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1、 第六章第六章基因工程菌苗研究的现状与发展基因工程菌苗研究的现状与发展（Statusanddevelopmentofgeneengineeringbacteriavaccine） 第一节第一节概述概述（SectionIoutline）1883年年-1885年巴斯德（年巴斯德（Pasteur）用理化和生物学方法制备了减用理化和生物学方法制备了减毒的炭疽菌苗和狂犬疫苗等。毒的炭疽菌苗和狂犬疫苗等。19世纪以来用菌苗免疫人畜，明显减少了传染病的发生。其中世纪以来用菌苗免疫人畜，明显减少了传染病的发生。其中比较成功的是破伤风、白喉类毒素疫苗的应用，其效果可达比较成功的是破伤风、白喉类毒素疫苗的应用，其
2、效果可达95%以上。在发达国家破伤风、白喉、百日咳、嗜血性流感的发病率以上。在发达国家破伤风、白喉、百日咳、嗜血性流感的发病率明显降低。抗菌药物的发明和应用，使临床常见的细菌性感染和明显降低。抗菌药物的发明和应用，使临床常见的细菌性感染和病死率大幅下降。病死率大幅下降。基因工程菌苗研究的现状与发展课件 细细菌菌一一旦旦获获得得耐耐药药性性，存存在在与与细细菌菌染染色色体体、质质粒粒和和转转座座子子中中的的耐耐药药基基因因就就可可通通过过转转化化、转转导导、接接合合和和转转座座等等方方式式，将将抗抗性性基基因因传传播播到到其其他他敏敏感感菌菌，使使之之成成为为抗抗药药菌菌株株，给给临临床床传传染
3、染病病的的治治疗疗带带来来困困难难。据据WHO1996年年报报告告，全全球球每每年年死死亡亡约约5190万人，其中万人，其中1/3约约1730万死于传染病。万死于传染病。基因工程菌苗研究的现状与发展课件在在过过去去20年年中中，有有29种种新新传传染染病病出出现现。美美国国Satcher博博士士在在EmergingInfectiousDiseases杂杂志志创创刊刊刊刊号号列列出出自自1973年年以以来来鉴鉴定定的的主主要要传传染染病病或或病病原原体体22种种。近近年年鉴鉴定定的的新新病病原原体体和和疾疾病病鉴鉴定定年年份份依依次次列列于表于表6-1。基因工程菌苗研究的现状与发展课件表表6-1
4、 6-1 新鉴定的病原体新鉴定的病原体 年份年份病原体病原体所致疾病所致疾病1975微小病毒微小病毒B19（pawovirusB19）5号病，慢性溶血性贫血号病，慢性溶血性贫血中的再障危象中的再障危象1976隐孢子虫（隐孢子虫（cryptosporidium）隐孢子虫病，急性小肠隐孢子虫病，急性小肠结肠炎结肠炎1977埃博拉病毒（埃博拉病毒（ebolavirus）埃博拉出血热埃博拉出血热1977军团病杆菌（军团病杆菌（legionellapneumophila）军团病军团病1977汉坦病毒（汉坦病毒（hantsannvirus）肾综合症出血热肾综合症出血热1977弯曲杆菌（弯曲杆菌（campy
5、lobacter）空肠弯曲杆菌肠炎空肠弯曲杆菌肠炎1980人嗜人嗜T淋巴细胞病毒（淋巴细胞病毒（HTLV-1）T细胞淋巴瘤白血病细胞淋巴瘤白血病1981葡萄球菌毒素（葡萄球菌毒素（toxinproducingaureus）中毒性休克综合症中毒性休克综合症1982大肠杆菌大肠杆菌O157：H7（E.coliO157:H7）出血性肠炎，溶血性尿出血性肠炎，溶血性尿毒综合症毒综合症基因工程菌苗研究的现状与发展课件1982HTLV-II毛皮样细胞白血病毛皮样细胞白血病1982伯氏疏螺旋体（伯氏疏螺旋体（Borreliaburgdorferi）莱姆病莱姆病1983HIV艾滋病艾滋病1983幽门螺杆菌（幽
6、门螺杆菌（Helicobacterpylori）胃溃疡胃溃疡1988人疱疹病毒人疱疹病毒6型（型（HHV-6）突发性玫瑰疹突发性玫瑰疹1989查菲氏欧利希氏体查菲氏欧利希氏体人欧利希氏病人欧利希氏病1989丙型肝炎病毒（丙型肝炎病毒（hepatitisC）丙型肝炎丙型肝炎1990戊戊型肝炎病毒（型肝炎病毒（hepatitisE）戊型肝炎戊型肝炎1991Guonarito病毒病毒委内瑞拉出血热委内瑞拉出血热1992霍乱弧菌霍乱弧菌O139地方性流行性霍乱地方性流行性霍乱1992巴尔道氏体（巴尔道氏体（Bartonellahenselae）猫抓病、细菌性血管瘤病猫抓病、细菌性血管瘤病1992环形孢
7、子环形孢子环形孢子虫病环形孢子虫病基因工程菌苗研究的现状与发展课件1993汉坦病毒分离株汉坦病毒分离株汉坦病毒综合症汉坦病毒综合症1993Sinnombrevirus1994Sabia病毒病毒巴西出血热巴西出血热1995庚型肝炎病毒（庚型肝炎病毒（hepatitisG）庚型肝炎庚型肝炎1995人疱疹病毒人疱疹病毒8型（型（HHV-8）卡波济肉瘤，淋巴瘤卡波济肉瘤，淋巴瘤1996朊病毒（朊病毒（prion）(BSE,TSE)传染性海绵状脑病，克雅病传染性海绵状脑病，克雅病1997TT病毒（病毒（TTVirus）TTV肝炎肝炎1999尼巴病毒（尼巴病毒（nipahvirus）发热性脑炎发热性脑炎1
8、999伊氏埃立克体（伊氏埃立克体（Ehrlichiaewingii）人埃立克体病人埃立克体病 基因工程菌苗研究的现状与发展课件新新病病原原体体不不断断出出现现与与鉴鉴定定，新新的的疫疫苗苗研研制制也也相相继继开开始。始。重重要要病病原原体体全全基基因因测测序序的的开开展展和和完完成成，及及类类似似生生物物表表型型的的不不同同菌菌属属间间的的同同源源序序列列和和异异源源序序列列的的发发现现，对对抗抗感感染染研研究究来来说说，像像进进行行了了一一场场革革命命，不不仅仅会会促促进进病病原原体体致致病病和和发发病病机机制制的的研研究究，也也会会开开阔阔和和调调整整菌苗研究的策略和思路。菌苗研究的策略和
9、思路。目目前前已已完完成成500500余余种种病病毒毒的的全全基基因因测测序序，关关于于重重要要病原菌全基因测序进展情况列于表病原菌全基因测序进展情况列于表6-26-2。 基因工程菌苗研究的现状与发展课件完成的完成的正在进行的正在进行的将要进行的将要进行的流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌（Haemophilusinfluenzae）放线性放线菌放线性放线菌（Actinobacillusactinomycetemcomitans）弯曲杆菌（弯曲杆菌（Campylobacterjejuni）生殖道支原体生殖道支原体（Mycoplasmagenitolium）枸巢曲霉杆菌（枸巢曲霉杆菌（Aspergillu
10、smidulans）流产布氏杆菌（流产布氏杆菌（Brucellaabortus）肺炎支原体肺炎支原体（Mycoplasmapneumoniae）枯草杆菌（枯草杆菌（Bacillussubtilis）杜克雷嗜血杆菌（杜克雷嗜血杆菌（Haemophilusducreyi）幽门螺杆菌幽门螺杆菌（Helicobacterpylori）沙眼衣原体（沙眼衣原体（Chlamydiatrachomatio）鸟分枝杆菌（鸟分枝杆菌（Mycobacteriumavium）伯氏疏螺旋体伯氏疏螺旋体（Borreliaburgdorferi）粪肠球菌（粪肠球菌（Enterococcusfaecalis,E.faeciu
11、m）多杀巴斯德菌（多杀巴斯德菌（Pasteurellamultocida）表表6-2 6-2 人类重要病原菌全基因测序现状人类重要病原菌全基因测序现状 基因工程菌苗研究的现状与发展课件E.coliK12军团菌（军团菌（Legionellapneumopbila）牙龈卟啉单胞菌牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonasgingvalis）肺炎球菌肺炎球菌（Streptococcuspneumoniae）麻风分枝杆菌（麻风分枝杆菌（Mycobacterunleprae）鼠伤寒沙门氏菌鼠伤寒沙门氏菌（SalmonellaserotypeTyphimurium）梅毒螺旋体梅毒螺旋体（Treponeme
12、pallidun）淋病脑膜炎奈瑟氏球菌（淋病脑膜炎奈瑟氏球菌（Neisseriagonorrhoeae,N.meningitidis）布氏锥虫布氏锥虫（Trypanosomabrucei）解脲原体解脲原体（Ureoplasmaurealyticum）亚性疟（亚性疟（plasmodiumfalciparum）痢疾杆菌痢疾杆菌（Shigella）绿脓杆菌（绿脓杆菌（Pseudomonasaeruginosa）大型利什曼原虫大型利什曼原虫（Leishmaniamajor）金黄色葡萄球菌（金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）霍乱弧菌（霍乱弧菌（Vibriocholerae）化脓链
13、球菌（化脓链球菌（Streptococcuspyogenes）基因工程菌苗研究的现状与发展课件 总之，已控制传染病的再现及新传总之，已控制传染病的再现及新传染病的出现，已引起全球的注意，对染病的出现，已引起全球的注意，对传染病威胁需要再认识，已有共识。传染病威胁需要再认识，已有共识。因此，有必要加快进行创新性的细菌因此，有必要加快进行创新性的细菌菌苗的研制与开发。菌苗的研制与开发。基因工程菌苗研究的现状与发展课件 第二节第二节目前应用的菌苗及其存在问题目前应用的菌苗及其存在问题Presentbacteriavaccineandthequestion一、目前应用菌苗的类别一、目前应用菌苗的类别T
14、hetypeofbacteriavaccine按菌苗所含的成份，菌苗可分为九类，即按菌苗所含的成份，菌苗可分为九类，即减毒减毒的活菌苗、灭活的死菌苗、纯化的多糖或蛋白成的活菌苗、灭活的死菌苗、纯化的多糖或蛋白成份苗、基因缺失活菌苗、载体重组活菌苗、核酸份苗、基因缺失活菌苗、载体重组活菌苗、核酸菌苗、联合重组菌苗、多价菌苗、多糖与蛋白结菌苗、联合重组菌苗、多价菌苗、多糖与蛋白结合菌苗合菌苗。 基因工程菌苗研究的现状与发展课件1、减毒的活菌苗（、减毒的活菌苗（Attenuatedbacteriavaccine）如卡介苗（如卡介苗（BCG），），是巴斯德研究院是巴斯德研究院Calmette和和Gue
15、rin等（等（1921）将一株牛型强毒结核菌在甘油）将一株牛型强毒结核菌在甘油-胆胆汁汁-马铃薯培养基上传马铃薯培养基上传230代后（代后（13年），获得的对动年），获得的对动物不致病，但产生抗结核免疫反应的菌苗即物不致病，但产生抗结核免疫反应的菌苗即BCG。对对免疫婴幼儿有保护效果。免疫婴幼儿有保护效果。后来发现对成人的保护效果波动范围很大，对其减后来发现对成人的保护效果波动范围很大，对其减毒机制始终不清。直至近年来完成结核分枝杆菌全基毒机制始终不清。直至近年来完成结核分枝杆菌全基因测序后，与有毒牛型结核分枝杆菌全基因序列进行因测序后，与有毒牛型结核分枝杆菌全基因序列进行比较，方知比较，方知
16、BCG缺失了毒力相关基因。缺失了毒力相关基因。总之，对胞内菌目前还是用减毒的活菌苗。总之，对胞内菌目前还是用减毒的活菌苗。 基因工程菌苗研究的现状与发展课件2、灭活菌苗、灭活菌苗（Deadbacteriavaccine）通过加热处理或福尔马林（通过加热处理或福尔马林（formaldehyde）、）、戊二醛（戊二醛（glutaraldehyde）、）、-内酯（内酯（-propiolactone）等化学处理得到。如霍乱死菌）等化学处理得到。如霍乱死菌苗、百日咳（苗、百日咳（Bordetellapertussis）死菌苗等。死菌苗等。死菌苗的主要优点是稳定，缺点是需要多次死菌苗的主要优点是稳定，缺点
17、是需要多次免疫才能得到好的保护效果。免疫才能得到好的保护效果。基因工程菌苗研究的现状与发展课件3 3、 亚亚 单单 位位 或或 成成 分分 苗苗 （ Subunitbacteriavaccine） 从从细细菌菌培培养养液液中中提提取取、用用化化学学方方法法脱脱毒毒的的类类毒毒素素苗苗，如如破破伤伤风风类类毒毒素素（TTTT）、白白喉喉类类毒毒素素（DTDT），免免疫疫后后诱诱导导机机体体产产生生的的抗抗血血清清能能特特异异中中和和TTTT破破伤伤风风类类毒毒素素或或DTDT白白喉喉类类毒毒素素，其其保保护护效效果果可可达达95%95%以以上上。由由于于毒毒素素纯纯化化方方法法的的改改进进，产品
18、的副作用很小。产品的副作用很小。 基因工程菌苗研究的现状与发展课件荚荚膜膜细细菌菌纯纯化化的的多多糖糖菌菌苗苗，可可诱诱导导产产生生的的抗抗体体能能保保护护机机体体抵抵抗抗入入侵侵荚荚膜膜菌菌的的感感染染。如如嗜嗜血血性性流流感感杆杆菌菌b（Hib）、伤伤寒寒杆杆菌菌Vi多多糖糖等等多多糖糖苗苗，能能诱诱导导机机体体产产生生T细细胞胞非非依依赖赖的的抗抗体体反反应应，其其特特点点是是诱诱导导产产生生短短期期的的IgM抗抗体体，缺缺乏乏免免疫疫记记忆忆，对对不不到到18个个月月幼幼儿儿的的多多糖糖苗苗免免疫疫原原性性差差，而而没没有有保保护护效果。因此多糖类的菌苗急需改进。效果。因此多糖类的菌苗
19、急需改进。 基因工程菌苗研究的现状与发展课件目前，将多糖与载体蛋白共价连接，通过载体蛋目前，将多糖与载体蛋白共价连接，通过载体蛋目前，将多糖与载体蛋白共价连接，通过载体蛋目前，将多糖与载体蛋白共价连接，通过载体蛋白提供适当的白提供适当的白提供适当的白提供适当的T T细胞表位，由细胞表位，由细胞表位，由细胞表位，由T T细胞协助细胞协助细胞协助细胞协助B B细胞产生细胞产生细胞产生细胞产生多糖特异性抗体，使多糖特异性抗体，使多糖特异性抗体，使多糖特异性抗体，使T T细胞非依赖性抗原转变为细胞非依赖性抗原转变为细胞非依赖性抗原转变为细胞非依赖性抗原转变为T T细细细细胞依赖抗原，这类菌苗称为胞依赖
20、抗原，这类菌苗称为胞依赖抗原，这类菌苗称为胞依赖抗原，这类菌苗称为多糖多糖多糖多糖- -蛋白结合苗蛋白结合苗蛋白结合苗蛋白结合苗。如。如。如。如嗜血流感杆菌嗜血流感杆菌嗜血流感杆菌嗜血流感杆菌HibHib的结合苗已在几个国家获得证书，的结合苗已在几个国家获得证书，的结合苗已在几个国家获得证书，的结合苗已在几个国家获得证书，证明对不到证明对不到证明对不到证明对不到1818个月的儿童有很高的免疫原性，能诱个月的儿童有很高的免疫原性，能诱个月的儿童有很高的免疫原性，能诱个月的儿童有很高的免疫原性，能诱导免疫记忆，免疫球蛋白的类型转换及抗体亲和力导免疫记忆，免疫球蛋白的类型转换及抗体亲和力导免疫记忆，
21、免疫球蛋白的类型转换及抗体亲和力导免疫记忆，免疫球蛋白的类型转换及抗体亲和力成熟，明显减少成熟，明显减少成熟，明显减少成熟，明显减少HibHib菌的入侵感染与发病。菌的入侵感染与发病。菌的入侵感染与发病。菌的入侵感染与发病。基因工程菌苗研究的现状与发展课件表表6-3 6-3 目前可用于人群的菌苗目前可用于人群的菌苗 菌苗菌苗类型类型预防的疾病预防的疾病国内国内 国外国外1卡介苗卡介苗（BCG）活菌苗活菌苗结核病结核病i.di.d2布氏病菌苗布氏病菌苗（104M）活菌苗活菌苗布氏菌病布氏菌病d.s3鼠疫菌苗鼠疫菌苗（EV）活菌苗活菌苗鼠疫鼠疫d.s4炭疽菌苗炭疽菌苗（A16R,CTN-1,V77
22、0-NP-1）活芽胞苗活芽胞苗炭疽炭疽d.s炭疽菌苗炭疽菌苗灭活菌苗灭活菌苗炭疽炭疽s.c基因工程菌苗研究的现状与发展课件菌苗菌苗类型类型预防的疾病预防的疾病国内国内国外国外5百日咳菌苗百日咳菌苗类毒素类毒素灭活菌苗灭活菌苗百日咳百日咳炭疽炭疽i.mi.m6脑膜炎球菌苗（脑膜炎球菌苗（A、C群）群）多糖成分多糖成分脑膜炎脑膜炎i.ms.c7脑膜炎球菌苗脑膜炎球菌苗（A/C/Y/W-35群）群）多糖成分多糖成分脑膜炎脑膜炎s.c8流脑流脑A群多糖群多糖-破伤风破伤风蛋白结合菌蛋白结合菌苗苗多糖多糖-蛋白结蛋白结合苗合苗流行性脑脊流行性脑脊髓膜炎髓膜炎i.m9伤寒菌苗（伤寒菌苗（Ty21a）伤寒菌
23、苗（伤寒菌苗（Ty21a）伤寒伤寒Vi多糖苗多糖苗活菌苗活菌苗灭活全菌苗灭活全菌苗多糖成分多糖成分伤寒伤寒伤寒伤寒伤寒伤寒i.mp.os.ci.m10精制破伤风菌苗精制破伤风菌苗类毒素类毒素破伤风破伤风i.mi.m11精制白喉菌苗精制白喉菌苗类毒素类毒素白喉白喉i.m基因工程菌苗研究的现状与发展课件菌苗菌苗类型类型预防的疾病预防的疾病国内国内国外国外12白白-百百-破三联苗破三联苗（DTP）类毒素类毒素白喉，百日咳白喉，百日咳i.m灭活全苗灭活全苗破伤风破伤风i.m13白白-破破-百三联百三联（DTaP）类毒素类毒素白喉，百日咳白喉，百日咳i.m白白-破破-百三联苗百三联苗灭活全苗灭活全苗破伤
24、风破伤风i.m14白白-破二联苗（破二联苗（DT或或Td）类毒素类毒素白喉，破伤风白喉，破伤风i.mi.m15钩端螺旋体菌苗钩端螺旋体菌苗外膜成苗外膜成苗钩端螺旋体病钩端螺旋体病s.c16霍乱弧菌（霍乱弧菌（O139）灭活全菌灭活全菌苗苗霍乱霍乱s.cS,c/i.d17CVD103HgR基因工程基因工程活苗活苗霍乱霍乱p.o18肺炎球菌（肺炎球菌（23型）型）多糖成分多糖成分肺炎肺炎p.o基因工程菌苗研究的现状与发展课件菌苗菌苗类型类型预防的疾病预防的疾病国内国内国外国外19嗜血流感杆菌嗜血流感杆菌B型型（Hib）类毒素类毒素脑膜炎脑膜炎i.m20DTP-嗜血流感杆菌嗜血流感杆菌B型结合苗型结
25、合苗灭活的全菌灭活的全菌苗苗白喉，百日白喉，百日咳，咳，i.m（DTP-Hib）细菌多糖细菌多糖-蛋蛋白结合菌苗白结合菌苗破伤风，脑破伤风，脑膜炎膜炎i.m21福氏福氏2a与宋内双价痢与宋内双价痢疾菌苗（疾菌苗（FSM2117）基因工程活基因工程活苗苗痢疾痢疾p.oF2a与宋内双价痢疾与宋内双价痢疾菌苗（菌苗（FS）基因工程活基因工程活苗苗痢疾痢疾p.o22 莱姆病菌苗（莱姆病菌苗（OspA）重组重组OspA莱姆病莱姆病s.c注：注：i.d皮内，皮内，s.c皮下，皮下，d.s划痕，划痕，i.m肌注，肌注，p.o口服口服基因工程菌苗研究的现状与发展课件（二）研制菌苗的新方法（二）研制菌苗的新方法
26、（Newmethodofproducebacteriavaccine）1 1、研制菌苗的新方法（、研制菌苗的新方法（newmethods）对细菌感染发病机制认识的深入及涉及许多病原体毒对细菌感染发病机制认识的深入及涉及许多病原体毒力决定簇如粘附素、侵袭素、荚膜多糖、脂多糖、毒素力决定簇如粘附素、侵袭素、荚膜多糖、脂多糖、毒素等编码基因及其产物的结构与功能的分析与鉴定，是不等编码基因及其产物的结构与功能的分析与鉴定，是不断设计和研制新型疫苗的重要基础。断设计和研制新型疫苗的重要基础。针对不同病原体致病特点和毒力决定簇的特点，发展针对不同病原体致病特点和毒力决定簇的特点，发展和产生了不同的菌苗研制
27、方法，得到不同类型的菌苗。和产生了不同的菌苗研制方法，得到不同类型的菌苗。目前研制菌苗新方法及可能的后选菌苗列于表目前研制菌苗新方法及可能的后选菌苗列于表6-46-4 。基因工程菌苗研究的现状与发展课件表表6-4目前研制菌苗的新方法及可能的候选菌苗目前研制菌苗的新方法及可能的候选菌苗1纯化亚纯化亚单位成单位成份份嗜血流感杆菌（荚膜多糖）（嗜血流感杆菌（荚膜多糖）（H.influenze）奈氏脑膜炎球菌（荚膜多糖）奈氏脑膜炎球菌（荚膜多糖）（N.meningitidia）百日咳菌血凝素（百日咳菌血凝素（Hemagglutinin）2合成肽合成肽淋球菌（黏附菌毛）淋球菌（黏附菌毛）（N.gonor
28、ihoeae,Adhernce-pili）肺炎链球菌（肺炎链球菌（Streptococcus）3核酸疫核酸疫苗苗结核分枝杆菌（结核分枝杆菌（M.tuberculosis）产单核细胞李斯特菌（产单核细胞李斯特菌（L.monocytogenes）沙眼衣原体（沙眼衣原体（Chlamydiatrachomatio）伯氏疏螺旋体（伯氏疏螺旋体（Borreliaburgdorferi）基因工程菌苗研究的现状与发展课件4构建突变株构建突变株（化学、辐射、点突变（化学、辐射、点突变或转座子插入等）或转座子插入等）伤寒菌苗伤寒菌苗Ty21a（S.typhi,Ty21a）霍乱菌苗（霍乱菌苗（V.Cholerae）
29、CVD103HgRETEC苗苗5与与CT-B，LT，TT，DT等化学结合等化学结合伤寒伤寒Vi抗原抗原痢疾菌苗痢疾菌苗,嗜血流感杆菌苗嗜血流感杆菌苗6构建重组细菌载体构建重组细菌载体重组病毒载体重组病毒载体HbsAg肠沙门氏菌载体肠沙门氏菌载体宋内氏痢疾菌宋内氏痢疾菌LPS痢疾菌载体痢疾菌载体痢疾多价菌苗痢疾多价菌苗耶尔森氏菌载体耶尔森氏菌载体BCG载体载体幽门螺杆菌溶酶素幽门螺杆菌溶酶素腺病毒载体腺病毒载体霍乱菌载体霍乱菌载体基因工程菌苗研究的现状与发展课件2、目前菌苗存在的问题（、目前菌苗存在的问题（questions）（1）尽管疫苗免疫取得了巨大的成功，）尽管疫苗免疫取得了巨大的成功，但
30、小于但小于5岁的婴幼儿每年死于传染病的数岁的婴幼儿每年死于传染病的数目仍然很高。目仍然很高。如疟疾几种腹泻病等均无有如疟疾几种腹泻病等均无有效疫苗，虽然卡介苗（效疫苗，虽然卡介苗（BCG）使用几十）使用几十年了，甚至纳入年了，甚至纳入WHO的计划免疫，但其的计划免疫，但其效果波动很大效果波动很大0%80%，因此急需安全有，因此急需安全有效的结核菌苗问世。效的结核菌苗问世。基因工程菌苗研究的现状与发展课件（2 2）与病毒相比）与病毒相比：基基因因工工程程细细菌菌及及细细菌菌核核酸酸苗苗报报导导明明显显少少。至至今今国国际际上上还还没没有有成成功功满满意意的的重重组组细细菌菌苗苗提提供供人人群群使
31、使用用。关关于于细细菌菌毒毒素素的的分分子子及及其其编编码码基基因因与与调调控控机机制制都都比比较较清清楚楚，因因此此，有有关关毒毒素素的的基基因因工工程程菌菌苗苗的的构构建建或或载载体体构构建建等等均无问题。均无问题。但但菌菌外外膜膜上上的的其其它它结结构构如如粘粘附附分分子子，侵侵袭袭蛋蛋白白，鞭鞭毛毛及及脂脂多多糖糖等等分分子子结结构构十十分分复复杂杂，编编码码基基因因多多呈呈丛丛分分布布，如如LPSLPS的的表表达达涉涉及及近近3030个个基基因因的的级级联联反反应应，操操作作起起来来尚尚有有困困难难。因因此此还还有有毒毒力力相相关关或或保保护护相相关关基基因因的的分分离、克隆和表达等
32、基因工程菌苗研制的前期工作要做离、克隆和表达等基因工程菌苗研制的前期工作要做基因工程菌苗研究的现状与发展课件（三）理想菌苗的条件（三）理想菌苗的条件（Idealbacteriavaccinescondition）理想疫苗应该是：理想疫苗应该是：（1 1）安全，遗传性状稳定，无毒性，无致癌）安全，遗传性状稳定，无毒性，无致癌性，无致畸变或致流产性。性，无致畸变或致流产性。（2 2）结构简单清楚，可生物降解，有生物相）结构简单清楚，可生物降解，有生物相容性，与组织抗原无免疫学交叉反应。容性，与组织抗原无免疫学交叉反应。基因工程菌苗研究的现状与发展课件（3 3）对各年龄组人群均有长时间的免疫保护作用
33、。）对各年龄组人群均有长时间的免疫保护作用。（4 4）多价，有更大的覆盖面，最好一次性免疫。）多价，有更大的覆盖面，最好一次性免疫。（5 5）能口服，能有效诱导粘膜免疫。）能口服，能有效诱导粘膜免疫。（6 6）易于生产，储存及服务，不需冷藏。）易于生产，储存及服务，不需冷藏。 每每一一项项要要求求，都都需需要要大大量量的的基基础础研研究究，已已能能提提出出更更为为合合理理的的疫疫苗苗研研究究策策略略，研研制制出出安安全全高高效效，使使用方便，价格低廉的菌苗用方便，价格低廉的菌苗 基因工程菌苗研究的现状与发展课件第三节第三节重要细菌基因工程苗的研究进展重要细菌基因工程苗的研究进展（Develop
34、mentofimportantgeneengineeringbacteriavaccine)当前国内外细菌基因工程菌苗，现有菌苗对重当前国内外细菌基因工程菌苗，现有菌苗对重要细菌感染性疾病的问题有：要细菌感染性疾病的问题有：现有菌苗保护效果不好；现有菌苗保护效果不好；副反应大；副反应大；难以培养的细菌；难以培养的细菌；可诱发癌变，有严重后遗症；可诱发癌变，有严重后遗症；新出现的病原体或新变异病原菌。新出现的病原体或新变异病原菌。基因工程菌苗研究的现状与发展课件一、霍乱菌苗一、霍乱菌苗 ( (Choleravaccine) )霍乱是由革兰氏阴性霍乱弧菌引起的烈性传染病。霍乱是由革兰氏阴性霍乱弧菌
35、引起的烈性传染病。霍乱弧菌在小肠分泌霍乱毒素（霍乱弧菌在小肠分泌霍乱毒素（CTCT）引起腹泻及其他症状。引起腹泻及其他症状。已已知知有有O O抗抗原原，毒毒素素共共调调节节菌菌毛毛（TCPTCP），血血凝凝素素（HAHA），外外膜膜蛋蛋白白（OMPsOMPs）等等，及及引引起起水水样样腹腹泻泻的的霍霍乱乱毒毒素素（CTCT）由由AB5AB5的六聚体构成。的六聚体构成。霍霍 乱乱 产产 毒毒 株株 ctxABctxAB的的 55端端 有有 一一 6kb6kb的的 DNADNA， 依依 次次 有有20t,ace,orfu,cep20t,ace,orfu,cep和和RSRS序序列列与与ctxABct
36、xAB一一起起称称为为霍霍乱乱毒毒素素元元件件（CTXCTX）元元件件，可可进进行行转转移移，与与一一种种丝丝状状噬噬菌菌体体（CTXCTX）有有关关，而非产毒株没有这段而非产毒株没有这段DNA DNA 。基因工程菌苗研究的现状与发展课件据菌体抗原霍乱弧菌可分为据菌体抗原霍乱弧菌可分为200200个以上的血清型个以上的血清型1881-18961881-1896年间的年间的5 5次及次及1899-19231899-1923年的第年的第6 6次大次大流行均由流行均由O1O1群古典型霍乱弧菌引起。群古典型霍乱弧菌引起。第第7 7次大流行自次大流行自19611961年延续至今，波及五大洲年延续至今，波
37、及五大洲19921992年出现了一新的流行株年出现了一新的流行株O139O139血清型霍乱血清型霍乱目前流行的霍乱为目前流行的霍乱为O1O1和和O139O139两种血清型。两种血清型。近十年来研制的新霍乱菌苗有四类：近十年来研制的新霍乱菌苗有四类： 基因工程菌苗研究的现状与发展课件1.1.BS/WC灭活菌苗灭活菌苗( (BS/WCdeadbacteriavaccine） 由由提提取取的的或或重重组组的的霍霍乱乱毒毒素素B B亚亚单单位位（BSBS）及及杀杀死死的的全全菌细胞（菌细胞（WCWC）组成。）组成。2.2.CVD103-HgR减毒活菌苗（减毒活菌苗（Levine1998） 在在美美国国
38、获获准准，为为一一次次剂剂量量的的霍霍乱乱活活菌菌苗苗。它它是是由由霍霍乱乱经经典典型型569B569B菌菌株株构构建建而而成成的的CVD103CVD103减减毒毒株株（CTACTA- -B B+ +）。并并在在其其染染色色体体溶溶血血素素基基因因nlyAnlyA位位点点插插入入汞汞抗抗性性基基因因作作为为筛筛选选标标记。记。3.3.以以沙沙门门氏氏菌菌为为载载体体表表达达霍霍乱乱弧弧菌菌O O抗抗原原的的伤伤寒寒/ /霍霍乱乱双双价价菌苗。菌苗。4.4.O139减毒菌苗候选株减毒菌苗候选株CVD112及及Bengal-15 基因工程菌苗研究的现状与发展课件表表6-5 6-5 重组霍乱菌苗的特
39、性重组霍乱菌苗的特性 菌菌苗苗株株亲株（生亲株（生物型，血物型，血清型）清型）特性特性口服口服副反副反应应a a定居率定居率（% %）b b保护率保护率（% %）c c攻击苗攻击苗排菌率排菌率（% %）d d作者作者JBJBK7K70 0NI NI 6961(E1T6961(E1Tor,Inabaor,Inaba) )ctxAB,ctxAB,HgHgr r中等中等10010090902020Kaper et Kaper et al.(1984)al.(1984)CVCVD1D10202O395(ClaO395(Classical ssical Ogawa)Ogawa)ctxA,ctxA,胸腺嘧
40、胸腺嘧啶营养啶营养缺陷型缺陷型无无4040N.DN.Df fN.DN.DLevine et Levine et al(1988b)al(1988b)CVCVD1D10505O395(ClaO395(Classical ssical Ogawa)Ogawa)ctxA, ctxA, hlyAhlyA中等中等100100N.DN.DN.DN.DLevine et Levine et al(1988b)al(1988b)基因工程菌苗研究的现状与发展课件CVD103CVD103-HgR -HgR 569B(Ca569B(Cassical,ssical,Inaba)Inaba) ctxA ctxA hly
41、A:mer hlyA:mer 无无 28 28 100(Class100(Classical)63(Eical)63(EI Tor)I Tor) 2929（ClassClassicalical）83(83(EI Tox) EI Tox) Levine Levine et al et al (1988a (1988a PERU-3 PERU-3 C6 C6 709(EL 709(EL Tor,InaTor,Inaba)ba) attRSI attRSI reca:htpreca:htpG-ctxB G-ctxB StrStrr r 轻轻微微 83 83 87 87 N.AN.Ae e Taylo
42、r Taylor er al er al (1994)(1994)PERU-PERU-14 14 C6 C6 709(EL 709(EL Tor,InaTor,Inaba) ba) attRSIattRSIrecA:hrecA:htpG-ctxB tpG-ctxB StrStrr r, ,丝状，丝状，缺乏制动缺乏制动性性 无无 100 100 80 80 N.A N.A Taykor Taykor et al et al (1994) (1994) 基因工程菌苗研究的现状与发展课件PERUPERU-15-15C6 C6 709(EL 709(EL Tor,InTor,Inaba)aba)att
43、RSIattRSIrecA:htpG-recA:htpG-ctxB StrctxB Strr r，无制，无制动性动性无无828260608080Kenner Kenner et et a(1995a(1995) )BENGBENGAL-AL-1515MO10(OMO10(O139)139)attRSIattRSIrecA:htpG-recA:htpG-ctxB StrctxB Strr r，无制，无制动性动性无无909083834242Coster Coster et al et al (1995)(1995)基因工程菌苗研究的现状与发展课件a a副反应包括由疫苗株引起的腹泻，腹部痉副反应包括
44、由疫苗株引起的腹泻，腹部痉挛，厌食，发热挛，厌食，发热b b服苗者粪便中排菌苗株的百分率服苗者粪便中排菌苗株的百分率c c用野生株攻击服苗者不发生腹泻的百分率用野生株攻击服苗者不发生腹泻的百分率d d攻击后在服苗者粪便培养中可查到野生型攻击后在服苗者粪便培养中可查到野生型霍乱弧菌的百分率霍乱弧菌的百分率e e未得到数据未得到数据f f未做未做 基因工程菌苗研究的现状与发展课件另外，发现霍乱毒素是很强的黏膜另外，发现霍乱毒素是很强的黏膜免疫原，能有效刺激黏膜免疫原，能有效刺激黏膜sIgAsIgA及血清及血清IgGIgG反应，及黏膜免疫记忆反应，对反应，及黏膜免疫记忆反应，对CTCT及及CTBCT
45、B的免疫佐剂活性进行了大量的免疫佐剂活性进行了大量的研究，对多种蛋白、多糖及病毒、的研究，对多种蛋白、多糖及病毒、细菌等的免疫佐剂效果得到肯定的认细菌等的免疫佐剂效果得到肯定的认识。进展情况见表识。进展情况见表6-66-6。基因工程菌苗研究的现状与发展课件表表6-6 CT/CT-B6-6 CT/CT-B佐剂应用的抗原佐剂应用的抗原 抗原（佐剂）抗原（佐剂）途径途径参考文献参考文献蛋白质蛋白质破伤风类毒素（破伤风类毒素（CTCT）p.op.o（Jackson et al,1993Jackson et al,1993） 链球菌链球菌M M蛋白（蛋白（CT-BCT-B）i.mi.m（Bessen a
46、nd Bessen and Tischetti,1988Tischetti,1988）链球菌链球菌（CT-BCT-B） S.Mutans S.Mutans抗原抗原I/III/II（CT/CT-BCT/CT-B） p.op.o（Czerkinsky et al,1989;Wu Czerkinsky et al,1989;Wu and Rusell,1993and Rusell,1993）S.MutansS.Mutans蛋白质抗原（蛋白质抗原（CT-BCT-B） 流感病毒溶血素（流感病毒溶血素（CT/CT-BCT/CT-B）i.mi.m(Takahashi et al.,1990)(Takahas
47、hi et al.,1990)呼吸道合胞病毒呼吸道合胞病毒FGFG糖蛋白（糖蛋白（CT/CT-CT/CT-B B） p.o,i.m p.o,i.m （Tomasi et al,1994Tomasi et al,1994） S.mutans Gtf.1 S.mutans Gtf.1：pho Apho A融合蛋白融合蛋白 i.mi.m（Walsh,1993Walsh,1993） 基因工程菌苗研究的现状与发展课件多糖多糖p.op.o(Tomasi et al,1994)(Tomasi et al,1994) 沙门氏菌多糖（沙门氏菌多糖（CT-BCT-B）p.op.o（Orr et al.,1994O
48、rr et al.,1994） P Paeruginosaaeruginosa多糖（多糖（CTCT）p.op.o（Abraham and Abraham and Pobinson,1991Pobinson,1991）病毒病毒 完整流感病毒（完整流感病毒（CTCT）p.op.o(Chen and Strober 1990)(Chen and Strober 1990) 仙台病毒（仙台病毒（CTCT）p.o,i.p.o,i.m m（Nedrud et al. 1987Nedrud et al. 1987） Neasles Neasles病毒（病毒（CT-BCT-B）i.ni.n(Muller et
49、 al,1995)(Muller et al,1995) 呼吸道合胞病毒（呼吸道合胞病毒（RSVRSV）i.ni.n(Reuman et al, 1991)(Reuman et al, 1991)细菌细菌/ /原生动物原生动物 幽门螺杆菌（幽门螺杆菌（CTCT）p.op.o(Czinn and Nedrud,1991)(Czinn and Nedrud,1991)弓形体（弓形体（CTCT） p.o p.o （Bourguin et al.,1991Bourguin et al.,1991） 阿米巴原虫多肽阿米巴原虫多肽-CT-B-CT-B融合蛋白融合蛋白 p.o p.o (Zhang et a
50、l,1995b) (Zhang et al,1995b) 基因工程菌苗研究的现状与发展课件二、痢疾菌苗（二、痢疾菌苗（Dysenteryvaccine）痢疾是我国常见和多发传染病，其发病率痢疾是我国常见和多发传染病，其发病率始终居始终居2424种法定传染病的前二位。种法定传染病的前二位。主要病原体为痢疾杆菌，其致病特点是定主要病原体为痢疾杆菌，其致病特点是定居侵入结肠黏膜上皮细胞，且能迅速溶解吞居侵入结肠黏膜上皮细胞，且能迅速溶解吞噬泡膜进入胞浆噬泡膜进入胞浆. .临床表现为发烧，脓血便，腹泻，里急后临床表现为发烧，脓血便，腹泻，里急后重，甚至引起神经症状和血尿综合症。重，甚至引起神经症状和血
51、尿综合症。基因工程菌苗研究的现状与发展课件痢痢疾疾菌菌共共有有4 4群群：A A志志贺贺氏氏痢痢疾疾菌菌（ShigellaShigella dysenteriaedysenteriae），B B福福氏氏痢痢疾疾菌菌（S.flexneriS.flexneri），C C鲍鲍氏氏痢痢疾疾菌菌（S.bordiiS.bordii）和和D D宋宋内内氏氏痢痢疾疾菌菌（S.sonneiS.sonnei）。）。按其菌膜表面按其菌膜表面LPS-OLPS-O抗原分为抗原分为4444个血清型。个血清型。目目前前已已知知至至少少2727个个基基因因和和1515个个蛋蛋白白与与痢痢疾疾菌菌入入侵侵宿宿主主细细胞胞相相关
52、关，它它们们作作为为IIIIII型型分分泌泌系系统统的的调调节节子子与与效效应应子子，以以接接触触依依赖赖方方式式被被分分泌泌进进入入宿主细胞。宿主细胞。基因工程菌苗研究的现状与发展课件1.1.死菌苗（死菌苗（Deadbacteriavaccine）五、六十年代大量动物及人体实验证明灭活的痢疾五、六十年代大量动物及人体实验证明灭活的痢疾全菌非口服途径，虽可诱导机体产生高的血清抗体，全菌非口服途径，虽可诱导机体产生高的血清抗体，但没有保护效果；但没有保护效果；用提取的宋氏痢疾菌的核糖体，皮下免疫途径，在用提取的宋氏痢疾菌的核糖体，皮下免疫途径，在豚鼠和猴中证实可提供特异保护，证明豚鼠和猴中证实可
53、提供特异保护，证明LPS-OLPS-O多糖是保多糖是保护性抗原；护性抗原；Robbins(1992)Robbins(1992)将痢疾菌将痢疾菌LPSLPS与不同蛋白载体（与不同蛋白载体（TTTT，DTDT）交联进行非口服途径免疫能诱导豚鼠产生高的血交联进行非口服途径免疫能诱导豚鼠产生高的血清抗体反应，豚鼠眼模型证明有一定保护作用。清抗体反应，豚鼠眼模型证明有一定保护作用。宋内氏宋内氏LPS-O-LPS-O-蛋白（蛋白（TTTT，DTDT）有保护作用，有保护作用，RobbinsRobbins（19961996）将多糖将多糖- -蛋白结合苗用于越南士兵，蛋白结合苗用于越南士兵，报告宋氏多糖报告宋氏
54、多糖- -蛋白结合苗保护效果达蛋白结合苗保护效果达70%70%。 基因工程菌苗研究的现状与发展课件2.2.活菌苗活菌苗（Livingbacteriavaccine）采取了多种方法进行痢疾菌野生毒株的减毒研究。采取了多种方法进行痢疾菌野生毒株的减毒研究。MeitertMeitert等（等（19841984）在胆盐平皿连续传代）在胆盐平皿连续传代3232次获得次获得S.f2aS.f2a减毒株减毒株IstratiT32IstratiT32；8080年代初中国近一万人现场观察，证实年代初中国近一万人现场观察，证实T32T32菌苗安菌苗安全，有保护活性，效果与免疫次数和剂量有关。全，有保护活性，效果与免
55、疫次数和剂量有关。 基因工程菌苗研究的现状与发展课件p8080年年代代中中国国国国内内以以T32T32为为受受体体株株开开始始致致力力于于构构建双价痢疾菌苗株的研究。建双价痢疾菌苗株的研究。n牟牟兆兆钦钦等等，19891989年年将将一一编编码码宋宋内内氏氏菌菌LPS-OLPS-O抗抗原原的的大大质质粒粒转转移移至至T32T32菌菌中中获获得得福福氏氏2a2a宋宋内内氏氏双双价价痢痢疾疾菌菌苗苗株株FS-18FS-18，FSM2117FSM2117；宋宋树树珍珍等等构构建建了了FSFS痢痢疾疾双双价价菌菌苗苗株株，其其中中FSM2117FSM2117识识别别福福氏氏2a2a和和识别宋内氏痢疾苗
56、识别宋内氏痢疾苗LPS-OLPS-O抗原；抗原；n林林 纪纪 胜胜 (1999)(1999)构构 建建 了了 S.flexenriS.flexenri 2a2a和和S.dysenteriaS.dysenteria I I双双价价痢痢疾疾菌菌株株，有有双双价价免免疫疫原原性性，现现FSM2117FSM2117与与FSFS两两株株痢痢疾疾双双价价菌菌苗苗均均已已获获国国家家新新生物制品证书和试生产文号。生物制品证书和试生产文号。 基因工程菌苗研究的现状与发展课件p9090年代国内外开展了痢疾侵袭活菌苗的研究。主年代国内外开展了痢疾侵袭活菌苗的研究。主要针对痢疾菌毒力相关基因的插入失活或缺失的方要针
57、对痢疾菌毒力相关基因的插入失活或缺失的方法，构建减毒突变株，目的是保存其入侵能力，限法，构建减毒突变株，目的是保存其入侵能力，限制其无限繁殖能力。对其免疫原性和保护效果进行制其无限繁殖能力。对其免疫原性和保护效果进行了大量实验室研究。了大量实验室研究。n国外工作主要集中在福氏国外工作主要集中在福氏2a2a，福氏福氏5 5型或型或Y Y型。构型。构建出福氏建出福氏2a-2a-宋内氏双价侵袭的菌苗株，目的是降低宋内氏双价侵袭的菌苗株，目的是降低目前非侵袭双价苗的免疫剂量，提高免疫原性。目前非侵袭双价苗的免疫剂量，提高免疫原性。 p 痢疾杆菌痢疾杆菌IIIIII型分泌系统将不同侵袭蛋白分泌和导型分泌
58、系统将不同侵袭蛋白分泌和导入宿主细胞的调节分子与效应分子的鉴定，可能会入宿主细胞的调节分子与效应分子的鉴定，可能会找到构建痢疾基因工程菌苗新的靶分子和靶基因。找到构建痢疾基因工程菌苗新的靶分子和靶基因。 基因工程菌苗研究的现状与发展课件苗株苗株 亲株亲株 表型表化表型表化（genegene） 安全性安全性 保护性保护性 Ic Ica a播散播散 ICICa a 生长生长 其它其它 g gp pc c m md d h he e gpgpm mh hEC104 EC104 E.coliS.flexneri2aE.coliS.flexneri2a (kcpA) (kcpA) (iuc(iucA)
59、A) + +- - - -EcSF2aEcSF2a-1 -1 E.coliS.flexneri2a E.coliS.flexneri2a (kcpA)(kcpA)(iuc(iucA)A)- - -SC560 SC560 S.flexneri5S.flexneri5(icsA) (icsA) + +_ _+ +SC445 SC445 S.flexneri5S.flexneri5(ics:T(ics:TnphoA) nphoA) (envZ,(envZ,ompR) ompR) + + +- -SC5700 SC5700 S.flexneri5S.flexneri5(ics:T(ics:TnphoA
60、)nphoA)(iuc:T(iuc:Tn10) n10) + + +Vc77 Vc77 E.coliS.flexneri2a E.coliS.flexneri2a (pur) (pur) (R(Rifif) ) + +- -Vc3359 Vc3359 S.sonnei S.sonnei (pur)(pur)(R(Rifif) )+ +- -TSF-21 TSF-21 S.flexneriYS.flexneriY (thyA) (thyA) (T(Ts) s) +210+2109 9cfucfu + +表表6-7 6-7 入侵性痢疾基因工程菌苗候选株研制情况入侵性痢疾基因工程菌苗候选株研制情况基
61、因工程菌苗研究的现状与发展课件苗株苗株 亲株亲株 表型表化（表型表化（genegene） 安全性安全性 保护性保护性 Ic Ica a播散播散 ICICa a 生长生长 其其它它 gpgpc c m md d h he e gpgpm mh hSFL124 SFL124 S.flexneriY S.flexneriY(aroD(aroD) ) + +SFL107SFL1070 0 S.flexneri2aS.flexneri2a(aroD(aroD) )2102108 8cfu cfu - -EcSf2aEcSf2a-2 -2 E.coliS.flexnerE.coliS.flexneri2a
62、i2a (kcpA)(kcpA)(aroD(aroD) )2102109 9cfu cfu + +CVD120CVD1203 3 S.flexneri2aS.flexneri2a(virG) (virG) (aroA(aroA) ) + + +FS5416FS5416b b S.sonnei S.sonnei S.flexneri2aS.flexneri2a(aroD(aroD) )+ + +FS5402FS5402b bS.sonnei S.sonnei S.flexneri2aS.flexneri2a(aroD(aroD) )+ + +FS5411FS5411b bS.sonnei S.s
63、onnei S.flexneri2aS.flexneri2a(aroD(aroD) )+ + +FS5414FS5414b b(aroD(aroD) )+ + +注：注：a胞内扩散；胞内扩散；b国内研制；国内研制；c,gp豚鼠；豚鼠；d,m猴；猴；e,h人人基因工程菌苗研究的现状与发展课件三、产毒性大肠杆菌苗三、产毒性大肠杆菌苗（ETECvaccine）ETECETEC是婴幼儿和旅游者腹泻的主要病原菌。是婴幼儿和旅游者腹泻的主要病原菌。全球年病例为全球年病例为2.12.1亿次，死亡病例达亿次，死亡病例达3838万，多为万，多为5 5岁以岁以下的儿童。下的儿童。其致病特征是分泌其致病特征是分泌S
64、TST和和LTLT毒素及菌膜表面存在致病相毒素及菌膜表面存在致病相关的菌毛抗原关的菌毛抗原CFAsCFAs。正在采用减毒痢疾菌为载体进行正在采用减毒痢疾菌为载体进行LTLT或菌毛抗原的表达，进行多价菌苗研制的前期工作，或或菌毛抗原的表达，进行多价菌苗研制的前期工作，或用重组的用重组的BCGBCG为载体进行为载体进行LT-BLT-B的表达研究。国内早年构的表达研究。国内早年构建表达建表达K88K88、K99K99及及LTLT的幼畜工程菌苗已投入生产。的幼畜工程菌苗已投入生产。基因工程菌苗研究的现状与发展课件四、四、肠出血性大肠杆菌苗（肠出血性大肠杆菌苗（EHEC苗）苗）大肠杆菌大肠杆菌O157O
65、157：H7H7是肠出血性大肠杆菌的主要病是肠出血性大肠杆菌的主要病原菌，首次鉴定于原菌，首次鉴定于19821982年。年。19961996年日本大规模爆发年日本大规模爆发EHEC O157EHEC O157出血性肠炎以来，引起国际上的极大关出血性肠炎以来，引起国际上的极大关注。注。致病特点通过特殊的黏附分子（致病特点通过特殊的黏附分子（intiminintimin）黏附靶黏附靶器官，产生类志贺毒素和肠溶血素（器官，产生类志贺毒素和肠溶血素（hlyhly）等，出等，出血性腹泻，溶血性尿毒综合症，血栓形成性血小板血性腹泻，溶血性尿毒综合症，血栓形成性血小板减少性紫癜。减少性紫癜。 基因工程菌苗研
66、究的现状与发展课件当当前前研研制制的的菌菌苗苗O157O157多多糖糖绿绿脓脓杆杆菌菌外外毒毒素素蛋蛋白白的的结结合合苗苗（O157LPS-rEPAO157LPS-rEPA），已已进进行行I I期期临临床床观观察察，认认为为安安全全，有有免免疫疫原原性性。重重组组的的StxStx的的减减毒毒活活菌菌苗苗，重重组组StxStx亚亚单单位位苗苗及及钴钴照照射射的的全全菌菌死死菌菌苗苗正正在在进行动物实验观察。进行动物实验观察。 基因工程菌苗研究的现状与发展课件五、伤寒杆菌（五、伤寒杆菌（Typhoidbacillusvaccine）伤寒杆菌能入侵肠黏膜上皮细胞，在吞噬细胞酸性吞噬伤寒杆菌能入侵肠黏
67、膜上皮细胞，在吞噬细胞酸性吞噬泡内存活，经淋巴系统进入血流引起菌血症，近而侵犯泡内存活，经淋巴系统进入血流引起菌血症，近而侵犯肝，脾，肾等多种脏器与器官，并大量繁殖而再次引起肝，脾，肾等多种脏器与器官，并大量繁殖而再次引起严重菌血症，临床表现为高热，胃肠炎，败血症等。严重菌血症，临床表现为高热，胃肠炎，败血症等。世界伤寒杆菌感染病例约世界伤寒杆菌感染病例约300300万，死亡人数万，死亡人数5050万。灭活万。灭活死菌苗已有死菌苗已有7070余年的历史，由于副反应较大的问题促进余年的历史，由于副反应较大的问题促进了活苗的研制。了活苗的研制。基因工程菌苗研究的现状与发展课件Ty21aTy21a
68、是是GermamierGermamier经经NTGNTG诱诱导导后后，筛筛选选得得到到伤伤寒寒Vigal Vigal E E减减毒毒株株。它它缺缺乏乏UDP-4-UDP-4-半半乳乳糖糖异异构构酶酶而而不不能能正正常常合合成成胞胞壁壁脂脂多多糖糖，在在体体内内外外有有半半乳乳糖糖供供给给情况下可正常合成细胞壁。情况下可正常合成细胞壁。伤伤寒寒ViVi多多糖糖苗苗 ViVi是是位位于于菌菌膜膜LPSLPS外外的的荚荚膜膜多多糖糖抗抗原原，由由O-O-乙乙酰酰- -氨氨基基糖糖醛醛酸酸高高度度聚聚合合而而成成，可可阻阻止止外外膜膜与与补补体体的的结结合合，对对菌菌的的入入侵侵也也有有一一定定作作用
69、用。目前正进行目前正进行ViVi多糖与蛋白交联的结合苗的研制。多糖与蛋白交联的结合苗的研制。另另外外，国国内内外外用用减减毒毒的的伤伤寒寒杆杆菌菌或或鼠鼠伤伤寒寒杆杆菌菌作作为载体表达外源抗原进行为载体表达外源抗原进行多价菌苗研究多价菌苗研究的探索的探索 。基因工程菌苗研究的现状与发展课件六六、结核菌苗（、结核菌苗（Tuberclevaccine）据据WHOWHO估计，全球每年增加结核病人达估计，全球每年增加结核病人达800800万，年死亡病例为万，年死亡病例为300300万。万。全球有全球有1/31/3的人（即的人（即1717亿）曾感染过结亿）曾感染过结核，其中核，其中90%-95%90%-
70、95%的人感染初期并无症状，的人感染初期并无症状，此时虽然机体的免疫反应控制了初始的感此时虽然机体的免疫反应控制了初始的感染，但并未完全排除病原体。染，但并未完全排除病原体。基因工程菌苗研究的现状与发展课件最最近近的的研研究究进进展展证证明明T T细细胞胞不不仅仅只只分分泌泌TH1TH1类类的的细细胞胞因因子子激激活活感感染染的的宿宿主主细细胞胞杀杀伤伤病病原原体体，而而且且通通过过CTLCTL溶溶解解感感染染靶靶细细胞胞和和胞胞内内病病原原体体，CD8CD8+ +T T细细胞在直接杀伤胞内结核杆菌有其特殊作用。胞在直接杀伤胞内结核杆菌有其特殊作用。结结核核杆杆菌菌是是专专性性需需氧氧胞胞内内
71、致致病病菌菌，由由于于血血清清各各种种检检测测方方法法交交叉叉反反应应严严重重，至至今今不不甚甚清清楚楚它它的的抗抗原决定簇的定位及数目，其毒力机制不清。原决定簇的定位及数目，其毒力机制不清。基因工程菌苗研究的现状与发展课件卡介苗（卡介苗（BCGBCG）是预防结核病的唯一活是预防结核病的唯一活菌苗菌苗，经大量资料的统计指出，经大量资料的统计指出BCGBCG的的效果效果波动很大（波动很大（0%-80%0%-80%）。以及在艾滋病人和。以及在艾滋病人和HIVHIV携带者接种携带者接种BCGBCG后发生全身性感染，促后发生全身性感染，促使人们研制新一代结核菌苗。使人们研制新一代结核菌苗。显然核酸免显
72、然核酸免疫是结核菌苗的重要研究方向。疫是结核菌苗的重要研究方向。 基因工程菌苗研究的现状与发展课件由由于于BCGBCG广广泛泛应应用用的的安安全全性性，它它可可长长期期在在体体内内存存活活，其其增增殖殖可可达达几几个个月月，生生长长缓缓慢慢可可诱诱发发强强的的，持持续续的的免免疫疫应应答答，具具有有佐佐剂剂活活性性，可可诱诱发发T TH H1 1型型免免疫疫反反应应，以以BCGBCG为为载载体体构构建建重重组组疫疫苗苗的的研研究日益受到注意。究日益受到注意。 基因工程菌苗研究的现状与发展课件七、七、嗜血流感杆菌苗（嗜血流感杆菌苗（Hib） 嗜血流感杆菌（嗜血流感杆菌（HibHib）为）为G G
73、- -有荚膜短小有荚膜短小杆菌，其荚膜多糖有特异型免疫原性，杆菌，其荚膜多糖有特异型免疫原性，其中其中b b型毒力最强，主要引起化脓性感染型毒力最强，主要引起化脓性感染如急性肺炎、脑膜炎、败血症等，常在如急性肺炎、脑膜炎、败血症等，常在流感、麻疹、百日咳、肺结核等之后合流感、麻疹、百日咳、肺结核等之后合并感染。并感染。 基因工程菌苗研究的现状与发展课件 磷磷酸酸聚聚核核糖糖基基核核糖糖醇醇（PRPPRP）是是HibHib多多糖糖菌菌苗苗的的有有效效成成分分，将将PRPPRP与与载载体体蛋蛋白白如如白白喉喉（DTDT）、破破伤伤风风类类毒毒素素（TTTT）脑脑膜膜炎炎球球菌菌外外膜膜蛋蛋白白（O
74、MPOMP）等等共共价价交交联联成成多多糖糖- -蛋蛋白白结结合合苗苗。证证明明HibHib- -蛋蛋白白结结合合苗苗对对婴婴幼幼儿儿使使用用安安全全，有有免免疫疫原原性性，可可诱诱导导免免疫疫记记忆忆，入入侵侵性性HibHib嗜嗜血血流流感感杆杆菌菌感感染染有有防防御御作用。作用。 基因工程菌苗研究的现状与发展课件由由于于Hib结结合合苗苗的的成成功功，WHO对对目目前前批批准准的的23个个血血清清型型肺肺炎炎球球菌菌多多糖糖与与蛋蛋白白交交联联的的结结合合苗苗，在在各各地地进进行行临临床床观观察察，其其中中美美国国已已完完成成III期期临临床床，认认为为高高度度有有效效，用用结结合合苗苗控
75、控制制肺肺炎炎球球菌菌病病很很可可能能会获更大成功。会获更大成功。基因工程菌苗研究的现状与发展课件八、八、细菌的细菌的DNA苗苗 DNADNA菌苗是用编码抗原基因的真核表菌苗是用编码抗原基因的真核表达质粒达质粒DNADNA直接于体内接种后，被细胞直接于体内接种后，被细胞摄取并转录翻译，表达相应的抗原，摄取并转录翻译，表达相应的抗原，通过不同途径诱导机体的特异免疫应通过不同途径诱导机体的特异免疫应答。进展情况列于表答。进展情况列于表6-86-8。基因工程菌苗研究的现状与发展课件表表6-8 6-8 细菌细菌DNADNA免疫研究情况免疫研究情况 病原体病原体DNA编码抗原编码抗原注入途径注入途径动物
76、模型动物模型Clostridiumletani（破伤（破伤风杆菌）风杆菌）毒素毒素C-片段片段肌注（肌注（i.m）小鼠，新生鼠小鼠，新生鼠Borreliaburgdorferi（伯（伯氏疏螺旋体）氏疏螺旋体）OspA肌注（肌注（i.m）小鼠小鼠Mycobacteriumtuberculosis（分枝结核杆菌）（分枝结核杆菌）P85,p36HSP65肌注（肌注（i.m）小鼠小鼠Salmonellatyphimurium（鼠伤寒沙门氏杆菌）（鼠伤寒沙门氏杆菌）OMP小鼠小鼠Mycoplasmapneumoniae（肺炎支原体）（肺炎支原体）A81,A7-1肌注（肌注（i.m）小鼠小鼠基因工程菌苗研
77、究的现状与发展课件在核酸免疫研究中，用减毒的胞内细菌释放在核酸免疫研究中，用减毒的胞内细菌释放DNADNA苗的报导引人注意。苗的报导引人注意。绝大多数的胞内菌都可被绝大多数的胞内菌都可被DNADNA转染，携带这转染，携带这些质粒进入细胞的吞噬泡或胞浆，释放些质粒进入细胞的吞噬泡或胞浆，释放DNADNA；表达编码抗原，诱导体液或细胞免疫。表达编码抗原，诱导体液或细胞免疫。与裸与裸DNADNA释放相比，用细菌释放释放相比，用细菌释放DNADNA的优点的优点 如下：如下： 基因工程菌苗研究的现状与发展课件1）用用肌肌肉肉注注射射或或基基因因枪枪注注入入DNA只只能能转转染染有有限限的的抗抗原原提提呈
78、呈细细胞胞（APCs）；而而通通过过适适当当的的细细菌菌释释放放DNA，能能将将质质粒粒DNA特特异异靶靶向向相相关关免免疫疫组组织织的的APCs，且且除除APCs外外，还还可可靶向树突状细胞（靶向树突状细胞（DCs），能更好地进行抗原提呈。），能更好地进行抗原提呈。2）细细菌菌的的成成份份，如如G-菌菌的的LPS和和G+菌菌的的脂脂肽肽酸酸及及细细菌菌DNA中中没没有有甲甲基基化化的的序序列列等等，都都有有佐佐剂剂活活性性，可可增增加加释释放放DNA的免疫原性。的免疫原性。3）细细菌菌载载体体还还能能进进行行口口服服，转转染染肠肠相相关关淋淋巴巴组组织织，促促进进粘粘膜膜免免疫疫效效果果。他
79、他们们可可停停留留在在吞吞噬噬泡泡中中，也也可可通通过过分分泌泌溶溶质质膜膜素素破破泡泡而而进进入入胞胞浆浆。控控制制抗抗原原提提呈呈的的途途径径及及相相应应的的T细细胞亚类的效应反应。胞亚类的效应反应。基因工程菌苗研究的现状与发展课件用胞内细菌释放用胞内细菌释放DNA系统也存在危险因素：系统也存在危险因素：1）入侵性虽然利于）入侵性虽然利于DNA释放，也存在毒力释放，也存在毒力回复的危险。回复的危险。2）G-菌的菌的LPS也有毒性问题。也有毒性问题。3）释放的）释放的DNA有整合到宿主细胞基因组的有整合到宿主细胞基因组的可能。可能。基因工程菌苗研究的现状与发展课件第四节第四节基因工程菌苗开发
80、战略的几点考虑基因工程菌苗开发战略的几点考虑（Developmentstrategyofgeneengineeringbacteriavaccine）1、创新菌苗的研制，开发和应用（、创新菌苗的研制，开发和应用（preparation，exploitationandapplicationofnewvaccine）近年对菌苗研制的主要贡献之一就是将荚膜多糖与蛋近年对菌苗研制的主要贡献之一就是将荚膜多糖与蛋白载体交联起来，研制多糖白载体交联起来，研制多糖-蛋白结合苗，使载体蛋白蛋白结合苗，使载体蛋白特异的特异的T细胞参与辅助细胞参与辅助B细胞，产生多糖特异的抗体。细胞，产生多糖特异的抗体。解决了长
81、期以来多糖菌苗对解决了长期以来多糖菌苗对2岁以下的婴幼儿无效和无岁以下的婴幼儿无效和无记忆反应的问题。记忆反应的问题。Hib嗜血流感杆菌嗜血流感杆菌-蛋白结合苗，成为蛋白结合苗，成为WHO的推荐项的推荐项目，并建议推广至其它荚膜多糖菌苗中去。目，并建议推广至其它荚膜多糖菌苗中去。基因工程菌苗研究的现状与发展课件2 2、对对病病原原体体致致病病与与发发病病机机制制的的认认识识及及宿宿主主抗抗感感染染免免疫机制的了解（疫机制的了解（understandingofpathogenynosogenesisandmechanismofdiseaseandimmunomechanism）3 3、粘粘膜膜疫
82、疫苗苗及及粘粘膜膜释释放放途途径径是是创创新新菌菌苗苗研研制制的的重重要要方方向向（mucousmembranevaccineandthereleasepathwayistheimportantdirectionofnewvaccineproduction）机机体体90%90%以以上上的的感感染染发发生生在在粘粘膜膜或或由由粘粘膜膜入入侵侵，正正在在研研制制的的大大多多数数疫疫苗苗实实际际上上是是粘粘膜膜疫疫苗苗。另另外外，粘粘膜免疫途径无可争议的优点是易于接受。膜免疫途径无可争议的优点是易于接受。 基因工程菌苗研究的现状与发展课件4、人类重要病原体基因组测序的完成，将为创新、人类重要病原体基因组测序的完成，将为创新菌苗的研制提供新的机会和条件（菌苗的研制提供新的机会和条件（supplythenewoccasionandcondition）5、创新菌苗的研制需要不同学科的协作，理论的、创新菌苗的研制需要不同学科的协作，理论的融合及各类生物技术包括动物模型的合理使用与融合及各类生物技术包括动物模型的合理使用与创建（创建（collaborationofdifferentsubjectandfusionoftheory）基因工程菌苗研究的现状与发展课件
