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1、实验三消毒灭菌和药敏试验1沐风书苑实验内容和要求1.掌握药敏试验的原理、步骤、结果及 意义2.掌握常用的消毒与灭菌技术3.熟悉紫外线杀菌试验的原理4.了解细菌L型的诱导和菌落类型2沐风书苑一、药敏试验在感染性疾病防治中的意义 近年来，由于各种抗菌药物的广泛应用，导致耐药菌株的迅速增多。尤其是广广谱谱及超广谱抗生素超广谱抗生素的普遍使用，造成耐药菌株大量出现，给临床治疗带来极大的困难。同时，由于不合理的使用抗生素，治疗的失败率及不良反应均有增加。因此，药敏试验在感染性疾病的防治方面具有日益重要的实际意义。 3沐风书苑二.培养+药敏的目的 1、 确定导致感染的病原菌的种类，对于不同的病原菌（G-杆
2、菌或G+球菌，条件致病菌或急性传染病病原菌）需要采取不同的治疗措施。2、确定病原菌对各种抗生素的敏感性，指导临床根据病人情况合理用药。由于细菌耐药性的快速增长，单纯依赖经验选用药物经常无效，在更多的时候需要参考药敏实验的结果。 3、用于流行病学调查及院内感染的监控，减少耐药菌株的流行。 4沐风书苑三、什么情况下需要做培养+药敏？感染原因无法确定。病原菌的耐药性无法确定，经验用药可能失败（尤其是免疫力低下患者、长期使用抗生素者、ICU病房、院内感染患者、接受导管插入或其他创伤性治疗患者。）病人对可用药物过敏，需要检测其他药物的耐药性。病人个体情况要求对某些药物精确用药，需要测定其最低抑菌浓度（M
3、IC）。5沐风书苑四、常用抗菌药物敏感性试验与耐药检测方法介绍其原理： 体外测定抗生素药物抑菌或杀菌的能力。体外测定抗生素药物抑菌或杀菌的能力。可帮助临床对感染性疾病选择最佳用药，还可进行流行病学调查，了解某些致病菌耐药性变异情况。纸片扩散法纸片扩散法（Kirby-Bauer test） 稀释法稀释法（dilution test） E试验法（E test） 联合药物敏感试验 特殊耐药菌及耐药酶的表型检测耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）的检测-内酰胺酶、超广谱-内酰胺酶检测等6沐风书苑五、纸片扩散法（K-B法）原理：含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片所含的药物吸取琼脂中的水分溶
4、解后便不断向纸片周围区域扩散，形成递减的梯度浓度。在纸片周围抑菌浓度在纸片周围抑菌浓度范围内的细菌生长被抑制，形成透明的抑菌圈范围内的细菌生长被抑制，形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的最低抑制浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）呈负相关负相关，即抑菌圈愈大，MIC愈小。 7沐风书苑方法：菌液制备菌液制备：挑取孵育16-24h的血平板上数个菌落置于生理盐水管中，校正浓度至0.5麦氏标准；涂布接种涂布接种：无菌棉拭蘸取菌液，在试管壁旋转挤去多余菌液后在MH琼脂表面均匀
5、涂布接种3次，每次旋转平板60，最后沿平板内缘涂抹1周；贴含药纸片贴含药纸片：平板在室温下干燥3-5min，用无菌镊子将含药纸片紧贴于琼脂表面，各纸片中心相距应大于24mm，纸片距平板内缘应大于15mm；孵育孵育：35C 16-18h，量取抑菌圈直径。8沐风书苑注意事项注意事项1 纸片应分布均匀，中心距离不小于24mm。2 含菌平板必须避免过浓或过稀。3 纸片贴完后应在15min内将平板反过来，置于37度温箱中。4 纸片一旦接触培养基就不应再挪动位置。5 要注意无菌操作。9沐风书苑影响药敏结果的因素培养基培养基应根据试验菌的营养需要进行配制。倾注平板时，厚度合适（约5-6mm），不可太薄，一般
6、90mm直径的培养皿，倾注培养基18-20ml为宜。培养基内应尽量避免有抗菌药物的拮抗物质，如钙、镁离子能减低氨基糖苷类的抗菌活性，胸腺嘧啶核苷和对氨苯甲酸（PABA）能拮抗磺胺药和TMP的活性。细菌接种量细菌接种量细菌接种量应恒定，如太多，抑菌圈变小，能产酶的菌株更可破坏药物的抗菌活性。药物浓度药物浓度药物的浓度和总量直接影响抑菌试验的结果，需精确配制。商品药应严格按照其推荐治疗量配制。培养时间培养时间一般培养温度和时间为37，8-18小时，有些抗菌药扩散慢如多粘菌素，可将已放好抗菌药的平板培养基，先先置置4冰冰箱箱内内24小小时时，使抗菌药预扩散，然后再放37温箱中培养，可以推迟细菌的生长
7、，而得到较大的抑菌圈。10沐风书苑结果判读：用刻度尺量取抑菌圈直径，根据CLSI（Clinical and Laboratory Standards Institute）标准判读结果；报告：细菌对该抗生素是 敏感（susceptible，S）； 耐药（resistant，R）； 还是中介（intermediate，I）。11沐风书苑六、如何理解MIC值及药敏结果？ 每种药物均提供定性和定量两种结果。定性：敏感（敏感（S S）表示该药物对该细菌有抑制或杀灭作用。使用常规剂量可以达到有效的治疗效果。中介（中度敏感，中介（中度敏感，I I）表示细菌对该药物治疗的敏感性低于敏感菌株，必须加大剂量以达到
8、更高的血药浓度才能在特定的生理部位获得有效的临床效力；对于使用剂量有严格限制的药物则必须重复测试以确定敏感还是耐药。耐药（耐药（R R）表示药物常规剂量所达到的药物浓度不能抑制或杀死细菌，即使加大剂量也不能达到治疗效果或者超过了人体的正常耐受水平。定量：MICMIC（最低抑菌浓度）（最低抑菌浓度）表示在体外达到抑制细菌生长所需要的最低的药物浓度。临床治疗要求的血药浓度一般为临床治疗要求的血药浓度一般为MICMIC值值（g/mlg/ml） 的的4-84-8倍。倍。对于不同部位的不同药物，其浓度可能更高或更低。应具体情况具体分析，不可一概而论。 12沐风书苑长期使用抗生素的病人应该怎样做药敏试验？
9、 长期使用抗生素的病人尤其是住院病人应该经常做药敏试验。所谓的长期，并不是一个很长的时间概念，住院病人每隔3-4天就需要做一次细菌学检查。对于ICUICU病病房房的病人，可能每天都要做细菌学检查。因为这些病人多数免免疫疫力力较差，容易受条条件件致致病病菌菌的侵犯，而且反复发作。此外病原菌常呈多重耐药性，产超广谱-内酰胺酶的G-杆菌（ESBL）以及耐甲氧西林葡萄球菌（MRSA和MRSCN）、产AmpC酶的阴沟肠杆菌、铜绿假单胞菌在ICU病房最为常见。对于长期使用抗生素的病人，其感染有以下几个特点； 1.长期使用抗生素的病人，不同时期（即使在很短的时间内）感染的病原菌种类可能不同，耐药性因此也不相
10、同。 2、同一株细菌，在长时间用药时，仅需要3-4天就可以从对某种药物敏感发展为耐药。 3.长长期期使使用用抗抗生生素素容容易易诱诱发发细细菌菌产产生生L L型型变变异异。常规培养阴性时，进行L型细菌培养能够提高检出率。13沐风书苑形成条件：形成条件：生物学特性生物学特性：与医学关系：与医学关系：细胞壁中肽聚糖结构受理化或生物因素的直接破坏或合成抑制而形成。形态多形性 ；染色革兰阴性；培养高渗培养基；菌落油煎蛋样 仍有一定致病性细菌L型细胞壁缺陷细菌临床分离葡萄临床分离葡萄球菌球菌L L型型葡萄球菌葡萄球菌L L型型回复后回复后14沐风书苑灭菌杀灭或除去所有微生物的繁殖体和芽胞。消毒杀灭或除去
11、病原微生物。防腐抑制微生物的生长与繁殖。抑菌剂或防腐剂。除菌:用冲洗、过滤等机械手段除去微生物的方法化疗：用对病原菌有毒力但对机体无害的化学物质杀灭或抑制机体内病原微生物的方法消毒与灭菌技术基本概念15沐风书苑擦擦拭拭法法高高压压蒸蒸汽汽灭灭菌菌法法常用消毒灭菌的方法常用消毒灭菌的方法物理法物理法 化学法化学法浸浸泡泡法法熏熏蒸蒸法法喷喷雾雾法法热力消毒法热力消毒法生物生物净化法净化法辐射消毒法辐射消毒法燃燃烧烧法法烤烤箱箱法法煮煮沸沸法法干干热热法法湿湿热热法法日日光光曝曝晒晒法法紫紫外外线线灯灯照照射射法法电电子子灭灭菌菌灯灯法法电电离离辐辐射射法法16沐风书苑煮沸消毒法操作规程操作规程将
12、将物物品品刷刷洗洗干干净净，全全部部浸浸没没在在水水中中，或或在在水水中中加加入入碳碳酸酸氢氢钠钠配配成成1一一2的的浓浓度度，可可将将沸沸点点提高到提高到105还可去污防锈。还可去污防锈。加热煮沸。加热煮沸。水水沸沸后后开开始始计计时时510 min，如如中中途途加加入入物物品品，则在第二次水沸后重新计时。则在第二次水沸后重新计时。关闭热源，用无菌持物钳取出消毒物品。关闭热源，用无菌持物钳取出消毒物品。 17沐风书苑焚烧焚烧-最彻底的灭菌方法最彻底的灭菌方法烧灼烧灼-直接用火焰灭菌方法直接用火焰灭菌方法 如接种环、试管口、三角瓶口如接种环、试管口、三角瓶口干烤干烤-加热加热160-1160-
13、170 2h70 2h 玻璃器皿、陶瓷玻璃器皿、陶瓷1 1、干热灭菌法、干热灭菌法红外线红外线-热效应，与干烤类似热效应，与干烤类似灭菌效果：可杀死营养体和芽胞灭菌效果：可杀死营养体和芽胞18沐风书苑2.2.湿热灭菌法湿热灭菌法高压蒸汽灭菌法（高压蒸汽灭菌法（热压灭菌法）热压灭菌法）最有效的湿热灭菌法最有效的湿热灭菌法 121 121 15-20mim15-20mim（杀芽胞（杀芽胞) )煮沸消毒法煮沸消毒法水煮水煮100 5100 5mim(mim(杀繁殖体杀繁殖体)-2)-2h h( (杀芽胞杀芽胞) )流通蒸汽消毒法流通蒸汽消毒法巴氏消毒法巴氏消毒法间歇蒸汽灭菌法间歇蒸汽灭菌法水蒸汽水蒸
14、汽100 15-30100 15-30mimmim( (杀繁殖体杀繁殖体) )反复多次流动蒸汽间歇加热灭菌反复多次流动蒸汽间歇加热灭菌( (杀芽胞）杀芽胞）较低的温度较低的温度 61 3061 30mim/71 30smim/71 30s（杀致病菌）（杀致病菌）效果比干效果比干热好热好19沐风书苑压力蒸汽灭菌的效果监测物理监测法物理监测法用用150或或200的的留点温度计留点温度计。使用前将温度计汞柱甩。使用前将温度计汞柱甩至至50以下，放入包裹内，灭菌后检查其读数是否达到灭菌温度以下，放入包裹内，灭菌后检查其读数是否达到灭菌温度化学监测法化学监测法主要是通过主要是通过化学指示剂化学指示剂的化
15、学反应，灭菌后呈现的颜色变化的化学反应，灭菌后呈现的颜色变化来辨别是否达到灭菌的要求。临床常用的来辨别是否达到灭菌的要求。临床常用的化学指示卡与化学指示胶带化学指示卡与化学指示胶带，化学指示卡放在包的中央，化学指示胶带粘贴在包的外面。化学指示卡放在包的中央，化学指示胶带粘贴在包的外面。生物监测法生物监测法是最可靠的监测法，利用对热耐受力较强的非致病性是最可靠的监测法，利用对热耐受力较强的非致病性嗜热嗜热脂肪杆菌芽孢脂肪杆菌芽孢作为指示剂，制成每片含作为指示剂，制成每片含106个嗜热脂肪杆菌芽孢的菌纸个嗜热脂肪杆菌芽孢的菌纸片片,使用时将使用时将10片菌纸片分别放于灭菌器四角及中央，待灭菌完毕，
16、用无片菌纸片分别放于灭菌器四角及中央，待灭菌完毕，用无菌镊取出后再放人培养基内，在菌镊取出后再放人培养基内，在56温箱中培养温箱中培养48h至至1周，若全部菌周，若全部菌纸片无细菌生长则表示灭菌合格。纸片无细菌生长则表示灭菌合格。20沐风书苑消毒与灭菌技术 辐射灭菌法 非电离辐射：紫外线最佳杀菌波长为250270nm杀菌机理：干扰DNA的复制与转录 特点：紫外线穿透力较弱适应范围：紫外线消毒适用于适应范围：紫外线消毒适用于空气消毒与物品表面的消毒。空气消毒与物品表面的消毒。21沐风书苑消毒与灭菌技术滤过除菌法杀菌机理：含有微细小孔0.22m,只允许液体或气体及孔径0.22m的颗粒通过，细菌不能
17、滤过。不能除病毒、支原体适用范围：血清、毒素、输液、生物制品、抗生素以及空气等的除菌。22沐风书苑促进菌体蛋白质变性凝固（酚、醇、醛、酸碱类等）干扰细菌酶系统和代谢（氧化剂、重金属盐类等）损伤细菌细胞膜，增加其通透性（表面活性剂、脂溶剂等）菌体成分氧化、水解或结构改变（氧化剂、卤素、醛、酚等）消毒与灭菌技术消毒与灭菌技术 化学消毒剂作用机制化学消毒剂作用机制23沐风书苑消毒剂类别消毒剂类别名称名称浓度浓度(%)用途用途重金属盐重金属盐红汞红汞2皮肤、粘膜、小创面消毒皮肤、粘膜、小创面消毒硫柳汞硫柳汞0.01生物制品防腐生物制品防腐氧化剂氧化剂高锰酸钾高锰酸钾0.1皮肤、尿道、水果、蔬菜消毒皮肤
18、、尿道、水果、蔬菜消毒过氧化氢过氧化氢3皮肤、粘膜、创伤消毒皮肤、粘膜、创伤消毒过氧乙酸过氧乙酸0.20.5塑料、玻璃、人造纤维消毒塑料、玻璃、人造纤维消毒卤素类卤素类碘液碘液2.5皮肤消毒皮肤消毒醇类醇类乙醇乙醇7075皮肤、体温计消毒皮肤、体温计消毒酚类酚类石炭酸石炭酸35地面、器皿表面和排泄物消毒地面、器皿表面和排泄物消毒来苏来苏35同上、也常用于手及皮肤消毒同上、也常用于手及皮肤消毒表面活性剂表面活性剂新洁尔灭新洁尔灭0.1手术器械消毒手术器械消毒酸碱类酸碱类生石灰生石灰1:41:8排泄物、地面消毒排泄物、地面消毒染料染料龙胆紫龙胆紫24表浅创伤消毒表浅创伤消毒24沐风书苑化学消毒剂的
19、使用方法化学消毒剂的使用方法浸泡法浸泡法 侵泡法是将物品洗净、擦干后，浸没在消侵泡法是将物品洗净、擦干后，浸没在消毒液中进行消毒灭菌的方法。毒液中进行消毒灭菌的方法。擦拭法擦拭法 擦拭法是用消毒剂直接擦拭人体或物品表擦拭法是用消毒剂直接擦拭人体或物品表面，如皮肤、桌椅等，达到消毒灭菌的方法。面，如皮肤、桌椅等，达到消毒灭菌的方法。喷雾法喷雾法 喷雾法是利用喷雾器将消毒剂变成微粒气喷雾法是利用喷雾器将消毒剂变成微粒气雾弥散在空气中对空气和物品表面进行消毒灭雾弥散在空气中对空气和物品表面进行消毒灭菌的方法。菌的方法。熏蒸法熏蒸法 熏蒸法是将消毒剂加热或加人氧化剂，使熏蒸法是将消毒剂加热或加人氧化剂
20、，使其产生气体来进行消毒灭菌的方法。其产生气体来进行消毒灭菌的方法。25沐风书苑化学消毒剂的使用方法化学消毒剂的使用方法26沐风书苑 问题与讨论问题与讨论1.1.常见的消毒灭菌技术有哪些？分常见的消毒灭菌技术有哪些？分别有什么用途？灭菌的标准是什别有什么用途？灭菌的标准是什么？么？2.2.紫外线杀菌作用的原理如何？有紫外线杀菌作用的原理如何？有什么特点？什么特点？3.3.什么是细菌什么是细菌L L型？细菌型？细菌L L型的形态型的形态染色有什么特点？分离培养细菌染色有什么特点？分离培养细菌L L型的培养基有什么特点？型的培养基有什么特点？27沐风书苑本次实验课结束本次实验课结束明天看试验结果，值日同学留下明天看试验结果，值日同学留下实验四实验四 化脓性球菌和化脓性球菌和肠道杆菌的病原学检测（肠道杆菌的病原学检测（1）再见！再见！28沐风书苑
