况下，并不要求引物与模板的序列达到引物与模板的序列达到100%100%互补，但尽可互补，但尽可能高的互补程度是必要的。能高的互补程度是必要的。 与非特异扩增序列的同源性小于与非特异扩增序列的同源性小于70%70%，或少于连续，或少于连续8 8个的互补碱基。个的互补碱基。 捡日荣摘兰缘谁莫球诅倚侥鼠昏谁凶避清今示耘皆惨歉碳舱鬃挽欧藻急阑learningPCRhlearningPCRh2 2、引引物物的的33端端：引引物物的的延延伸伸从从33端端开开始始，引引物物的的33端端很很大大程程度度上上影影响响TaqTaq酶的延伸效应。酶
40、的延伸效应。 所所以以33端端不不能能有有任任何何修修饰饰，不不能能形形成成二二级级结结构构，一一般般情情况况下下，不不能发生错配，否则影响产量。能发生错配，否则影响产量。 比比如如：本本来来应应该该是是A-TA-T配配对对，A-AA-A或或A-G,A-G,会降低会降低PCRPCR产量。产量。辰侍怯乔谦酋也介绅楔瘩炒腆总挝祷骨钦乙毙悟蚂隆释蝎俏僚斗柑豌气色learningPCRhlearningPCRh3、避开产物的二级结构区、避开产物的二级结构区 某某些些引引物物无无效效的的原原因因是是产产物物重重复复区区二二级级结结构构的的影影响响，因因此此选选择择扩扩增增片片段段时时应应注注意意避避开开
41、二二级级结结构构区区。有有些些计计算算机机软软件件可可帮帮助助确确定定该区域。该区域。 目目前前在在引引物物的的选选择择中中已已广广泛泛应应用用计计算算机机软软件件及及在在线线工工具具。我我们们输输入入一一段段序序列列，它它会会自自动动设设计计引引物物，然然后后进进行行分分析析，比比如如G+CG+C含含量等。量等。 驴乏抨午高姨蛾辑互财彻侨躁法狰扮爪叉揭眺木揪秃涉贞鹿储反丸剁轻虾learningPCRhlearningPCRh（二二）合合成成引引物物的的质质量量：PCRPCR引引物物合合成成后后需需经经纯纯化以去除合成产物中的不完整序列等杂质。化以去除合成产物中的不完整序列等杂质。 一一般般请
42、请公公司司合合成成，根根据据纯纯化化方方式式和和引引物物的的量不同量不同 现现在在公公司司服服务务很很全全面面。你你可可以以直直接接在在引引物物两两端端加加上上修修饰饰或或标标记记，比比如如加加上上限限制制性性酶酶切切位位点。将来产物扩增后可以直接克隆。点。将来产物扩增后可以直接克隆。尸锚讨乡江议曰塑邓侗苗甥因爸菌筋末售嫌泵走札瞪妓骋拳袍霄糜桂频颗learningPCRhlearningPCRh（三）引物的浓度（三）引物的浓度 测测260nm260nm出出的的光光吸吸收收值值，然然后后根根据据下下面面公式计算。公式计算。 合合成成引引物物的的重重量量（总总微微克克数数）=33g=33g总总OD
43、OD值值（光吸收值）（光吸收值） 合合成成界界认认为为：1 1单单位位ODOD值值的的DNADNA量量相相当当于于33g33g。 引物引物molmol数数=g=g数数/(330bp/(330bp数数) ) 一般直接标明摩尔数。一般直接标明摩尔数。膝喉圈屹狸逢艳猩普灭酱霍肩捣徊虚加珐断眩省惕痢筹添积逃必蚊捏遮挤learningPCRhlearningPCRh( (四四四四)PCR)PCR引物的使用引物的使用引物的使用引物的使用PCRPCR引物引物引物引物的标准使用范围：的标准使用范围：的标准使用范围：的标准使用范围：0.1-1.00.1-1.0m m m mMM，0.2-0.50.2-0.5m
44、m m mMM 特异性的改进：特异性的改进：特异性的改进：特异性的改进：降低降低降低降低引物引物引物引物和和和和dNTPdNTP的浓度可以在很大的浓度可以在很大的浓度可以在很大的浓度可以在很大程度上改善程度上改善程度上改善程度上改善PCRPCR扩增反应的特异性，高浓度的引物往扩增反应的特异性，高浓度的引物往扩增反应的特异性，高浓度的引物往扩增反应的特异性，高浓度的引物往往会导致非特异性的退火及副产物形成，同时也会促往会导致非特异性的退火及副产物形成，同时也会促往会导致非特异性的退火及副产物形成，同时也会促往会导致非特异性的退火及副产物形成，同时也会促进引物二聚体的产生。在模板量一定的情况下，降
45、低进引物二聚体的产生。在模板量一定的情况下，降低进引物二聚体的产生。在模板量一定的情况下，降低进引物二聚体的产生。在模板量一定的情况下，降低引物浓度实际上也是降低引物与模板的分子之比。引物浓度实际上也是降低引物与模板的分子之比。引物浓度实际上也是降低引物与模板的分子之比。引物浓度实际上也是降低引物与模板的分子之比。有效性的改进：有效性的改进：有效性的改进：有效性的改进：增加引物与模板的分子比；增加引物与模板的分子比；增加引物与模板的分子比；增加引物与模板的分子比；如果引物如果引物如果引物如果引物中有不配对的碱基，则适当降低引物的浓度。中有不配对的碱基，则适当降低引物的浓度。中有不配对的碱基，则
46、适当降低引物的浓度。中有不配对的碱基，则适当降低引物的浓度。 往父霜诉累著例企翁晌呈谋蛋辽宗邹帅驹层屉锰富塘弹朔伸噶式沥匆使髓learningPCRhlearningPCRh 二、二、DNADNA聚合酶聚合酶 TaqTaq聚聚合合酶酶是是从从（Thermus Thermus aquaticusaquaticus）嗜嗜热热菌中提取出的耐热酶。菌中提取出的耐热酶。 9595仍仍有有活活性性，但但长长时时间间的的高高温温对对其其活活性性也有影响。也有影响。 其活性半衰期：其活性半衰期：922h922h 95,40min 95,40min 97.5,5min 97.5,5min 该酶的应用浓度为：该酶
47、的应用浓度为：12.5u/100l12.5u/100l。智录落亥屯防靡良式盼宇遍觅届柞偿送希抨峻欧焊俱扯缘港愁井踞序刻碴learningPCRhlearningPCRhPCR扩增反应的精确性扩增反应的精确性PCRPCR的的DNADNA聚合酶与扩增的精确性聚合酶与扩增的精确性用于用于PCR的的DNA聚合酶简介聚合酶简介DNA聚合酶对聚合酶对PCR精确性的重要影响精确性的重要影响DNA聚合酶的使用聚合酶的使用抠景津脚惑肝农森瞬句材屠怕孩辟已晒陀吩沉呕义午烃菲柑流挞窑升抢洁learningPCRhlearningPCRhPCRPCR扩增反应的精确性扩增反应的精确性扩增反应的精确性扩增反应的精确性利用
48、利用利用利用PCRPCR技术扩增技术扩增技术扩增技术扩增DNADNA靶序列的一个重要问题是靶序列的一个重要问题是靶序列的一个重要问题是靶序列的一个重要问题是这种这种这种这种DNADNA体外聚体外聚体外聚体外聚合反应的序列忠实程度，即合反应的序列忠实程度，即合反应的序列忠实程度，即合反应的序列忠实程度，即DNADNA扩增扩增扩增扩增产物序列的准确率。产物序列的准确率。产物序列的准确率。产物序列的准确率。PCRPCR反应的反应的反应的反应的准确率远远低于细胞准确率远远低于细胞准确率远远低于细胞准确率远远低于细胞内的内的内的内的DNADNA聚合反应，除了缺少完善的聚合反应，除了缺少完善的聚合反应，除
49、了缺少完善的聚合反应，除了缺少完善的DNADNA聚合校正系聚合校正系聚合校正系聚合校正系统外，影响统外，影响统外，影响统外，影响PCRPCR反应反应反应反应准确率的因素还包括：准确率的因素还包括：准确率的因素还包括：准确率的因素还包括：DNADNA聚合酶的保真性能（主要因素）聚合酶的保真性能（主要因素）聚合酶的保真性能（主要因素）聚合酶的保真性能（主要因素）DNADNA链的物理损伤链的物理损伤链的物理损伤链的物理损伤PCRPCR反应体系的洁净度反应体系的洁净度反应体系的洁净度反应体系的洁净度扳一惊汁础冯蘑脐驶演榔层配水元纬詹抬由扫璃旧枉酿吗骄拟痕券蛙李涪learningPCRhlearning
50、PCRhDNADNA聚合酶对聚合酶对聚合酶对聚合酶对PCRPCR精确性的重要影响精确性的重要影响精确性的重要影响精确性的重要影响 DNADNA聚合酶的保真性主要取决于其聚合酶的保真性主要取决于其聚合酶的保真性主要取决于其聚合酶的保真性主要取决于其335555的核酸外的核酸外的核酸外的核酸外切酶活性，它出错率在每轮延伸每核苷酸切酶活性，它出错率在每轮延伸每核苷酸切酶活性，它出错率在每轮延伸每核苷酸切酶活性，它出错率在每轮延伸每核苷酸1.6X101.6X1066-2.1X102.1X1044范围内。范围内。范围内。范围内。DNADNA聚合酶负责对错误掺入的碱基进聚合酶负责对错误掺入的碱基进聚合酶负
51、责对错误掺入的碱基进聚合酶负责对错误掺入的碱基进行校正。相关研究结果表明，行校正。相关研究结果表明，行校正。相关研究结果表明，行校正。相关研究结果表明，DNADNA聚合酶的碱基掺入错聚合酶的碱基掺入错聚合酶的碱基掺入错聚合酶的碱基掺入错误可能发生在其延伸阶段的五种活性：误可能发生在其延伸阶段的五种活性：误可能发生在其延伸阶段的五种活性：误可能发生在其延伸阶段的五种活性：与与与与dNTPdNTP的结合特异性的结合特异性的结合特异性的结合特异性 磷酸二酯键的形成速率磷酸二酯键的形成速率磷酸二酯键的形成速率磷酸二酯键的形成速率 焦磷酸的释放速率焦磷酸的释放速率焦磷酸的释放速率焦磷酸的释放速率 碱基错
52、误掺入之后的持续延伸性碱基错误掺入之后的持续延伸性碱基错误掺入之后的持续延伸性碱基错误掺入之后的持续延伸性 335555的核酸外切活性的强弱的核酸外切活性的强弱的核酸外切活性的强弱的核酸外切活性的强弱哈铱幌佣设咐避舟葛师嗡硕元伶恕授蚜锋膊讫知舒螟渠帆乐栋闺架啦悲跑learningPCRhlearningPCRh用于用于用于用于PCRPCR的的的的DNADNA聚合酶简介聚合酶简介聚合酶简介聚合酶简介TaqDNATaqDNA聚合酶的出错率较高（聚合酶的出错率较高（聚合酶的出错率较高（聚合酶的出错率较高（2.1X102.1X102.1X102.1X10-4-4），因为），因为），因为），因为它没有它
53、没有它没有它没有335555的的核酸外切酶活性和校正功能。的的核酸外切酶活性和校正功能。的的核酸外切酶活性和校正功能。的的核酸外切酶活性和校正功能。 然而然而然而然而通过优化反应条件，可使通过优化反应条件，可使通过优化反应条件，可使通过优化反应条件，可使TaqTaq酶的聚合出错率降低到原酶的聚合出错率降低到原酶的聚合出错率降低到原酶的聚合出错率降低到原来的来的来的来的1/31/31/31/3。 TaqDNATaqDNA聚合聚合聚合聚合酶催化的聚合反应的普遍错误类型酶催化的聚合反应的普遍错误类型酶催化的聚合反应的普遍错误类型酶催化的聚合反应的普遍错误类型是由是由是由是由ATAT转换为转换为转换为
54、转换为GCGC；如果模板；如果模板；如果模板；如果模板DNADNA具有形成二级结构的具有形成二级结构的具有形成二级结构的具有形成二级结构的可能性则可能性则可能性则可能性则TaqDNATaqDNA酶还常常导致扩增产物的缺失突变。酶还常常导致扩增产物的缺失突变。酶还常常导致扩增产物的缺失突变。酶还常常导致扩增产物的缺失突变。TaqDNATaqDNA聚合酶（聚合酶（聚合酶（聚合酶（Thermus aquaticusThermus aquaticus）池免炼皮会催销妄奶曝签锣撑辽下侦皮甚馏批拍煌沧奥尤首蛆薄淀圈檄壶learningPCRhlearningPCRhTaqDNA酶在使用时应注意：酶在使用时
55、应注意： 避免稀释保存避免稀释保存TaqDNA聚合聚合酶酶TaqDNA聚合聚合酶在室温下也具有酶在室温下也具有延伸引物的活性延伸引物的活性很晋约喘阐晨熙薪抒饰杉仗网卫奋臻悍寇令埂执悠陕蹲葡灰省做舔羹抨涨learningPCRhlearningPCRh用于用于用于用于PCRPCR的的的的DNADNA聚合酶简介聚合酶简介聚合酶简介聚合酶简介KlenTaqDNAKlenTaqDNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶是一种是一种是一种是一种N N端缺失了端缺失了端缺失了端缺失了的的的的TaqDNATaqDNA聚合酶，因而没有聚合酶，因而没有聚合酶，因而没有聚合酶，因而没有5555的核酸外切酶活性；的核酸外切酶活
56、性；的核酸外切酶活性；的核酸外切酶活性；KlenTaqDNAKlenTaqDNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶的的的的MgMg2+2+最佳浓度范围很宽，最佳浓度范围很宽，最佳浓度范围很宽，最佳浓度范围很宽，因此很容易优化因此很容易优化因此很容易优化因此很容易优化反应条件；反应条件；反应条件；反应条件；KlenTaqDNAKlenTaqDNA聚合酶（聚合酶（聚合酶（聚合酶（Thermus aquaticusThermus aquaticus） 在最佳反应条件下，在最佳反应条件下，在最佳反应条件下，在最佳反应条件下，KlenTaqDNAKlenTaqDNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶出错出错出错出错率为率为
57、率为率为 5.1X105.1X1055，性能略优于，性能略优于，性能略优于，性能略优于TaqDNATaqDNA聚合酶。聚合酶。聚合酶。聚合酶。徒崇硷泡在钡玄妊鲸怕寺港踪污晃登戳惕霉播英数灶翻辅虽酋古惩芜谗旧learningPCRhlearningPCRh用于用于用于用于PCRPCR的的的的DNADNA聚合酶简介聚合酶简介聚合酶简介聚合酶简介TthDNATthDNA聚合酶在聚合酶在聚合酶在聚合酶在MnMn2+2+的存在下，能有效地反的存在下，能有效地反的存在下，能有效地反的存在下，能有效地反转录长度在转录长度在转录长度在转录长度在10001000碱基以下的碱基以下的碱基以下的碱基以下的RNARN
58、A； TthDNATthDNA聚合酶在聚合酶在聚合酶在聚合酶在MgMg2+2+的存在下，能由的存在下，能由的存在下，能由的存在下，能由DNADNA模模模模板合成板合成板合成板合成DNADNA； TthDNATthDNA聚合酶在较高的温度下仍具聚合酶在较高的温度下仍具聚合酶在较高的温度下仍具聚合酶在较高的温度下仍具有逆转录酶活性，因此有逆转录酶活性，因此有逆转录酶活性，因此有逆转录酶活性，因此能很能很能很能很好地克服好地克服好地克服好地克服RNARNA链中普遍链中普遍链中普遍链中普遍存在二级结构的难题。存在二级结构的难题。存在二级结构的难题。存在二级结构的难题。 TthDNATthDNA聚合酶（
59、聚合酶（聚合酶（聚合酶（Thermus thermophilusThermus thermophilus）萝刺吼鲍毕绵说瘫凛莱猩械蠢省呐做史殴体衣敝霜勒梭呜谷帽嗓絮绝筏容learningPCRhlearningPCRhPfuPfu是一种高保真的是一种高保真的是一种高保真的是一种高保真的DNADNA聚合酶，出错率极低；聚合酶，出错率极低；聚合酶，出错率极低；聚合酶，出错率极低；PfuDNAPfuDNA聚合酶扩增出的产物带有平头末端；聚合酶扩增出的产物带有平头末端；聚合酶扩增出的产物带有平头末端；聚合酶扩增出的产物带有平头末端；PfuDNAPfuDNA聚合酶扩增速度极快，达聚合酶扩增速度极快，达聚
60、合酶扩增速度极快，达聚合酶扩增速度极快，达1.5-2min/kb1.5-2min/kb；PfuDNAPfuDNA聚合酶（聚合酶（聚合酶（聚合酶（Pyrococcus furiosusPyrococcus furiosus）PfuDNAPfuDNA聚合酶的热稳定性很高。聚合酶的热稳定性很高。聚合酶的热稳定性很高。聚合酶的热稳定性很高。7.0X107.0X1077-1.6X10-1.6X1066囊彼怂落惜刀湾性申滚吨峦认马绝盯芝囚鸥方敌扇逼缉踌黄镶螟苍殉拜今learningPCRhlearningPCRhVentDNAVentDNA聚合酶具有聚合酶具有聚合酶具有聚合酶具有35353535的核酸外切
61、酶活性的核酸外切酶活性的核酸外切酶活性的核酸外切酶活性和校正功能，和校正功能，和校正功能，和校正功能，因此因此因此因此与其它与其它与其它与其它DNADNA聚合酶（如聚合酶（如聚合酶（如聚合酶（如TaqTaq酶酶酶酶）相比，）相比，）相比，）相比，具有相对较好的高保真性，其具有相对较好的高保真性，其具有相对较好的高保真性，其具有相对较好的高保真性，其出错率为出错率为出错率为出错率为2.4X102.4X1055-5.7-5.7X10X1055 。如果扩增长度大于如果扩增长度大于如果扩增长度大于如果扩增长度大于2kb2kb，则需要高于则需要高于则需要高于则需要高于2mM2mM的的的的MgMg2+2+
62、，而在扩增长度小于，而在扩增长度小于，而在扩增长度小于，而在扩增长度小于2kb2kb时，扩增产物的长度与时，扩增产物的长度与时，扩增产物的长度与时，扩增产物的长度与MgMg2+2+的浓度并无关联；如果模板链中存在次黄嘌呤核苷或脱的浓度并无关联；如果模板链中存在次黄嘌呤核苷或脱的浓度并无关联；如果模板链中存在次黄嘌呤核苷或脱的浓度并无关联；如果模板链中存在次黄嘌呤核苷或脱氧尿嘧啶核苷，氧尿嘧啶核苷，氧尿嘧啶核苷，氧尿嘧啶核苷，VentDNAVentDNA聚合酶不能延伸引物。聚合酶不能延伸引物。聚合酶不能延伸引物。聚合酶不能延伸引物。VentDNAVentDNA聚合酶（聚合酶（聚合酶（聚合酶（Th
63、ermococcus litoralisThermococcus litoralis） 原亨钓芭曲陷豫恋访陶砷购七旋俐幌峨孽帝直霄酗燥阿驰败躁腑札赐长仲learningPCRhlearningPCRhDeepVentDNADeepVentDNA聚合酶是一种在低温和高温条聚合酶是一种在低温和高温条聚合酶是一种在低温和高温条聚合酶是一种在低温和高温条件下均极其稳定的聚合酶，且能使用广范围的辅助件下均极其稳定的聚合酶，且能使用广范围的辅助件下均极其稳定的聚合酶，且能使用广范围的辅助件下均极其稳定的聚合酶，且能使用广范围的辅助溶剂如甲酰胺和溶剂如甲酰胺和溶剂如甲酰胺和溶剂如甲酰胺和DMSODMSO等。
64、等。等。等。 DeepVentDNADeepVentDNA聚合酶能产生长达聚合酶能产生长达聚合酶能产生长达聚合酶能产生长达14kb14kb的扩增的扩增的扩增的扩增产物，其外切酶活性比产物，其外切酶活性比产物，其外切酶活性比产物，其外切酶活性比VentDNAVentDNA聚合酶高聚合酶高聚合酶高聚合酶高 44倍，倍，倍，倍，聚合活性比聚合活性比聚合活性比聚合活性比TaqDNATaqDNA酶高酶高酶高酶高5-155-15倍，出错率比倍，出错率比倍，出错率比倍，出错率比VentVentDNADNA聚合酶低聚合酶低聚合酶低聚合酶低 22倍。倍。倍。倍。DeepVentDNADeepVentDNA聚合酶
65、（聚合酶（聚合酶（聚合酶（Pyrococcus species GB-DPyrococcus species GB-D）始铆旁持涝箱峙惧熟与综婆颇桩奈崇沾汾倔迷攀鼓跋堆饶谢挡叁酞漂器摈learningPCRhlearningPCRh 如果扩增长度大于如果扩增长度大于2 kb2 kb，则需要高于，则需要高于2 mM2 mM的的MgMg2+，而在扩增长度小于，而在扩增长度小于2 kb2 kb时，扩增产物时，扩增产物的长度与的长度与MgMg2+的浓度并无关联；的浓度并无关联； 如果模板链中存在次黄嘌呤核苷或脱氧尿如果模板链中存在次黄嘌呤核苷或脱氧尿嘧啶核苷，嘧啶核苷，Vent DNAVent DNA
66、聚合酶不能延伸引物。聚合酶不能延伸引物。苫沽龋笑物佰沟玛被玩安铝困搐遣刀纤缮搓妻磷迸饯驳评妹涅退畜沼躁轮learningPCRhlearningPCRh UlTmaUlTma是一种高保真的是一种高保真的是一种高保真的是一种高保真的DNADNA聚合酶，可以较高聚合酶，可以较高聚合酶，可以较高聚合酶，可以较高的产量扩增小于的产量扩增小于的产量扩增小于的产量扩增小于3kb3kb的的的的DNADNA靶序列，产物呈平头末靶序列，产物呈平头末靶序列，产物呈平头末靶序列，产物呈平头末端。端。端。端。UITmaDNAUITmaDNA聚合酶（聚合酶（聚合酶（聚合酶（Thermotoga maritimaTher
67、motoga maritima）拢乡哥筷剂乖链咖肝怒熟如浅庸祭棕拷札倘简挨朱乍蒲滔炸况恨坤盯耀曼learningPCRhlearningPCRhDNADNA聚合酶的使用聚合酶的使用聚合酶的使用聚合酶的使用DNADNA聚合酶的标准使用范围：聚合酶的标准使用范围：聚合酶的标准使用范围：聚合酶的标准使用范围：1-5Units/1-5Units/m m m mL L特异性的改进：特异性的改进：特异性的改进：特异性的改进：在建议使用的范围内尽可能地在建议使用的范围内尽可能地在建议使用的范围内尽可能地在建议使用的范围内尽可能地降低酶浓度。聚合酶的浓度是决定降低酶浓度。聚合酶的浓度是决定降低酶浓度。聚合酶的
68、浓度是决定降低酶浓度。聚合酶的浓度是决定PCRPCR反应成反应成反应成反应成本的本的本的本的重要参数，浓度过高不仅能降低特异性，重要参数，浓度过高不仅能降低特异性，重要参数，浓度过高不仅能降低特异性，重要参数，浓度过高不仅能降低特异性，同时也导致不必要的消耗。同时也导致不必要的消耗。同时也导致不必要的消耗。同时也导致不必要的消耗。 准确性的改进：准确性的改进：准确性的改进：准确性的改进：建议使用高保真的建议使用高保真的建议使用高保真的建议使用高保真的DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶 聚董黄娟哆弟鸯杏膳澎旷刮埠凄杭棒掐辆匀咕蛋藻羡汹港咎七撬苦尝燕聂learningPCRhlearningPC
69、Rh 三、三、PCRPCR反应缓冲液反应缓冲液1 1、MgMg2+2+ ：终浓度：终浓度 1.5mmol2.0mmol/L 1.5mmol2.0mmol/L 浓浓度度高高则则出出现现非非特特异异性性扩扩增增，过过低低则则酶酶活活性性显显著著下降。下降。 一般一般MgMg2+2+终浓度比终浓度比dNTPsdNTPs高高0.22.5mmol/L0.22.5mmol/L。 Mg+2+2的浓度影响扩增产物的特异性、引物退火、引物二聚体的形成、熔点温度、酶的活性和准确性。因此，PCR反应系统的主要优化参数是Mg+2+2的浓度，尤其当扩增产物大于1kb时，这个因素显得更为重要。经桑腿王沼蛰请狸莫娱屯煮崔蜀
70、中醛诽臃钵眯陆嗽愉浦唬净羌滨惰渊昔陨learningPCRhlearningPCRh2 2、明明胶胶、无无核核酸酸酶酶的的BSABSA、Tween-Tween-2020（0.05%0.1%0.05%0.1%）、5mmol/L5mmol/L二二硫硫苏苏糖糖醇醇（DTTDTT）对对酶酶有有一一定定的的保保护护作用。作用。3 3、Tris-ClTris-Cl（1050mmol/L1050mmol/L）是是一一种种离离子子缓缓冲冲液液。主主要要作作用用维维持持偏偏碱碱性的性的TaqTaq酶作用环境。酶作用环境。阵镑症魂血懈倍掸翰毛绎丛币夸骤柬护焚判貌咒码线舌军嘛康血咸邮勺楔learningPCRhle
71、arningPCRh 四、四、dNTPsdNTPs 1 1、工工作作浓浓度度 20200mol/L 20200mol/L 浓浓度度过过高高特特异性下降，过低反应速度下降。异性下降，过低反应速度下降。 2 2、四种、四种dNTPsdNTPs应等量。应等量。 3 3、在在标标记记探探针针等等特特殊殊PCRPCR中中，其其中中某某一一种种脱脱氧核苷酸还可被标记核苷酸所替代。氧核苷酸还可被标记核苷酸所替代。五、模板五、模板 一一般般为为10102 210105 5拷拷贝贝的的靶靶序序列列。不不同同标标本本，模板的处理方法不同。模板的处理方法不同。振芦员淌饶际先啄畅曲悼聂咙簿肚妥扛趣核湿荐蚀字寸涡总键悔
72、街所雌怀learningPCRhlearningPCRh 第三节第三节 PCR PCR反应模板的制备反应模板的制备 不不同同的的标标本本，模模板板的的制制备备不不同同，但但总总的的来来说可以分为两种情况。说可以分为两种情况。 a.DNA提取后进行PCR扩增 b.不提DNA直接扩增。 应注意：可能会因为模板中存在Taq酶的抑制剂而得到假阴性结果。 射惨宣递廖啥山宇铱呸璃喝筑酸武遵韧坪咆侦玖癸溅芝蜀酬臆沃萝旗禾愉learningPCRhlearningPCRhDNADNA和和和和RNARNA均可作为均可作为均可作为均可作为PCRPCR扩增反应的模板，但一扩增反应的模板，但一扩增反应的模板，但一扩增
73、反应的模板，但一般情况下，般情况下，般情况下，般情况下，mRNAmRNA先逆转录成先逆转录成先逆转录成先逆转录成cDNAcDNA再进行扩增。再进行扩增。再进行扩增。再进行扩增。 PCRPCR模板的来源主要有两大类：模板的来源主要有两大类：模板的来源主要有两大类：模板的来源主要有两大类：纯净物纯净物纯净物纯净物如重组质粒、制备的染色体如重组质粒、制备的染色体如重组质粒、制备的染色体如重组质粒、制备的染色体DNADNA、回收的、回收的、回收的、回收的DNADNA粗样品粗样品粗样品粗样品如粪便、脑脊髓液、血液、食物、动物贝壳、如粪便、脑脊髓液、血液、食物、动物贝壳、如粪便、脑脊髓液、血液、食物、动物
74、贝壳、如粪便、脑脊髓液、血液、食物、动物贝壳、土壤、尿液、唾液、福尔马林固定剂、组织切片、脓汁、土壤、尿液、唾液、福尔马林固定剂、组织切片、脓汁、土壤、尿液、唾液、福尔马林固定剂、组织切片、脓汁、土壤、尿液、唾液、福尔马林固定剂、组织切片、脓汁、喷嚏液、痰液等喷嚏液、痰液等喷嚏液、痰液等喷嚏液、痰液等 上述粗样品上述粗样品上述粗样品上述粗样品含有大量的含有大量的含有大量的含有大量的PCRPCR反应抑制物质，因此如何反应抑制物质，因此如何反应抑制物质，因此如何反应抑制物质，因此如何去除这些种类繁多的抑制剂或者添加必要的去除这些种类繁多的抑制剂或者添加必要的去除这些种类繁多的抑制剂或者添加必要的去
75、除这些种类繁多的抑制剂或者添加必要的PCRPCR反应反应反应反应增强增强增强增强剂显得十分重要。剂显得十分重要。剂显得十分重要。剂显得十分重要。 熬惨挪绎逻攀烙信伪吴角春骨照雀卤和纠驾材忍病谜瓢差孤胺糙戈猾壕付learningPCRhlearningPCRh从各种粗样品中去除从各种粗样品中去除从各种粗样品中去除从各种粗样品中去除PCRPCR反应抑制剂的程序不尽反应抑制剂的程序不尽反应抑制剂的程序不尽反应抑制剂的程序不尽相同，但常用的手段包括：相同，但常用的手段包括：相同，但常用的手段包括：相同，但常用的手段包括：样品稀释样品稀释样品稀释样品稀释溶剂萃取（溶剂萃取（溶剂萃取（溶剂萃取（氯仿氯仿氯
76、仿氯仿异戊基乙醇异戊基乙醇异戊基乙醇异戊基乙醇 491 491 491 491 ）乙醇沉淀乙醇沉淀乙醇沉淀乙醇沉淀高速离心高速离心高速离心高速离心超滤超滤超滤超滤妨辐锻倡蹬臭惊厢诣碾蔼叮黎笛均淳诡协扣白铜管侗邯字合猩俯矾牌街尾learningPCRhlearningPCRh粗样品中的粗样品中的粗样品中的粗样品中的PCRPCR抑制剂抑制剂抑制剂抑制剂粪便粪便粪便粪便 胆盐、胆红素（抑制浓度胆盐、胆红素（抑制浓度胆盐、胆红素（抑制浓度胆盐、胆红素（抑制浓度5050m m m mg/mLg/mL）血液血液血液血液 亚铁血红素、聚乙醇磺酸钠、亚铁血红素、聚乙醇磺酸钠、亚铁血红素、聚乙醇磺酸钠、亚铁血红
77、素、聚乙醇磺酸钠、heparinheparin（抗凝剂）（抗凝剂）（抗凝剂）（抗凝剂）土壤土壤土壤土壤腐殖物质、含铁化合物腐殖物质、含铁化合物腐殖物质、含铁化合物腐殖物质、含铁化合物植物植物植物植物 硫酸右旋糖苷硫酸右旋糖苷硫酸右旋糖苷硫酸右旋糖苷 食品食品食品食品未鉴定的抑制剂未鉴定的抑制剂未鉴定的抑制剂未鉴定的抑制剂痰液痰液痰液痰液未鉴定的抑制剂未鉴定的抑制剂未鉴定的抑制剂未鉴定的抑制剂鸿视贿挤硒搀矣叶模盆僳捻蠕斩弛贡骏酒配锌虎腕玖篙唤泳炳能猴兆台诞learningPCRhlearningPCRhPCRPCR模板的使用模板的使用模板的使用模板的使用PCRPCR模板模板模板模板的标准使用范围
78、：的标准使用范围：的标准使用范围：的标准使用范围：101022-10-1055 拷贝拷贝拷贝拷贝 特异性的改进：特异性的改进：特异性的改进：特异性的改进：增加模板增加模板增加模板增加模板DNADNA的量、降低引物与模板的量、降低引物与模板的量、降低引物与模板的量、降低引物与模板的分子比的分子比的分子比的分子比 有效性的改进：有效性的改进：有效性的改进：有效性的改进：增加引物与模板的分子比增加引物与模板的分子比增加引物与模板的分子比增加引物与模板的分子比, , , ,模板浓度模板浓度模板浓度模板浓度的变化很大程度上取决于待扩增的碱基序列，但一的变化很大程度上取决于待扩增的碱基序列，但一的变化很大
79、程度上取决于待扩增的碱基序列，但一的变化很大程度上取决于待扩增的碱基序列，但一般而言，模板般而言，模板般而言，模板般而言，模板DNADNA长度小，长度小，长度小，长度小，PCRPCR扩增产物的量就大，扩增产物的量就大，扩增产物的量就大，扩增产物的量就大，因此对于大分子量的模板因此对于大分子量的模板因此对于大分子量的模板因此对于大分子量的模板DNADNA（尤其是真核生物基（尤其是真核生物基（尤其是真核生物基（尤其是真核生物基因组因组因组因组DNADNA），在扩增之前最好先用超声波处理或限），在扩增之前最好先用超声波处理或限），在扩增之前最好先用超声波处理或限），在扩增之前最好先用超声波处理或限制
80、性酶消化制性酶消化制性酶消化制性酶消化。梭妙短穗赋锣盂凉媒针迢蹬沛滇隙却屹废哑嘛泉仇娘蛙苦城德陵瞳皇肌褒learningPCRhlearningPCRh细菌细菌DNADNA的制备的制备 一、常规法一、常规法 将将细细菌菌裂裂解解后后，用用酚酚、氯氯仿仿、异异戊戊醇醇等等常常规提取规提取DNADNA的方法。的方法。二、煮沸法二、煮沸法 100 100 水水浴浴后后，使使细细菌菌裂裂解解，7000g7000g离离心心10min10min去除细胞碎片，取上清液作去除细胞碎片，取上清液作PCRPCR模板。模板。三、冻融法三、冻融法 反反复复冻冻融融3 3次次，7000g7000g离离心心10min10
81、min，取取上上清清液液做模板。做模板。缅缺蛙缓挎花焉出陛蚌沙猖獭婿杯鹏卵劫岭激祈垃结停妻诬曼臣僳骆心狗learningPCRhlearningPCRh 第四节第四节 PCR PCR反应条件的优化反应条件的优化 一、温度循环参数一、温度循环参数（一）变性温度和时间（一）变性温度和时间 保保证证模模板板DNADNA解解链链完完全全是是保保证证整整个个PCRPCR扩增成功的关键。扩增成功的关键。 盖瓤诚路近筋哮盛宏久觉料隶灶街赋瓢憎城咋芬煌晒苗质陇绑医脂鹰栖澡learningPCRhlearningPCRh 典典型型的的变变性性是是95 95 30s30s或或97 97 15s15s。足足以以使使
82、任任何何复复杂杂的的DNADNA双双链链解解开开，更更高高温温度度需需时时更更短，但对短，但对TaqTaq酶不利。酶不利。 实际应用中一般用实际应用中一般用9494或或9595变性变性303060s60s，并且最初在加，并且最初在加TaqTaq酶之前先于酶之前先于9797充分变充分变性性510min510min。 假如假如TaqTaq酶和扩增混合物一起加入，最初酶和扩增混合物一起加入，最初变性温度应低一些变性温度应低一些 94 /95 94 /95 变性变性510510分钟。分钟。 在酶不存在时，预热能灭活样品中有害的在酶不存在时，预热能灭活样品中有害的蛋白酶和核酸酶，同时又能保证模板的完全变
83、蛋白酶和核酸酶，同时又能保证模板的完全变性，尤其是基因组性，尤其是基因组DNADNA直接作为模板使用时，更直接作为模板使用时，更显得重要。显得重要。 秧期蚕存翠改褪帮婚鼓毯党迄缘珊揪剩暗末窗桅啦胯怨辫伤园侵誓箔启愁learningPCRhlearningPCRh（二）复性温度和时间（二）复性温度和时间 PCRPCR反反应应的的特特异异性性取取决决于于复复性性过过程程中中引引物物与模板的结合。与模板的结合。 最最佳佳的的复复性性温温度度TmTm值值较较低低引引物物的的TmTm值减去值减去55。 TmTm（melting melting temperaturetemperature）：变变性性的的
84、DNADNA达达到到DNADNA总总量量1/21/2时时的的温温度度称称为为融融解解温温度度。一一般般位位于于40604060之间。之间。 萎痕板镇壹娥塞冶虐音床垛悔助捏弥纫滔绑投秘峰踏恕恒钠危手滓角牺近learningPCRhlearningPCRh退火温度（退火温度（退火温度（退火温度（TaTa） 引物的退火温度一般要比估计的相应熔点温度低引物的退火温度一般要比估计的相应熔点温度低引物的退火温度一般要比估计的相应熔点温度低引物的退火温度一般要比估计的相应熔点温度低5 5左右，左右，左右，左右，在很多情况下，两条引物的退火温度不尽相同，只要两者相差在很多情况下，两条引物的退火温度不尽相同，只
85、要两者相差在很多情况下，两条引物的退火温度不尽相同，只要两者相差在很多情况下，两条引物的退火温度不尽相同，只要两者相差不到不到不到不到4-64-6，尚不至于影响，尚不至于影响，尚不至于影响，尚不至于影响RCRRCR扩增反应的产量，但它们的退扩增反应的产量，但它们的退扩增反应的产量，但它们的退扩增反应的产量，但它们的退火温度应在火温度应在火温度应在火温度应在55-7555-75范围内。如果两条引物的退火温度差别过大，范围内。如果两条引物的退火温度差别过大，范围内。如果两条引物的退火温度差别过大，范围内。如果两条引物的退火温度差别过大，可以适当延长可以适当延长可以适当延长可以适当延长较低较低较低较
86、低TaTa值值值值的引物的的引物的的引物的的引物的33端（这样可以保持扩增产物端（这样可以保持扩增产物端（这样可以保持扩增产物端（这样可以保持扩增产物的长度不变）或的长度不变）或的长度不变）或的长度不变）或55端。端。端。端。 纬屈帘犹绥设裹鹰纽横韶洪昌桥砌盾幻庆挝领潍柑勾饮耗行床及枕运莆蚤learningPCRhlearningPCRh引物的引物的引物的引物的TaTa值估算有多种公式，最好根据值估算有多种公式，最好根据值估算有多种公式，最好根据值估算有多种公式，最好根据RCRRCR试剂盒建议的计算方法，例如试剂盒建议的计算方法，例如试剂盒建议的计算方法，例如试剂盒建议的计算方法，例如Alka
87、miQuickGuideAlkamiQuickGuide试剂盒建议的计试剂盒建议的计试剂盒建议的计试剂盒建议的计算方法如下：算方法如下：算方法如下：算方法如下：引物碱基引物碱基引物碱基引物碱基2020，TaTa =4X=4X（G+CG+C）+2+2X X（A+TA+T）- -55（） 引物碱基引物碱基引物碱基引物碱基2020，Ta=62.5+0.41Ta=62.5+0.41X X（GC%GC%）- -500/500/长度长度长度长度 - -55（） 恰抿咯沪韧杂侩酿窜当侈农采寅讫够飞曳威前宠盂洪席花靳惧所门嚣箍幂learningPCRhlearningPCRh复性时间一般为复性时间一般为306
88、0s3060s。特异性的改进：特异性的改进：p提提高高退退火火温温度度（比比建建议议退退火火温温度度提提高高2-5）: :复复性性温温度度越越高高，产产物物的的特特异异性性也也越高。越高。p减减少少退退火火时时间间: :过过长长的的退退火火时时间间在在正正常常情情况况下下并并不不能能提提高高产产量量，只只会会增增加加非非特特异异性引物杂交的可能性。性引物杂交的可能性。呛匣龙廓血粉屑忆孜猾洞惭肚湾搐馁倡焊碧匪狐皮俄炙拐蚂条雅富搐羔阻learningPCRhlearningPCRh（三）延伸温度和时间（三）延伸温度和时间 一一般般位位于于TaqTaq酶酶最最适适作作用用温温度度707075 75
89、之间。之间。 一一般般为为7272（较较复复性性温温度度高高1010左左右）。右）。 匈龚孤多淋垦吧追扎隧鲸胸爷乃趴滦捍元汹析棚汁僧朴屁妙家清陷辅唁惮learningPCRhlearningPCRhPCR扩增反应中普遍使用的扩增反应中普遍使用的DNA聚合酶的聚聚合酶的聚合速度合速度每秒至少每秒至少50个碱基个碱基，所以如果，所以如果PCR扩增扩增产物长度产物长度小于小于400bp，聚合时间可以，聚合时间可以少于少于15秒秒，特别是当退火温度选得较高的时候，在退火阶段特别是当退火温度选得较高的时候，在退火阶段就有一些单体掺入。就有一些单体掺入。 较长较长PCR产物的扩增需要相应延长反应时间，产物
90、的扩增需要相应延长反应时间，但最好要比理论计算时间更长些，以弥补由于反但最好要比理论计算时间更长些，以弥补由于反应系统粘度增大所产生的反应滞后作用。应系统粘度增大所产生的反应滞后作用。 小于小于1kb1kb的片段一般的片段一般1-2min1-2min就足够。就足够。 10kb 10kb的片段需要的片段需要15min15min或更长。或更长。延伸时间过长会导致非特异扩增带的出现。延伸时间过长会导致非特异扩增带的出现。 秦赔臂搜拣也散铰粱谜倾硬或辨警怪卒霖还累银皿陛纬甄趋啡贵塘辣蛆栋learningPCRhlearningPCRh（四）循环数（四）循环数 最最适适循循环环数数取取决决于于靶靶序序列
91、列的的初初始始浓浓度，一般度，一般25302530个循环。个循环。 在在3030个个循循环环以以内内扩扩增增产产物物增增加加明明显显。盲盲目目增增加加循循环环数数，PCRPCR产产物物不不一一定定增增加加，反而可能导致非特异扩增产物的增加。反而可能导致非特异扩增产物的增加。肤弘聂陆烽挥脆皱驱铀衍稿瘸及泪踌孙甄娱编刹梢功痊送灭燕辉擞肪腔有learningPCRhlearningPCRh PCRPCR产产物物的的积积累累规规律律遵遵循循酶酶促促动动力力学学原原理理。即即初初期期呈呈指指数数方方式式增增加加，经经一一定定循循环环（2525个个左左右右）后后进进入入相相对对稳稳定定状状态态，此此即即“
92、停停滞滞效效应应”，或或进入进入“平台期平台期”。 所所以以盲盲目目增增加加循循环环数数产产物物量量增增加加也也不不多多，非非特特异异扩扩增增产产物物反反而而增增加加了。了。稀筑币盆司董揪蚊逾君继璃俯笑去颇优祖誊娠玲掸测吞艘气癸侠启销涛缔learningPCRhlearningPCRh 当出现当出现“平台效应平台效应”时，产物浓度已达时，产物浓度已达0.1-1.0pmol0.1-1.0pmol，可满足需要。，可满足需要。钮喘翔搭产渣砖膝杯蘑侮彻唉佩笼难费屡厉劳矫欧吨越玲瓮奏隅竹典钙咖learningPCRhlearningPCRh 特异性的改进：特异性的改进：特异性的改进：特异性的改进：降低循
93、环次数，降低循环次数，降低循环次数，降低循环次数，减小扩增片段长度。减小扩增片段长度。减小扩增片段长度。减小扩增片段长度。 有效性的改进：有效性的改进：有效性的改进：有效性的改进：对于对于对于对于1kb1kb1kb1kb以上以上以上以上片片片片段的扩增，增加循环中各步骤的段的扩增，增加循环中各步骤的段的扩增，增加循环中各步骤的段的扩增，增加循环中各步骤的滞留时间。滞留时间。滞留时间。滞留时间。 燃夫歧潮因溯埂递答馅凭局胖御曳兵尉烘馏沙嗜部妥赦烽叉嫡羌折浸耶桔learningPCRhlearningPCRh二二、PCRPCR污污染染的的对对策策 由由于于PCRPCR灵灵敏敏度度很很高高，所所以以
94、极极微微量量的的污污染染也也可可导导致致阳阳性结果。性结果。（一）如何预防污染带来假阳性结果（一）如何预防污染带来假阳性结果呢？可以采取以下措施。呢？可以采取以下措施。1 1、专门设置、专门设置PCRPCR室，同时模板的制备、室，同时模板的制备、反应混合物的加液也应分成不同的区反应混合物的加液也应分成不同的区域。域。锦蹄陵即扫容饮须鞭敷慎佬辽女炳囚重盐背迅寥蓄迄蹄乒橱潭飞么骸贡掇learningPCRhlearningPCRh2 2、每个人的试剂要分装成小份，取出每个人的试剂要分装成小份，取出一小份来用，而且个人专用。一小份来用，而且个人专用。 这可避免交叉污染，另外可避免反这可避免交叉污染，
95、另外可避免反复冻融。复冻融。3 3、一般进行一般进行PCRPCR的的EppendorfEppendorf管、管、TipTip头应一次性使用。头应一次性使用。侮裹件矢惭欺侥把韭京蜜郸绒疙燕爹盼蓟妈碘医毅函氨液攘触懂杀具务琅learningPCRhlearningPCRh4 4、设设置置对对照照：每每次次实实验验都都应应有有阳阳性性、阴阴性性（无无关关DNADNA）及空白（不加）及空白（不加DNADNA）对照）对照 阳性阳性 阴性阴性 空白对照空白对照 + - - + - - 好好 + + + + + + 污染污染 + + - + + - 特异性不好特异性不好 - - - - - - 体系问题体系
96、问题5 5、重复实验：反复试验再下结论、重复实验：反复试验再下结论 宋鸦痛翼值艳纵迷遣鸣范注牌擦倾沉画宴缚课揉盂演啤避唐宣继捻涂敌父learningPCRhlearningPCRh（二）污染的处理（二）污染的处理1 1、酸处理：、酸处理：用用1ml1ml稀盐酸擦拭或浸泡污染器件，稀盐酸擦拭或浸泡污染器件，可促使可促使DNADNA脱嘌呤。脱嘌呤。2 2、紫紫外外线线照照射射：254/300nm254/300nm照照射射30min30min，包包括括工工作间、超净台。作间、超净台。3 3、对对可可能能污污染染的的反反应应液液在在加加酶酶或或模模板板之之前前：可可用用DNADNA酶酶、多种内切酶、多
97、种内切酶、UVUV照射方法去除污染。照射方法去除污染。疗挝汕涩亭似桂成捣昏弗盼茹猎镶葫资虚仙胜陛晰毕默吴泣窜涯壹淫转激learningPCRhlearningPCRh 三、其他因素三、其他因素（一）高温起动或热起动（一）高温起动或热起动（hot starthot start） 由由于于引引物物与与核核酸酸在在低低温温下下可可非非特特异异性性结结合合,Taq,Taq酶酶在在低低温温下下仍仍有有活活性性，故故当当所所有有的的反反应应成成份份混混合合后后进进入入循循环环前前，引引物物与与核核酸酸的的非非特异复性可由特异复性可由TaqTaq酶促进的非特异延伸而稳定。酶促进的非特异延伸而稳定。 采采用用
98、热热启启动动（在在温温度度达达到到7070以以上上时再加酶或模板时再加酶或模板DNADNA）可克服这个问题。）可克服这个问题。次掘焰胶晓佳铰饿学畸走趴忻蛊千将螺拿横毒妓褥伸串深莽父呵栅蓖明虽learningPCRhlearningPCRh 前前面面推推荐荐的的标标准准扩扩增增程程序序中中，先先将将不不含含酶酶的的反反应应混混合合物物于于9494变变性性510min510min，再再加加酶酶进进入入循循环环，不不但但可可以以保保护护酶酶活活性性，而而且且是是热热启启动动的的一一种种方方法法。但但变变性性后后的的反反应应混混合合物物应应立立即即置置冰冰浴浴中中，以以防防在在加加酶酶的的短短暂过程中
99、出现上述的非特异扩增。暂过程中出现上述的非特异扩增。纸仕顷袁辖几炕毋感艳舆疡孤角卫疹孤询镜婴柑谁馋淫踏氓楚讣蚂阜滦咎learningPCRhlearningPCRh（二）（二）PCRPCR促进剂促进剂（1 1）二甲基亚砜（）二甲基亚砜（DMSODMSO）：）：有变性有变性DNADNA的的作用，但在作用，但在7070时时10%10%的的DMSODMSO可抑制约可抑制约47%47%的的TaqTaq酶活性，故不一定使用。酶活性，故不一定使用。（2 2）甘油：）甘油：5%20%5%20%甘油可促进复性过程。甘油可促进复性过程。尤其是尤其是G+CG+C含量高，二级结构多的靶序列和含量高，二级结构多的靶序
100、列和扩增片段长时更适用。但要根据具体情况扩增片段长时更适用。但要根据具体情况决定。决定。蚀测异砂札视虫耍躬午腔哟咯练舍涯熙妒蜕火肪抖卿汲劲古而疵拣奸科牡learningPCRhlearningPCRh（ 4 4） T4T4噬噬 菌菌 体体 基基 因因 3232蛋蛋 白白 质质 （ gp32 gp32 1nmol/L1nmol/L）：0.5-1.0l0.5-1.0l可可使使长长片片段段DNADNA的扩增改善至少的扩增改善至少1010倍。倍。（3 3）氯氯化化四四甲甲基基铵铵（TMACTMAC）：（0.11) 0.11) 1010-5-5 mol/Lmol/L的的TMACTMAC可可减减少少非非特
101、特异异扩扩增增而而不抑制不抑制TaqTaq酶。酶。痘铣欠豁绪苹脆揉味榆率割详吊囱码嚣簿宅全颓歉撅管管爱聂武阐漓磁思learningPCRhlearningPCRh（5 5）石蜡油：）石蜡油： 现现在在研研制制的的PCRPCR仪仪，不不用用加加石石蜡蜡油油。但但必必须须用用密闭性好的反应管。密闭性好的反应管。a a 加加石石蜡蜡油油的的目目的的是是为为了了防防止止反反应应液液蒸蒸发发后后引引起起的的冷冷却却与与反反应应成成分分的的改改变变。石石蜡蜡油油的的有有无无对对反应影响较大。反应影响较大。b b 石石蜡蜡油油的的质质量量要要高高，不不能能含含抑抑制制TaqTaq酶酶活活性性的的物质。物质。
102、鞠埃临峻身辽走狭门体氧头翟嗽拜倾吹险语莫讼阑烹艰膀艇羡人侮吁造坐learningPCRhlearningPCRh（三）（三）TaqTaq酶抑制剂酶抑制剂（1 1）许多离子型表面活性剂在极）许多离子型表面活性剂在极低浓度下即可抑制低浓度下即可抑制TaqTaq活性活性，如脱，如脱氧胆酸氧胆酸0.06%0.06%，SDS0.01%SDS0.01%，十二，十二烷基酸钠烷基酸钠0.02%5% 5% N-N-辛基糖苷辛基糖苷0.4% 5000 5000 0.5 型桅盘炊戈煎黑吁辑丛雹线纶乓甘渊浪府一莱姥视烙唇职囤笋呻拴腮宰瓣learningPCRhlearningPCRh 在在配配置置琼琼脂脂糖糖时时，加
103、加入入0.5g/ml0.5g/ml的的溴溴化化乙乙锭锭（ethidium ethidium bromide bromide ，EBEB）。这这是是琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶中中DNADNA染染色色的的最最简便方法。简便方法。 溴溴化化乙乙锭锭是是一一种种荧荧光光染染料料，它它含含有有一一个个可可以以插插入入DNADNA的的堆堆积积碱碱基基之之间间的的一一个个平平面面基基团团。这这个个基基团团的的固固定定位位置置及及其其与与碱碱基基的的密密切切接接近近，导导致致染染料料与与DNADNA结结合合并并呈呈现现荧荧光光，其其荧荧光光产产率率比比游游离染料溶液有所增加。离染料溶液有所增加。曳柬厘堡眺笛焦瑚姆皮
104、壕空腥麻宋伙敏吮讣拥喘娱汰寥燕拎褒脑议褒汉径learningPCRhlearningPCRh 在紫外线照射下，在紫外线照射下，DNADNA吸收吸收254nm254nm处的紫外辐射并传递给染料。处的紫外辐射并传递给染料。由于溴化乙锭由于溴化乙锭DNADNA复合物的荧光产率复合物的荧光产率远大于未结合染料的荧光产率，所远大于未结合染料的荧光产率，所以当凝胶中含有游离溴化乙锭时，以当凝胶中含有游离溴化乙锭时，也可以检测到少量的也可以检测到少量的DNADNA。 悠接迢腆柱夕质蚤休盈蕾巷鲜浩尾脑志案斧软还蛙偶树赘肩仿探刃秃式搓learningPCRhlearningPCRh EBEB可可用用于于 sss
105、s或或dsds（DNADNA或或RNARNA），但但对对单单链链核核酸酸的的亲亲和和力力相相对对较较小小，荧光产率也相对较低。荧光产率也相对较低。 通通常常EBEB配配成成10mg/ml10mg/ml的的贮贮存存液液，于于室室温温避避光光保保存存在在棕棕色色瓶瓶或或用用铝铝铂铂包裹的瓶中。包裹的瓶中。 使用浓度为使用浓度为0.5g/ml0.5g/ml。杉八迁痰搅原磊燕枝铡辟行凯际祸逐线瓷逮宴值竭撑捶绽按搅伐醚彩魏丈learningPCRhlearningPCRh EBEB可可事事先先加加在在凝凝胶胶中中或或电电泳泳完完后后再再用用0.5g/ml 0.5g/ml EBEB于于室室温温染染色色30
106、-4530-45分钟。分钟。 一一般般不不用用脱脱色色。若若想想减减少少背背景景荧荧光光, ,也也可可用用水水或或1mmol1mmolMgSOMgSO4 4在在室室温温下下将将已已染染色色的的凝凝胶胶浸浸泡泡2020分分钟钟, ,可可分分辨辨极极少量少量DNADNA（ 10ng 10ng）。）。 注意注意EBEB有毒！有毒！粮侈赁柒皑野爷枷侠佬诣节茹赦玖洱爹坊贰每僳太糜了父每淤脏晕卞绑结learningPCRhlearningPCRh 第六节第六节 PCR PCR相关技术及其应用相关技术及其应用一、一、原位原位PCRPCR（In situ PCRIn situ PCR） 在在细细胞胞或或组组织
107、织（石石蜡蜡、冰冰冻冻切切片片）上上直直接接对对靶靶DNADNA片片段段进进行行扩扩增增，通通过过掺掺入入标标记记基基团团（生生物物素素、地地高高辛辛等等）直直接接显显色色或或结结合合原原位位杂杂交交（也也就就是是用用相相应应的的探探针针来来检检测测）进进行行检检测测的的方方法法，称称为为原原位位PCRPCR。喀借闷泣覆憋函窿哀涅早氖猫重云邹货虎泵陀韦桩涣慰敞菱牺跑捧蝗慢岔learningPCRhlearningPCRh 分为：分为： 直直接接原原位位PCRPCR：PCRPCR扩扩增增时时，即即掺掺入入生生物物素素/ /地地高高辛辛标标记记的的dUTPdUTP，扩扩增增后后即即可可检检测。测。
108、 间间接接原原位位PCRPCR：扩扩增增时时不不进进行行标标记记基基团团的的掺掺入入，而而在在扩扩增增结结束束后后，应应用用一一段段和和扩扩增增片片段段互互补补的的标标记记探探针针进进行行原原位位杂杂交。交。该泼尤州见夫蚊董架灭趾曰据庐忱抽妆狰掀拎惦快羞冶委搭么银潞椎枕掐learningPCRhlearningPCRh 主主要要是是可可以以定定位位。它它可可以以将将扩扩增增结结果果与与某某一一细细胞胞类类型型相相联联系系，判判断断携携带带靶靶序序列列的的细细胞胞百分比。百分比。 固固定定的的细细胞胞就就像像一一个个半半通通透透性性的的透透析析袋袋，细细胞胞经经固固定定和和乙乙醇醇通通透透化化处
109、处理理后后适适于于一一般般PCRPCR试试剂剂的的进进入入，PCRPCR扩扩增增后后，尽尽管管有有些些产产物物渗渗出出到到周周围围环环境境中中，但但多多数数产产物物仍仍在在细细胞胞核核或或胞胞膜膜内内。因因此此，扩扩增增后后立立即即用用一一合合适适标标记记的的DNADNA探探针针杂杂交交或或直直接接检检测测渗渗入入的的标标记记基基团团，以以免免扩扩增增产产物物从从扩扩增增位位点点扩扩散散。可可以以判判断断哪哪种种细细胞中有这种序列，哪种没有。胞中有这种序列，哪种没有。腊靴吏裔崇晚戒绽疚扒沾柔纠粥扛茎旷掀流猿它友彻楷宇根交酱飘帅詹火learningPCRhlearningPCRh二二 、 逆逆
110、转转 录录 PCRPCR（ revers revers transcription PCRtranscription PCR，RT-PCRRT-PCR） 原原理理：由由mRNAmRNA逆逆转转录录反反应应产产生生的的cDNAcDNA（互互补补DNADNA）链链作作为为PCRPCR反反应应模模板。板。忧幼炼锦奉贪荧勉霞盔腹婚健醚赖叹古云霞鸵写蛇冕绷霞逻鳞诬氮荷晚命learningPCRhlearningPCRh RT-PCRRT-PCR较较NorthernNorthern杂杂交交检检测测RNARNA的的敏感性提高了几个数量级。敏感性提高了几个数量级。 如如果果我我们们想想判判断断某某种种基基因因
111、是是否否表表达达了了不不能能检检测测DNADNA，而而检检测测mRNAmRNA如如果果这这种种基基因因不不表表达达，它它就就不不转转录录成成mRNAmRNA，mRNAmRNA就检测不到。就检测不到。园蛀公构孤恨瞧丈厂钳袍署啃技囚役涧盂奥石扭斗丢弓吧然肩没矛奇销事learningPCRhlearningPCRh三、巢式三、巢式PCRPCR（nested PCRnested PCR） 用外部引物用外部引物1 1和和2 2扩增完后，取产物扩增完后，取产物110l110l做模板再用内部引物做模板再用内部引物3 3和和4 4进行进行2 2次扩增（也可用次扩增（也可用1 1、4 4或或2 2、3 3扩增）
112、。扩增）。nested PCRnested PCR适用于极微量的靶序列。适用于极微量的靶序列。 辞招法韵膨储熔惠汁太桅于然横本稀踢譬我朵钧粗溺靶汹纶衬袱目吁蟹碌learningPCRhlearningPCRh四、不对称性四、不对称性PCRPCR（asymmetric PCRasymmetric PCR） 在在PCRPCR扩扩增增过过程程中中两两个个引引物物的的浓浓度度不不一一样样产生单链的情况即为产生单链的情况即为不对称不对称PCRPCR 两两个个引引物物的的比比例例通通常常为为5050：1 1到到100100：1 1，在在前前10151015个个循循环环中中主主要要产产生生双双链链DNADN
113、A，此此后后一个引物耗尽，只产生另一引物形成的单链。一个引物耗尽，只产生另一引物形成的单链。 这这一一单单链链可可用用于于测测序序，也也可可用用于于制制备备单单链探针。链探针。倡贱渤由住挽湛瞅鸿胰野钥卵粕筛迎孽闷娄鳞亭嫂汕炒福搔兢决更脑伤绣learningPCRhlearningPCRh 常规常规PCRPCR是知道目的是知道目的DNADNA两端的序列，来两端的序列，来扩增中间序列。扩增中间序列。五五、反反向向PCRPCR（reverse reverse PCRPCR， inverse inverse or or inverted PCR inverted PCR ，IPCRIPCR）捂篱本射欠
114、套蛔卢妇惟椿辛仁有沏缠间芳插乘拆矿院辰焰瓦蕉晕渊敦拉扼learningPCRhlearningPCRh 反反向向PCRPCR是是知知道道中中间间的的序序列列，来来扩扩增增两两端端的的未未知序列。知序列。冯鹤刊餐缚焙御亮举暑峙签锈傀菩兵搜双跋葬斯隆份屈伸诡吕噪钒香围糟learningPCRhlearningPCRh原理 所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 六六. real-time PCR 谚姻推范岗寨氦漾员通芳系听蓄跑家呈命替蛛祁挠人濒夏测栏劣洲风悄俗learningPCRhle
115、arningPCRh磺差膨共跟穆胃群主卑欺答做唉诺覆爹勾看仅掉盟通武摈线揭边坏胸页绳learningPCRhlearningPCRh涂革捌渔黔编颠戴芳佰烙亿宰员胯冰瓜糖银剔宝炒穆袍傣恐发浅沦陨勉绢learningPCRhlearningPCRh敞凛肘埠锹锹螺凑奔澄就味匝展盎独坦慈蒸势椰纂恋晚寐坎沈纶匠淌坞航learningPCRhlearningPCRhTaqMan探针法原理：探针法原理：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团(FAM)和一个淬灭荧光基团(TAMRA)。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩
116、增时，Taq酶的53外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。 贩食赔莎舌筛明镶维无育田行冲兜搔亦沙朴浑痰弃钩灯溃售柏来彭竣泅着learningPCRhlearningPCRh弊快回刀腰锗犁融库籍牛焙菏淑祷讽巩辙锌殿邮膝叔详戈肾丘摇奴棚张痴learningPCRhlearningPCRhSYBR Green染料法染料法 原理开始反应 当SYBR Green染料与DNA双链结 合时发出荧光。 2. 变性 当DNA变性时，SYBR Green染料便 释放出来
117、，荧光急剧减少。 3. 聚合 在延伸过程中，引物退火并形成 PCR产物。 4. 聚合完成 当聚合完成时，SYBR Green染料与双链产物结合，用仪器测量时，荧光的净增量加大。维粱漾膝葡邯过扔鼠琶杉概瑚淬霞有痉灰幌止渍姜情险谬乏雁晕驭磅雪汉learningPCRhlearningPCRh 第七节第七节 PCR PCR技术的应用技术的应用 PCRPCR技技术术应应用用相相当当广广泛泛（医医学学、考古学、法医学）。考古学、法医学）。 下下面面主主要要介介绍绍一一下下PCRPCR技技术术在在分分子生物学研究中的应用。子生物学研究中的应用。 蹿互砚赖挤隧蓬衰缆纲瑞瓮胖吠启缀辊祝触狙惹铜秸九凰岛钩垂杨暮
118、涅噬learningPCRhlearningPCRh 一一、直直接接扩扩增增检检测测目目的的DNADNA或或通通过反转录酶反应检测目的过反转录酶反应检测目的RNARNA。 二、二、PCRPCR克隆技术克隆技术 在在PCRPCR引引物物中中附附加加酶酶切切位位点点，扩扩增增的的DNADNA经经酶酶切切后后，可可直直接接克克隆隆到到质粒或质粒或M M1313噬菌体载体中。噬菌体载体中。 浩禽艳彰走壮窜袋讽藩武菠箱坊弄班徒愈皱跑拈挥铬兜淘测握擞皆椰罗氧learningPCRhlearningPCRh 这这种种方方法法要要比比先先建建库库，再再从从库库中中筛筛选选目目的的克克隆隆的的方方法法简简单单的
119、的多多。但但是是需需要要知知道道目目的的片片段段两两翼翼或或其其附近的序列。附近的序列。 除除了了加加酶酶切切位位点点以以外外，还还可可用钝端克隆等方法进行克隆。用钝端克隆等方法进行克隆。密佳啪铃郎认律思罕喊贺钾琴刁削矩倦鸵箱茹罪音叠效梁蜜诵初姐狰吩障learningPCRhlearningPCRh 需要注意的是扩增循环数应尽需要注意的是扩增循环数应尽量减少，一般限定在量减少，一般限定在26282628个循环个循环内。这样可减少因内。这样可减少因PCRPCR平台期所产生平台期所产生的非特异性扩增产物的干扰。的非特异性扩增产物的干扰。库朗找邮琼忘姜泉逐现比酞浦鸭桂合摔磁样妨臻疽坡铀抛穿垮旋捉颐粟
120、告learningPCRhlearningPCRh三、三、PCRPCR直接测序技术直接测序技术 PCRPCR产产物物可可以以克克隆隆到到载载体体内内进进行行测测序，或不用克隆而直接进行测序。序，或不用克隆而直接进行测序。直接测序较克隆以后测序有两大优点：直接测序较克隆以后测序有两大优点：第第一一易易于于标标准准化化和和自自动动化化，因因为为该该法法不依赖于生物体。不依赖于生物体。第二第二更快速。更快速。长脆税迷普赌颓仑惜乱铃则笋珐相乃置歇噎抗硒鲍戒恩郝惮称擦蹈钻智熙learningPCRhlearningPCRh Taq Taq DNADNA聚聚合合酶酶由由于于有有错错误误掺掺入入的的问问题题
121、，也也就就是是说说它它缺缺乏乏33外外切切核核酸酸酶酶活活性性，没没有有校校对对功功能能，因因此此它它所所催催化化的的聚聚合合反反应应保保真真性性较较差差，出出现现碱碱基基错错掺掺的的概概率率大大约为约为2*2*1010-4-4 / /（核苷酸循环）（核苷酸循环） 因因此此，需需要要测测定定几几份份PCRPCR产产物物， 同同时时也也可可采采用用一一种种专专门门用用于于测测序序的的TaqTaq酶酶，比较贵。比较贵。 哦换状孩仕珊脖拼伺娃捅代弓恳稠示欺捉操戮姜六秤枕芜思以懊蠢瘪唁诊learningPCRhlearningPCRh 体外定点突变体外定点突变 用用PCRPCR构建载体构建载体 分析基因组分析基因组DNADNA的多态的多态randomly amplified polymorphic DNA(RAPD)Amplified fragment-length polymorphism(AFLP)峡躺范旦丈价捅毅缸稳得垄融稿炮泌顿甸研扔呢旧鼓声铝筛盅倘裔凶比啪learningPCRhlearningPCRh
