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1、第二节第二节 基因工程载体基因工程载体 一、作为载体的条件：一、作为载体的条件： 分分离离的的基基因因自自身身不不能能繁繁殖殖，需需要要载载体体携携带带它它们们到到合合适适的的细细胞胞中中复复制制和和表表现现功功能能。对对理理想想的的基基因因工工程程载载体体一一般般至至少少有有以以下下几几点要求。点要求。能能在在宿宿主主细细胞胞中中复复制制，而而且且最最好好要要有有较较高的复制能力。高的复制能力。容容易易进进入入宿宿主主细细胞胞，而而且且进进入入效效率率越越高高越好。越好。容容易易插插入入外外来来核核酸酸片片段段，插插入入后后不不影影响响其其进进入入宿宿主主细细胞胞和和在在细细胞胞中中的的复复
2、制制。这这就就要要求载体上要有合适的酶切位点。求载体上要有合适的酶切位点。容易从宿主细胞中分离纯化出来。容易从宿主细胞中分离纯化出来。有容易被识别筛选的标志。有容易被识别筛选的标志。 二、载体的种类二、载体的种类按照性质分：按照性质分： 质粒载体质粒载体 病毒载体病毒载体按照功能分：按照功能分： 克隆载体克隆载体 表达载体表达载体 穿梭载体穿梭载体常用的载体有质粒，噬菌体和病毒等。常用的载体有质粒，噬菌体和病毒等。 一、质粒载体一、质粒载体 质质粒粒（plasmid）是是细细菌菌或或细细胞胞染染色色质质以以外外的的，能能自自主主复复制制的的，与与细细菌菌或或细细胞胞共共生生的的遗遗传传成成分分
3、。其特点如下：其特点如下：是染色体外的双链共价闭合环形是染色体外的双链共价闭合环形DNA（covalently closed circuar DNA,cccDNA），），可自然形成超螺旋结构，不同质粒大小在可自然形成超螺旋结构，不同质粒大小在2-300 kb之间，之间，15kb的小质粒比较容易分离纯化，的小质粒比较容易分离纯化，15kb的大质粒则不易提取。的大质粒则不易提取。 能自主复制，是能独立复制的复制子。按质能自主复制，是能独立复制的复制子。按质粒复制的调控及其拷贝数可分两类：粒复制的调控及其拷贝数可分两类：v严紧控制（严紧控制（stringent control）型型：复制常与：复制常
4、与宿主的繁殖偶联，拷贝数较少，每个细胞只有宿主的繁殖偶联，拷贝数较少，每个细胞只有一个到十几个拷贝；一个到十几个拷贝；v松弛控制（松弛控制（relaxed control）型型：复制和宿主：复制和宿主不偶联，每个细胞中有几十到几百个拷贝。不偶联，每个细胞中有几十到几百个拷贝。质粒对宿主生存并不是必需的。质粒对宿主生存并不是必需的。 这点不同于线粒体，线粒体这点不同于线粒体，线粒体DNA也是环状双也是环状双链分子，也有独立复制的调控，但线粒体的功链分子，也有独立复制的调控，但线粒体的功能是细胞生存所必需的。线粒体是细胞的一部能是细胞生存所必需的。线粒体是细胞的一部分，质粒也往往有其表型，其表现不
5、是宿主生分，质粒也往往有其表型，其表现不是宿主生存所必需的，也不妨碍宿主的生存。某些质粒存所必需的，也不妨碍宿主的生存。某些质粒携带的基因功能有利于宿主细胞的特定条件下携带的基因功能有利于宿主细胞的特定条件下生存，例如，细菌中许多天然的质粒带有抗药生存，例如，细菌中许多天然的质粒带有抗药性基因，如编码合成能分解破坏四环素、氯霉性基因，如编码合成能分解破坏四环素、氯霉素、氨芐表霉素等的酶基因，这种质粒称为抗素、氨芐表霉素等的酶基因，这种质粒称为抗药性质粒，又称药性质粒，又称R质粒，带有质粒，带有R质粒的细菌就质粒的细菌就能在相应的抗生素存在生存繁殖能在相应的抗生素存在生存繁殖 。二、噬菌体载体二
6、、噬菌体载体1、结构、结构噬菌体（噬菌体（phage）是感染细菌的一类病毒，是感染细菌的一类病毒，有的噬菌体基因组较大，例入有的噬菌体基因组较大，例入噬菌和噬菌和T噬噬菌体等；有的则较小，如菌体等；有的则较小，如M13、f1、fd噬噬菌体等。用感染大肠杆菌的菌体等。用感染大肠杆菌的噬菌体改造成噬菌体改造成的载体应用最为广泛。的载体应用最为广泛。 噬菌体由头和尾构成，噬菌体由头和尾构成，DNA装在头部蛋白质装在头部蛋白质外壳的里面外壳的里面。其基因组长其基因组长48502bp，为线性双链为线性双链DNA。噬菌体感染时，通过尾管将基因组噬菌体感染时，通过尾管将基因组DNA注入大注入大肠杆菌，而将其
7、蛋白质外壳留在菌外。肠杆菌，而将其蛋白质外壳留在菌外。DNA进进入大肠杆菌后以其两端入大肠杆菌后以其两端12bp的互补单链粘末端的互补单链粘末端环化成环状双链，可以两种不同的方式繁殖环化成环状双链，可以两种不同的方式繁殖 。溶菌性方式（溶菌性方式（lytic pathway）：）：在营养充足，条在营养充足，条件适合细菌繁殖时，利用宿主菌中的酶类和原料，件适合细菌繁殖时，利用宿主菌中的酶类和原料，DNA上基因可按调控的顺序表达合成构成噬菌体头、上基因可按调控的顺序表达合成构成噬菌体头、尾和尾丝所需的各种蛋白质，尾和尾丝所需的各种蛋白质，DNA经多次复制合成经多次复制合成许多子代许多子代DNA，于
8、是装配成许多子代的于是装配成许多子代的噬菌体，最噬菌体，最后裂菌，释放出许多新的后裂菌，释放出许多新的噬菌体。噬菌体。溶原性方式（溶原性方式（lysogenic pathway）：）：进入细菌进入细菌的的DNA可整合可整合(integrate）入细菌的染色质入细菌的染色质DNA中，中，随细菌染色体随细菌染色体DNA复制，传给细菌后代，这个稳定潜复制，传给细菌后代，这个稳定潜伏在细菌染色质伏在细菌染色质DNA中的中的DNA称为原噬菌体称为原噬菌体(prophage)，含有原噬菌体的细菌称为溶源菌含有原噬菌体的细菌称为溶源菌(lysogen)。DNA的整合是可逆的，原噬菌体可从宿的整合是可逆的，原
9、噬菌体可从宿主主DNA中切出，进入溶菌性方式的繁殖。中切出，进入溶菌性方式的繁殖。 2、基因组、基因组噬菌体整个基因组可分为三个部分：噬菌体整个基因组可分为三个部分：左臂左臂：长约：长约20kb，编码构成头部、尾部、尾丝对编码构成头部、尾部、尾丝对组装完整噬菌体所需要的蛋白质。组装完整噬菌体所需要的蛋白质。中段中段：长约：长约20kb，是是DNA整合和切出，溶原生长整合和切出，溶原生长所需的序列。所需的序列。右臂右臂：长约：长约10kb，是调控区，控制溶菌和溶原生是调控区，控制溶菌和溶原生长最重要的调控基因和序列、以及长最重要的调控基因和序列、以及DNA复制起始均复制起始均在这区域内。在这区域
10、内。左右臂是必需的，中段是非必需的左右臂是必需的，中段是非必需的 。在中段插入外。在中段插入外源基因不影响它的增殖，这是作为载体的基础。源基因不影响它的增殖，这是作为载体的基础。3、应用、应用作为载体，但天然不行，需要改造作为载体，但天然不行，需要改造一般地，基因工程操作可以分为四个步骤一般地，基因工程操作可以分为四个步骤 目的基因的获得目的基因的获得 目的基因和载体连接目的基因和载体连接 目的基因的转化目的基因的转化 目的基因的表达目的基因的表达第三节第三节 目的基因的获取目的基因的获取1、目的基因的概念、目的基因的概念 符合人们要求的符合人们要求的DNA片段，被称为目的基因。片段，被称为目
11、的基因。 筛选文库筛选文库 PCR扩增扩增 化学合成化学合成2、得到目的基因的主要方法、得到目的基因的主要方法（1）基因组）基因组DNA文库文库 从细胞中提取出全部从细胞中提取出全部DNA，用物理方法（超声波用物理方法（超声波等）或酶法（内切酶不完全酶解）将等）或酶法（内切酶不完全酶解）将DNA降解成降解成大小不等的片段，然后将这些片段与适当的载体大小不等的片段，然后将这些片段与适当的载体连接，转入受体细胞，这样每一个细胞接受了含连接，转入受体细胞，这样每一个细胞接受了含有一个基因组有一个基因组DNA片段与载体连接的重组片段与载体连接的重组DNA分分子，而且可以繁殖扩增，许多细胞一起组成一个子
12、，而且可以繁殖扩增，许多细胞一起组成一个含有基因组各含有基因组各DNA片段克隆的集合体，就称为基片段克隆的集合体，就称为基因组因组DNA文库（文库（genomic DNA library）。）。如果如果这个文库足够大，能包含该生物基因组这个文库足够大，能包含该生物基因组DNA全部全部的序列，就是该生物完整的基因组文库，能从这的序列，就是该生物完整的基因组文库，能从这文库中钓取该生物的全部基因或文库中钓取该生物的全部基因或DNA序列。序列。基因组基因组DNA酶切酶切（2）cDNA文库文库 提提出出细细胞胞的的全全部部mRNA，在在体体外外反反转转录录成成cDNA，与与适适当当的的载载体体（常常用
13、用噬噬菌菌体体或或质质粒粒载载体体）连连接接后后转转化化受受体体菌菌，则则每每个个细细菌菌含含有有一一段段cDNA，并并能能繁繁殖殖扩扩增增，这这样样包包含含着着细细胞胞全全部部mRNA信信息息的的cDNA克克隆隆集集合合称称为为该该组组织织细细胞胞的的cDNA文文库库。基基因因组组含含有有的的基基因因在在特特定定的的组组织织细细胞胞中中只只有有一一部部分分表表达达，而而且且处处在在不不同同环环境境条条件件、不不同同分分化化时时期期的的细细胞胞其其基基因因表表达达的的种种类类和和强强度度也也不尽相同，所以不尽相同，所以cDNA文库具有组织细胞特异性。文库具有组织细胞特异性。 cDNA文库显然比
14、基因组文库显然比基因组DNA文库小得多，文库小得多，能够比较容易从中筛选克隆得细胞特异表达能够比较容易从中筛选克隆得细胞特异表达的基因。但对真核细胞来说，从基因组的基因。但对真核细胞来说，从基因组DNA文库获得的基因与从文库获得的基因与从cDNA文库获得的不同，文库获得的不同，基因组基因组DNA文库所含的是带有含子和外显子文库所含的是带有含子和外显子的基因组基因，而从的基因组基因，而从cDNA文库中获得的是已文库中获得的是已经过剪接、去除了内含子的经过剪接、去除了内含子的cDNA。（3）聚合酶链式反应（）聚合酶链式反应（PCR） 如果已经知道目的基因的序列，就能很方便地如果已经知道目的基因的序
15、列，就能很方便地用聚合酶链式反应（用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction， PCR），），从基因组从基因组DNA或或cDNA中获得目的基中获得目的基因，可不必要经过复杂的因，可不必要经过复杂的DNA文库构建过程。文库构建过程。 PCR反应系统包括：反应系统包括： 含有目的基因的含有目的基因的DNA模板模板 对热稳定的对热稳定的DNA聚合酶聚合酶 一对寡核苷酸引物一对寡核苷酸引物 4种三磷酸脱氧核苷种三磷酸脱氧核苷 保证聚合酶催化反应的缓冲液保证聚合酶催化反应的缓冲液（4）人工化学合成）人工化学合成现现在在计计算算机机控控制制的的全全自自动动核核酸酸合合成成仪仪已已
16、被被广广泛泛应应用用，按按人人们们设设计计好好的的序序列列一一次次合合成成100-200bp长长的的DNA片片段段已已不不成成问问题题。但但随随意意合合成成的的DNA绝绝大大多多数数肯肯定定不不具具有有生生物物功功能能或或无无法法知知道道它它会会有有什什么么功功能能的的，因因而而只只能能模模仿仿自自然然界界生生物物中中已已知知的的基基因因序序列列来来合合成成，而而化化学学合合成成这这样样长长的的基基因因DNA序序列列，其其价价格格远远高高于于用用PCR法法获获得得基基因因，所所以以目目前前很很少少全全部部用用化化学学方方法法去去合合成成基基因因。但但人人工工设设计计化化学学合合成成核核酸酸片片
17、段段作作为为引引物物、接接头头等等已已经经成成为为分分子子生生物物学学和和基基因因工工程程中中必必不不可少而且十分重要的手段可少而且十分重要的手段。第四节第四节 目的基因和载体的连接目的基因和载体的连接 将将目目的的基基因因或或序序列列插插入入载载体体，主主要要靠靠DNA连连接酶。有以下主要的方式。接酶。有以下主要的方式。一、粘性末端连接一、粘性末端连接 如果目的序列两端有与载体上相同的限制性核如果目的序列两端有与载体上相同的限制性核酸内切酶位点，则同一限制酶切开产生的粘末端，酸内切酶位点，则同一限制酶切开产生的粘末端，在降低温度退火时，能重新互补结合，在在降低温度退火时，能重新互补结合，在D
18、NA连接酶催化下，目的序列就与载体连接酶催化下，目的序列就与载体DNA链相连链相连接。接。 不不同同的的限限制制性性内内切切酶酶切切，如如果果产产生生的的DNA的的粘粘末端相同（同尾酶），也可用此法连接。末端相同（同尾酶），也可用此法连接。 如果在连接的两个如果在连接的两个DNA片段没有能互补的粘性片段没有能互补的粘性末端，可用末端核苷酸转移酶催化脱氧单核苷酸末端，可用末端核苷酸转移酶催化脱氧单核苷酸添加添加DNA的的3末端，例如一股末端，例如一股DNA3端加上端加上polyG，另一股另一股DNA3端端加上加上polyC，人工在人工在DNA两端做两端做出能互补的核苷酸多聚物粘性末端，退火后能连
19、出能互补的核苷酸多聚物粘性末端，退火后能连接，称为同聚物加尾法。接，称为同聚物加尾法。 对平末端的对平末端的DNA，可先连上人工设计合成的脱可先连上人工设计合成的脱氧寡核苷酸双链接头，使氧寡核苷酸双链接头，使DNA末端产生新的限制末端产生新的限制内切酶位点，经内切酶割后，即可按粘性末端相内切酶位点，经内切酶割后，即可按粘性末端相连。连。 GGGGGCCCCC5533同聚物加尾法同聚物加尾法二、平末端连接二、平末端连接 T4 DNA连接酶能催化连接酶能催化DNA平末端的连平末端的连接。如果目的序列和载体上没有相同的接。如果目的序列和载体上没有相同的限制性内切酶位点可供利用，用不同的限制性内切酶位
20、点可供利用，用不同的限制性内切酶切割后的粘性末端不能互限制性内切酶切割后的粘性末端不能互补结合，则可用适当的酶将补结合，则可用适当的酶将DNA突出的突出的末端削平或补齐成平末端，再用末端削平或补齐成平末端，再用T4 DNA连接酶连接，但平末端连接要比粘性末连接酶连接，但平末端连接要比粘性末端连接的效率低得多。端连接的效率低得多。 第五节第五节 目的基因导入细胞目的基因导入细胞 目目的的基基因因序序列列与与载载体体连连接接后后，要要导导入入细细胞胞中中才才能能繁繁殖殖扩扩增增，再再经经过过筛筛选选，才才能能获获得得重重组组DNA分分子子克克隆隆，不不同同的的载载体体在在不不同同的的宿宿主主细细胞
21、胞中中繁繁殖殖，导导入入细细胞胞的的方方法也不相同。法也不相同。一、原核细胞一、原核细胞1、热激和电激、热激和电激 由于外源由于外源DNA的进入而使细胞遗传特性改变称的进入而使细胞遗传特性改变称为转化。为转化。1943年年Avery等就发现肺炎双球菌转化等就发现肺炎双球菌转化现象。现象。DNA自然进入细胞的效率很低，在基因工程中自然进入细胞的效率很低，在基因工程中可采取一些方法处理细胞，经处理后的细胞就容可采取一些方法处理细胞，经处理后的细胞就容易接受外界易接受外界DNA，称为感受态细胞，再与外源称为感受态细胞，再与外源DNA接触，就能提高转化效率。例如大肠杆菌接触，就能提高转化效率。例如大肠
22、杆菌经冰冷经冰冷CaCl2的处理，就成为感受态细菌，当加的处理，就成为感受态细菌，当加入重组质粒并突然由入重组质粒并突然由4转入转入42作短时间处理，作短时间处理，质粒质粒DNA就能进入细菌；用高电压脉冲短暂作就能进入细菌；用高电压脉冲短暂作用于细菌也能显著提高转化效率，这称为电穿孔用于细菌也能显著提高转化效率，这称为电穿孔转化法。转化法。2、感染、感染 噬噬菌菌体体进进入入宿宿主主细细菌菌，病病毒毒进进入入宿宿主主细细胞胞中中繁繁殖殖就就是是感感染染（infection）。用用经经人人工工改改造造的的噬噬菌菌体体活活病病毒毒作作载载体体，以以其其DNA与与目目的的序序列列重重组组后后，在在体
23、体外外用用噬噬菌菌体体或或病病毒毒的的外外壳壳蛋蛋白白将将重重组组DNA包包装装成成有有活活力力的的噬噬菌菌体体或或病病毒毒，就就能能以以感感染染的的方方式式进进入宿主细菌或细胞，使目的序列得以复制繁殖。入宿主细菌或细胞，使目的序列得以复制繁殖。3、转染、转染 重组的噬菌体重组的噬菌体DNA也可象质粒也可象质粒DNA的方式进入的方式进入宿主菌，即宿主菌先经过宿主菌，即宿主菌先经过CaCl2，电穿孔等处理成电穿孔等处理成感受态细菌再接受感受态细菌再接受DNA，进入感受态细菌的噬菌进入感受态细菌的噬菌体体DNA可以同样复制和繁殖，这种方式称为转染可以同样复制和繁殖，这种方式称为转染。 农杆菌转化法
24、农杆菌转化法 基因枪法基因枪法 其他方法其他方法二、真核细胞二、真核细胞 根癌农杆菌（根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens） 发根农杆菌发根农杆菌(A. rhizogenes) 1、农杆菌转化、农杆菌转化根癌农杆菌浸染根癌农杆菌浸染发根农杆菌浸染发根农杆菌浸染1974年年Zaenen等研究发现，根癌农杆菌中存在一个等研究发现，根癌农杆菌中存在一个或几个大的质粒，这些质粒是诱导植物产生肿瘤所或几个大的质粒，这些质粒是诱导植物产生肿瘤所必须的，并称之为必须的，并称之为Ti质粒（质粒（tumour inducing plasmid）。）。根癌农杆菌的根癌农杆菌的Ti为质粒，
25、发根农杆菌的为质粒，发根农杆菌的为为Ri质粒。质粒。1977年，用限制性内切酶的方法证实植年，用限制性内切酶的方法证实植物肿瘤组织中存在一段外来的物肿瘤组织中存在一段外来的DNA，是整合进植物是整合进植物染色体的根癌农杆菌染色体的根癌农杆菌Ti质粒的一个片段，称为转移质粒的一个片段，称为转移DNA（transferred DNA），），简称简称T-DNA。当植物当植物受伤时受伤时T-DNA会转入并整合到植物的基因组中，然会转入并整合到植物的基因组中，然后借助植物的转录和翻译系统进行表达后借助植物的转录和翻译系统进行表达。 根癌农杆菌介导的基本方法根癌农杆菌介导的基本方法农杆菌示意图农杆菌示意图
26、T-DNA右边界左边界Vir 区Ti plasmid目的基因细胞核，示核细胞核，示核仁和核孔仁和核孔农杆菌附着农杆菌附着在细胞壁上在细胞壁上T-DNA转移的过程示意图转移的过程示意图优点优点 单拷贝单拷贝 插入片段大插入片段大 表达高效表达高效 不需要贵重仪器不需要贵重仪器农杆菌转化特点农杆菌转化特点缺点缺点 基因型依赖基因型依赖 愈伤组织褐化坏死愈伤组织褐化坏死 单子叶不敏感单子叶不敏感 抑菌比较困难抑菌比较困难PDS 1000/He2 2、基因枪法、基因枪法基因枪原理基因枪原理手持式基因枪手持式基因枪基因枪转化特点基因枪转化特点 优点优点操作简单操作简单快速高效快速高效处理样品多处理样品多
27、不依赖基因型不依赖基因型缺点缺点费用高费用高基因沉默基因沉默多拷贝多拷贝3 3、其他方法、其他方法 花粉管通道法花粉管通道法 原生质体转化原生质体转化 超声波法、超声波法、 电激法、电激法、 激光转化法等激光转化法等第六节第六节 含目的基因克隆的筛选与鉴定含目的基因克隆的筛选与鉴定 目的序列与载体目的序列与载体DNA正确连接的效率、重组导正确连接的效率、重组导入细胞的效率都不是百分之百的，因而最后生长入细胞的效率都不是百分之百的，因而最后生长繁殖出来的细胞并不同都带有目的序列。一般一繁殖出来的细胞并不同都带有目的序列。一般一个载体只携带某一段外源个载体只携带某一段外源DNA，一个细胞只接一个细
28、胞只接受一个重组受一个重组DNA分子。最后培养出来的细胞群分子。最后培养出来的细胞群中只有一部分、甚至只有很小一部分是含有目的中只有一部分、甚至只有很小一部分是含有目的序列的重组体（序列的重组体（recombinant）。）。将目的重组体将目的重组体筛选出来就等于获得了目的序列的克隆，所以筛筛选出来就等于获得了目的序列的克隆，所以筛选是基因克隆的重要步骤。在构建载体，选择宿选是基因克隆的重要步骤。在构建载体，选择宿主细胞、设计分子克隆方案时都必须仔细考虑筛主细胞、设计分子克隆方案时都必须仔细考虑筛选的问题。选的问题。一、根据重组载体的标志作筛选一、根据重组载体的标志作筛选 最最常常见见的的载载
29、体体携携带带的的标标志志是是抗抗药药性性标标志志，如如抗抗氨氨芐芐青青霉霉素素（amp-r）、抗抗四四环环素素(ter-r)、抗抗卡卡那那霉霉素素(kan-r)等等。当当培培养养基基中中含含有有抗抗生生素素时时，只只有有携携带带相相应应抗抗药药性性基基因因载载体体的的细细胞胞才才能能生生存存繁繁殖殖，这这就就把把凡凡未未能能接接受受载载体体DNA的的细胞全部筛除掉了。细胞全部筛除掉了。如果外源目的序列是插在载体抗药性基因中间，如果外源目的序列是插在载体抗药性基因中间，使抗药性基因失活，这个抗药性标志就会消失。使抗药性基因失活，这个抗药性标志就会消失。例如质粒例如质粒pBR322含有含有amp、
30、ter两个抗药基因，两个抗药基因，若将目的序列插入若将目的序列插入ter基因序列中，转化大肠杆基因序列中，转化大肠杆菌，让细菌放在含氨芐青霉素或四环素培养基中，菌，让细菌放在含氨芐青霉素或四环素培养基中，凡未接受质粒凡未接受质粒DNA的细胞都不能生长；凡在含的细胞都不能生长；凡在含氨芐青霉素和四环素中都能生长的细菌是含有质氨芐青霉素和四环素中都能生长的细菌是含有质粒粒pBR322的，但其的，但其pBR322未插入目的序列，凡未插入目的序列，凡在氨芐青霉素中能生长、而在四环素中不能生长在氨芐青霉素中能生长、而在四环素中不能生长的细菌就很可能是含有目的序列的重组质粒。的细菌就很可能是含有目的序列的重组质粒。 载体含有载体含有lacZ的蓝白筛选法，近年更被的蓝白筛选法，近年更被广泛应用。例如将目的序列插入前面述广泛应用。例如将目的序列插入前面述及的质粒及的质粒pUC19的多克隆位点，转化大的多克隆位点，转化大肠杆菌，放入含氨芐青霉素、肠杆菌，放入含氨芐青霉素、IPTG、X-gal的培养基中培养，凡能生长并呈白色的培养基中培养，凡能生长并呈白色的菌落，其细菌中就很可能含有插入目的菌落，其细菌中就很可能含有插入目的序列的重组质粒，这样就很容易获得的序列的重组质粒，这样就很容易获得目的序列的克隆。目的序列的克隆。
