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1、实验一实验一 细菌质粒细菌质粒DNADNA的提取和纯化的提取和纯化实验细菌转化课件一、实验目的一、实验目的 通过细菌质粒通过细菌质粒DNADNA的提取，掌握共价闭合环状的提取，掌握共价闭合环状DNADNA的提取方法。的提取方法。实验细菌转化课件二、实验原理二、实验原理1.细菌中有两种细菌中有两种DNA，即染色体即染色体DNA和质粒和质粒DNA。2.质粒质粒DNA的提取方法有三种：的提取方法有三种：碱裂解法碱裂解法、煮沸法和去污、煮沸法和去污剂（如剂（如Triton和和SDS）裂解法。裂解法。3.碱裂解法比较剧烈，可破坏碱基配对，使宿主细胞碱裂解法比较剧烈，可破坏碱基配对，使宿主细胞DNA变性，
2、共价闭合环状变性，共价闭合环状DNA由于空间缠绕，两条链不会彻由于空间缠绕，两条链不会彻底分开。当外界条件到达复性条件时，质粒底分开。当外界条件到达复性条件时，质粒DNA的双链的双链又迅速恢复原状，而较大的线性染色体又迅速恢复原状，而较大的线性染色体DNA难以复性。难以复性。实验细菌转化课件三、实验菌株三、实验菌株含质粒载体含质粒载体pGEM-TpGEM-T的大肠杆菌（的大肠杆菌（E. coli.E. coli.）实验细菌转化课件四、实验用具和药品四、实验用具和药品实验用具实验用具摇床、离心机、移液器及枪头、玻璃试管（摇床、离心机、移液器及枪头、玻璃试管（15mL15mL）及）及塞子、离心管（
3、塞子、离心管（1.5mL1.5mL）。实验细菌转化课件LB培养基配方：培养基配方：ddH2O950mL细菌培养用胰化蛋白胨（bacto-tryptone）10g细菌培养用酵母提取物（bacto-yeast extract）5gNaCl 10g琼脂粉（配制固体培养基时需加入）15gNaOH调节pH至7.0（5mol/L 约0.2mL），高压灭菌固体平板上添加氨苄青霉素实验细菌转化课件实验药品实验药品溶液溶液（高压灭菌）：（高压灭菌）： 50 mmol/L 50 mmol/L 葡萄糖葡萄糖 25 mmol/L Tris.Cl 25 mmol/L Tris.Cl（pH8.0pH8.0） 10 mmo
4、l/L EDTA 10 mmol/L EDTA（pH8.0pH8.0）溶液溶液（现用现配）：（现用现配）： 0.2 mol/L NaOH( 0.2 mol/L NaOH(临用前用临用前用10mol/L10mol/L的溶液稀释）的溶液稀释） 1% SDS 1% SDS溶液溶液： 5 mol/L 5 mol/L乙酸钾乙酸钾 60mL 60mL 冰乙酸冰乙酸 11.5mL 11.5mL 水水 28.5mL 28.5mL实验细菌转化课件五、实验步骤五、实验步骤方法：活化方法：活化- -扩增扩增- -离心离心- -裂解裂解- -离心离心- -抽提抽提- -沉淀沉淀- -洗涤洗涤- -溶解溶解（一）细菌繁
5、殖（一）细菌繁殖实验前实验前2 2天晚上天晚上： 将冻存的菌株取出，划线接种于将冻存的菌株取出，划线接种于LBLB（ampamp）平板上，）平板上， 置于置于3737培养箱中，倒置培养至菌落长成。培养箱中，倒置培养至菌落长成。实验前实验前1 1天晚上：天晚上：从从LBLB平板上挑取单个菌落，接种于平板上挑取单个菌落，接种于6mlLB6mlLB液体培养基（加液体培养基（加入氨苄青霉素）中，入氨苄青霉素）中，3737，过夜振荡（，过夜振荡（200r/min200r/min）培养。）培养。实验细菌转化课件（二）菌体收集（二）菌体收集实验当天实验当天 ：1.1.将过夜培养的菌体转入将过夜培养的菌体转入
6、1.5mL1.5mL离心管，离心管，5000r/min5000r/min离心离心2min2min；2.2.弃上清弃上清实验细菌转化课件（三）碱裂解法提取质粒（三）碱裂解法提取质粒DNADNA 全套操作约需全套操作约需1 1小时，详细说明如下。小时，详细说明如下。 3.3. 加入加入250 l250 l的的Solution Solution （含（含RNase A1RNase A1）充分悬浮细菌沉）充分悬浮细菌沉淀。淀。 注）注意不要残留细小菌块，可以使用振荡器（注）注意不要残留细小菌块，可以使用振荡器（VortexVortex）等）等剧烈振荡使菌体充分悬浮。剧烈振荡使菌体充分悬浮。 4.4.
7、加入加入250 l250 l的的Solution Solution 轻轻地上下翻转混合轻轻地上下翻转混合5 56 6次，使次，使菌体充分裂解，形成透明溶液。菌体充分裂解，形成透明溶液。 注）此步骤不宜超过注）此步骤不宜超过5 5分钟。分钟。 5.5. 加入加入400 l400 l的的44预冷的预冷的Solution Solution ，轻轻上下翻转混合，轻轻上下翻转混合5 56 6次，直至形成紧实凝集块，然后室温静置次，直至形成紧实凝集块，然后室温静置2 2分钟。分钟。6.6. 室温室温12,000 rpm12,000 rpm离心离心1010分钟，取上清。分钟，取上清。注）此时注）此时44离心
8、不利于沉淀沉降。离心不利于沉淀沉降。 7.7. 将试剂盒中的将试剂盒中的Spin ColumnSpin Column安置于安置于Collection Tube Collection Tube 上。上。8.8. 将上述操作将上述操作6 6的上清液转移至的上清液转移至Spin ColumnSpin Column中，中，12,000 rpm12,000 rpm离离心心1 1分钟，弃滤液。分钟，弃滤液。实验细菌转化课件9.9. 将将500 l的的Rinse A加入加入Spin Column中，中，12,000 rpm离心离心30秒钟，秒钟，弃滤液。弃滤液。 10.10. 将将700 l的的Rinse
9、B加入加入Spin Column中，中，12,000 rpm离心离心30秒钟，秒钟，弃滤液。弃滤液。 11.11. 重复操作步骤重复操作步骤10。12.12. 将将Spin Column安置于安置于Collection Tube上，上，12,000 rpm离心离心1分钟。分钟。 13.13. 将将Spin Column安置于新的安置于新的1.5 ml的离心管上，在的离心管上，在Spin Column膜的中央膜的中央处加入处加入60 l的灭菌蒸馏水或的灭菌蒸馏水或Elution Buffer，室温静置，室温静置1分钟。分钟。 注）把灭菌蒸馏水或注）把灭菌蒸馏水或Elution Buffer加热加
10、热至至60使用时有利于提高洗脱效率使用时有利于提高洗脱效率14.14. 12,000 rpm离心离心1分钟洗脱分钟洗脱DNA。 实验细菌转化课件六、实验作业六、实验作业1.1.按上述实验步骤提取质粒按上述实验步骤提取质粒DNADNA。2.2.思考本实验的关键步骤是什么？思考本实验的关键步骤是什么？答：本实验的关键是溶液答：本实验的关键是溶液重悬须充分，重悬须充分，溶液溶液混合须温和。混合须温和。实验细菌转化课件实验二实验二 大肠杆菌的遗传转化大肠杆菌的遗传转化实验细菌转化课件一、实验目的一、实验目的通过实验了解原核生物实现基因转移的途径，掌握质粒DNA遗传转化的基本原理和操作方法。 实验细菌转
11、化课件二、实验原理二、实验原理1.1.转化（转化（transformationtransformation）是指一种生物由于接受了另一是指一种生物由于接受了另一种生物（或同种生物）的遗传物质，从而获得了后者的种生物（或同种生物）的遗传物质，从而获得了后者的某些遗传性状或发生遗传性状改变的现象。某些遗传性状或发生遗传性状改变的现象。2.2.细菌处于容易吸收外源细菌处于容易吸收外源DNADNA的状态叫的状态叫感受态感受态。3.3.用理化方法人工诱导细菌进入感受态的操作叫致敏过程。用理化方法人工诱导细菌进入感受态的操作叫致敏过程。4.4.目前应该较广的转化方法有两种：目前应该较广的转化方法有两种：C
12、aClCaCl2 2转化法（化学转转化法（化学转化法）和电转化法。化法）和电转化法。5.5.CaClCaCl2 2转化法的原理是在低温（转化法的原理是在低温（00）和低渗的）和低渗的CaClCaCl2 2溶液溶液中，菌体膨胀，转化混合物中的中，菌体膨胀，转化混合物中的DNADNA形成抗形成抗DNADNA酶的羟基酶的羟基- -钙磷酸复合物黏附于细菌细胞表面，经钙磷酸复合物黏附于细菌细胞表面，经4242短时间热击，短时间热击，促进细胞吸收促进细胞吸收DNADNA复合物。复合物。 实验细菌转化课件三、实验材料三、实验材料1.质粒pGEM-T easy ：编码氨苄青霉素（Ampr）的抗性基因2.大肠杆
13、菌（E.coli）DH5菌株：氨苄青霉素敏感型（Amp-）实验细菌转化课件四、实验用品四、实验用品1.超净工作台、摇床2.水浴锅、离心机3.分光光度计、移液器及枪头4.三角瓶（500mL、200mL）5.离心管（50mL、1.5mL）6.平板（Ampr、Amp-）、LB培养基7.冰冷的CaCl2溶液、质粒DNA实验细菌转化课件u 0.1M CaCl2溶液配制： 称量1.11g无水CaCl2固体，溶于1000ml双蒸水中，高压灭菌或0.22um滤器过滤除菌。保存于4度冰箱中。u质粒的提取： 利用质粒提取试剂盒提取质粒DNA。 实验细菌转化课件五、实验步骤五、实验步骤（一）感受态的制备（一）感受态
14、的制备( (此步骤已完成）此步骤已完成）1、E. Coli涂布于平板（Amp-），37，培养12h；2、挑取单菌落，转移至盛有200mL LB的500mL三角瓶中，37，振荡（200r/min）培养12h；实验细菌转化课件 3、吸取1mL菌液，转移至盛有100mL LB的200mL三角瓶中，37，振荡（200r/min）培养23h，每隔0.5h测OD600值；4、当OD600=0.30.4（对数生长期的OD600=0.6）取出；冰上放置1060min；5、4，5000rpm，离心10min，弃上清；6、冰预冷的0.1mol/L CaCl2 10mL悬浮细胞；7、冰上放置15min；8、4，50
15、00rpm，离心10min，弃上清；9、冰预冷的0.1mol/L CaCl2 2mL悬浮细胞；10、用于转化实验；若需保存，加入终浓度15%的甘油，-70保存。实验细菌转化课件（二）转化（冰上操作）（二）转化（冰上操作）1、1.5mL管中加入感受态细胞50L和待转化的质粒2L，冰浴30min30min；2、42热击90sec90sec（勿晃动管子）；3、冰浴2min2min；4、加入37预热的LB至1mL；5、37，振荡（50r/min）培养2h2h；6、取200L涂板（Ampr），37培养12-16h12-16h； 7、对生长出的白色菌落计数，计算出每微升质粒的转化率。实验细菌转化课件六、实验作业六、实验作业1.计算出大肠杆菌的转化率，转化率 = 平板上的白色菌落数2L。2.转化过程中，会不会出现假阳性的结果，为什么？如何排除？答：转化过程中，经常出现假阳性。原因很多，如质粒、菌株不纯，载体自连等。详细的解释见分子遗传学。实验细菌转化课件
