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1、实验四 细菌病原及其所致病害中国农业大学植物病理学系中国农业大学植物病理学系张力群张力群 教授教授Tel：62731464；Email：2012.10.16试验目的：n了解细菌病原及其所致病害特点；了解细菌病原及其所致病害特点；n学习病原细菌分离纯化技术；学习病原细菌分离纯化技术；n学习植物病原细菌的接种方法，了解植物病原细学习植物病原细菌的接种方法，了解植物病原细菌的侵入方式；菌的侵入方式；n证明细菌的致病性（柯赫氏法则）。证明细菌的致病性（柯赫氏法则）。 细菌在植物上引起的症状n坏死：坏死：叶枯和叶斑叶枯和叶斑（水渍状）（水渍状）n腐烂：腐烂：果蔬、块茎果蔬、块茎/根根的软腐的软腐n萎蔫：
2、萎蔫：全株性，青枯全株性，青枯 n畸形：畸形：肿瘤、发根，肿瘤、发根，丛枝丛枝 n变色：变色：黄化黄化- Xanthomonas, Pseudomonas - Erwinia, Pantoea- Ralstonia, Clavibacter, Pantoea- Agrobacterium, Phytoplasma, Spiroplasma - Phytoplasma, SpiroplasmaPseudomonas sp. 引起菜豆引起菜豆豆叶斑豆叶斑坏死 necrosisPseudomonas sp.在番茄上造成的在番茄上造成的叶斑和果斑叶斑和果斑Erwinia sp. 引起苹果火疫病引起苹果
3、火疫病Xanthomonas sp.引起青椒叶斑引起青椒叶斑腐烂腐烂 rotErwinia spp. 引引起多种作物软腐起多种作物软腐萎蔫萎蔫 wiltRalstonia spp. 引起引起多种作物萎蔫病多种作物萎蔫病维管束变色维管束变色畸形畸形 malformationPhytoplasma sp.引引起枣疯病（丛枝）起枣疯病（丛枝）Agrobacterium sp. 引起根癌引起根癌Phytoplasma sp.引起番茄黄化引起番茄黄化Phytoplasma sp. 引引起椰树死黄病起椰树死黄病变色变色 discolorationLiberibacter sp. 引起柑桔黄龙病引起柑桔黄龙
4、病Pseudomonas sp. 引引起大豆细菌性疫病起大豆细菌性疫病n菌溢（菌溢（bacterial ooze）：）： 发病（萎蔫）植物组织放发病（萎蔫）植物组织放入盛有水的试管或平皿中入盛有水的试管或平皿中排出云雾状扩散物；高湿排出云雾状扩散物；高湿条件下，发病植物组织泌条件下，发病植物组织泌出的脓状物。出的脓状物。细菌性病害的鉴定性病征：细菌性病害的鉴定性病征：n室内镜检n喷菌（菌溢）现象喷菌（菌溢）现象n细菌病害特有细菌病害特有n分离培养n选择性培养基选择性培养基 n致病性检测n过敏性坏死反应过敏性坏死反应具有病原性的细菌接种到植具有病原性的细菌接种到植物组织（烟草）后，接种位物组织（
5、烟草）后，接种位点附近组织迅速坏死。点附近组织迅速坏死。nKochs法则法则 实验内容n大白菜大白菜 软腐病菌的分离：系列稀释法；软腐病菌的分离：系列稀释法；n大白菜大白菜 软腐病菌的接种：伤口接种；软腐病菌的接种：伤口接种；实验材料和用具n植物病原细菌：胡萝卜软腐欧文氏菌（植物病原细菌：胡萝卜软腐欧文氏菌（ Erwinia carotovora ）n植物材料：大白菜植物材料：大白菜；n牛肉膏蛋白胨培养基；牛肉膏蛋白胨培养基；n70%乙醇溶液；乙醇溶液；n灭菌水、移液器、震荡器、接种针、镊子、剪灭菌水、移液器、震荡器、接种针、镊子、剪刀、玻棒、涂布器、灭菌塑料离心管、试管架、刀、玻棒、涂布器、
6、灭菌塑料离心管、试管架、保湿盒、记号笔、吸水纸、酒精灯、打火机等保湿盒、记号笔、吸水纸、酒精灯、打火机等n细菌分离纯化的方法：细菌分离纯化的方法：n平板划线法；平板划线法；n系列稀释法；系列稀释法；大白菜软腐病菌的分离n选取新鲜发病的大白菜叶片，健康叶片；选取新鲜发病的大白菜叶片，健康叶片；n对待分离部位进行表面消毒（对待分离部位进行表面消毒（70乙醇）；乙醇）；n用灭菌刀片切取用灭菌刀片切取0.50.5 cm病健交界处植物组病健交界处植物组织，置于灭菌离心管中；织，置于灭菌离心管中；n加入加入0.5mL灭菌水，用玻璃棒充分碾碎，震荡；灭菌水，用玻璃棒充分碾碎，震荡；n系列稀释系列稀释4次次；
7、n取第取第2，3，4次稀释液各次稀释液各50 L，均匀涂板；，均匀涂板；n菌液被培养基吸收后，反转放置，菌液被培养基吸收后，反转放置，28培养。培养。胡罗卜软腐欧文氏菌的接种n挑取培养好细菌置于灭菌试管中，加入少量灭菌生理挑取培养好细菌置于灭菌试管中，加入少量灭菌生理盐水；盐水；n将试管置于震荡器上震荡使细菌充分悬浮；将试管置于震荡器上震荡使细菌充分悬浮；n利用浊度计或分光光度计确定细菌悬液浓度（利用浊度计或分光光度计确定细菌悬液浓度（10106 6-10-108 8 cells/mLcells/mL）；）；n用无菌的接种针在大白菜叶片中部刺伤（扎孔用无菌的接种针在大白菜叶片中部刺伤（扎孔3-
8、53-5个）；个）；用移液器滴加细菌悬液用移液器滴加细菌悬液5-105-10微升；大白菜接种在刺伤微升；大白菜接种在刺伤处；处；等量灭菌水接种作为对照等量灭菌水接种作为对照。n接种后植物材料置于消毒容器中，接种后植物材料置于消毒容器中，25-28 C25-28 C下下保湿保湿培养培养24-48 h24-48 h观察并记录结果。观察并记录结果。作业：作业：n撰写实验报告撰写实验报告n详细记录病原细菌分离和接种方法；详细记录病原细菌分离和接种方法；n纯化所得单菌落数量、种类和菌落特征；纯化所得单菌落数量、种类和菌落特征；n计算所分离植物材料中的活菌数（计算所分离植物材料中的活菌数（CFU）；）； CFU：colony forming unitn记录接种试验各处理的白菜叶片上的病斑大小；记录接种试验各处理的白菜叶片上的病斑大小；n试验中出现问题的分析。试验中出现问题的分析。两天后观察记录试验的结果，下周实验课上交实验报告。The End
