《高考生物总复习 第六章第2节 DNA片段的扩增 PCR技术课件 中图版选修1》由会员分享，可在线阅读，更多相关《高考生物总复习 第六章第2节 DNA片段的扩增 PCR技术课件 中图版选修1（36页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、第第2节节DNA片段的扩增片段的扩增PCR技术技术学习导航学习导航1.理解理解PCR扩增扩增DNA片段的原理。片段的原理。重点重点2.尝试尝试PCR技术的基本操作和应用。技术的基本操作和应用。 难点难点新知初探思维启动新知初探思维启动一、一、DNA在细胞内的复制在细胞内的复制1.所所需需的的酶酶：_酶酶、DNA聚聚合合酶酶和和RNA聚合酶等。聚合酶等。2.引物：引物：_。3.原料：原料：_。4.原则：原则：_。DNA解旋解旋一段一段RNA四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸碱基互补配对原则碱基互补配对原则二、二、PCR及其过程及其过程1.概念：概念：PCR即聚合酶链式反应，实际上是即聚合酶链式反应，实
2、际上是在在_模拟细胞内的模拟细胞内的_，形，形成大量成大量_的的DNA片段。片段。体外体外DNA复制过程复制过程特异性特异性2.过程过程条件条件过程过程加样加样 室温室温把把PCR缓冲液缓冲液、_、一对引物、四种脱氧核苷酸、一对引物、四种脱氧核苷酸、DNA聚合酶、聚合酶、Mg2等成分加等成分加入到微量离心管中入到微量离心管中DNA模板模板氢键氢键一对引物一对引物DNA聚合聚合脱氧核苷酸脱氧核苷酸判一判判一判(1)细细胞胞内内DNA复复制制和和PCR技技术术所所需需的的引引物物一一样，都是样，都是RNA。()(2)经经PCR技技术术合合成成的的DNA分分子子中中，每每条条单单链链都含有引物。都含
3、有引物。()(3)PCR实实验验的的原原理理和和操操作作都都十十分分复复杂杂，不不易易于操作。于操作。()(4)经过高温变性、低温复性和中温延伸三步经过高温变性、低温复性和中温延伸三步操作，操作，DNA片段可呈指数增长。片段可呈指数增长。()三、实验操作三、实验操作1.准备准备(1)为为了了避避免免_等等因因素素的的污污染染，PCR实实验验中中使使用用的的微微量量离离心心管管、吸吸头头、缓缓冲冲液液以以及蒸馏水等在使用前必须进行及蒸馏水等在使用前必须进行_。(2)如果没有如果没有PCR仪，可以设置仪，可以设置3个恒温水浴个恒温水浴锅，温度分别为锅，温度分别为_、_和和_，然后按要求在然后按要求
4、在3个水浴锅中来回转移个水浴锅中来回转移PCR的的微量离心管即可。微量离心管即可。外源外源DNA高压灭菌高压灭菌95 55 72 PCR热循环热循环260 nm想一想想一想决定决定PCR反应特异性的原因有哪些？反应特异性的原因有哪些？【提示提示】待扩增待扩增DNA片段的特异性。片段的特异性。要点突破讲练互动要点突破讲练互动要点一要点一PCR技术与体内技术与体内DNA复制的比较复制的比较细胞内复制细胞内复制PCR反应反应解旋解旋在解旋酶作用在解旋酶作用下下,细细胞提供能量，胞提供能量，部分解开部分解开加热至加热至90 以以上时，双链全上时，双链全部解开部解开酶酶DNA解旋酶、解旋酶、DNA聚合酶
5、聚合酶耐高温的耐高温的DNA聚合酶聚合酶引物引物一小段一小段RNA单链单链DNA细胞内复制细胞内复制PCR反应反应能量能量ATP不加不加循环次数循环次数生物自身控制生物自身控制30多次多次子链合成子链合成一条链连续合一条链连续合成成,另另一条链不连续一条链不连续合成合成两条子链为连续两条子链为连续合合成成,温温度为度为72 产物产物完整完整DNADNA片段片段相同点相同点需提供需提供DNA复制的模板复制的模板四种脱氧核苷酸为原料四种脱氧核苷酸为原料碱基互补配对原则碱基互补配对原则子链延伸的方向都是从子链延伸的方向都是从5端到端到3端端特特别别提提醒醒PCR反反应应需需要要可可变变的的温温度度，
6、而而体体内内DNA复制需要稳定的温度。复制需要稳定的温度。DNA解旋酶的作用是使解旋酶的作用是使DNA两条链的氢键两条链的氢键断开；断开；DNA聚合酶的作用是将单个脱氧核苷聚合酶的作用是将单个脱氧核苷酸加到已有的单链片段的酸加到已有的单链片段的3端上，需要模板端上，需要模板; DNA连接酶连接的是两条连接酶连接的是两条DNA片段的缺口，片段的缺口，不需要模板。不需要模板。 PCR过过程程与与细细胞胞内内的的DNA复复制制过过程程相相比，主要有两点不同，它们是比，主要有两点不同，它们是()PCR过过程程需需要要的的引引物物是是人人工工合合成成的的单单链链DNAPCR过程不需要过程不需要DNA聚合
7、酶聚合酶PCR过过程程中中DNA的的解解旋旋不不依依靠靠解解旋旋酶酶，而而是通过对反应温度的控制来实现的是通过对反应温度的控制来实现的PCR过程中，过程中，DNA不需要解旋，直接以双不需要解旋，直接以双链链DNA为模板进行复制为模板进行复制例例1A BC D【解解析析】PCR过过程程与与细细胞胞内内的的DNA复复制制过过程程相相比比较较，主主要要有有两两点点不不同同：PCR过过程程需需要要的的引引物物是是人人工工合合成成的的单单链链DNA，长长度度通通常常为为1540个个核核苷苷酸酸。PCR过过程程中中，DNA解解旋旋不不依依赖赖解解旋旋酶酶，而而是是通通过过对对反反应应温温度度的的控控制制来
8、实现的。来实现的。【答案答案】C变式训练变式训练(2012成成都都七七中中高高二二检检测测)下下列列关关于于DNA复复制制和和PCR的描述中，正确的是的描述中，正确的是()ADNA聚聚合合酶酶不不能能从从头头开开始始合合成成DNA，只只能从能从5端延伸端延伸DNA链链BDNA复制不需要引物复制不需要引物C引引物物与与DNA母母链链通通过过碱碱基基互互补补配配对对进进行行结合结合DPCR扩增的对象是氨基酸序列扩增的对象是氨基酸序列解析：选解析：选C。由于。由于DNA聚合酶不能从头开始聚合酶不能从头开始合成合成DNA，只能从，只能从3端延伸端延伸DNA链，故链，故DNA复制需要引物，而且它与复制需
9、要引物，而且它与DNA母链通过碱基母链通过碱基互补配对结合。互补配对结合。PCR扩增的对象是扩增的对象是DNA，而，而不是氨基酸。不是氨基酸。2.PCR扩增过程扩增过程变性变性复性复性延伸延伸预变性预变性95 ，5 min55 ，1 min72 ，1 min重复重复30次次95 ，30 s55 ，30 s72 ，1 min最后一最后一次循环次循环72 ，1 min图示：图示：3.DNA扩增数目的理论计算扩增数目的理论计算理论上理论上DNA扩增呈指数增长。若只有一条扩增呈指数增长。若只有一条DNA模板，则复制模板，则复制n次后有次后有2n条；若一开始有条；若一开始有m条条DNA模板，则复制模板，
10、则复制n次后有次后有m2n条；实条；实际操作过程中，由于无关变量的影响，一般际操作过程中，由于无关变量的影响，一般来说实验值要略小于理论值。来说实验值要略小于理论值。 近近20年来，年来，PCR技术技术(多聚酶链式多聚酶链式反应反应)成为分子生物学实验室的一种常规实验成为分子生物学实验室的一种常规实验手段，其原理是利用手段，其原理是利用DNA半保留复制，在试半保留复制，在试管中进行管中进行DNA的人工复制的人工复制(如图如图)，在短时间，在短时间内内,将将DNA扩增几百万倍甚至几十亿倍，从而扩增几百万倍甚至几十亿倍，从而使实验室所需要的遗传物质不再受限于活的使实验室所需要的遗传物质不再受限于活
11、的生物体。生物体。例例2(1)加热使加热使DNA双链间的双链间的_键完全打键完全打开，称为开，称为_；而在细胞中是在；而在细胞中是在_酶的作用下进行的。酶的作用下进行的。(2)如果只需要大量克隆模板如果只需要大量克隆模板DNA中间的某个中间的某个特定区段，应该加入特定区段，应该加入_种特定的引种特定的引物。当温度降低至物。当温度降低至55 C时，引物与两条时，引物与两条“舒展舒展”的模板的特定位置结合，在的模板的特定位置结合，在DNA聚合聚合酶的作用下，只能在引物的酶的作用下，只能在引物的_端连接端连接脱氧核苷酸，两条子链的延伸方向都是脱氧核苷酸，两条子链的延伸方向都是_。(3)PCR技技术术
12、的的必必需需条条件件，除除了了模模板板、原原料料、酶酶之之外外，至至少少还还有有三三个个条条件件，即即液液体体环环境境、适适 宜宜 的的 _和和 _， 前前 者者 由由_自自动动调调控控，后后者者则则靠靠_来维持。来维持。(4)通过通过PCR技术使技术使DNA分子大量复制，如果分子大量复制，如果将一个用将一个用15N标记的标记的DNA分子放入试管中，以分子放入试管中，以14N标记的脱氧核苷酸为原料，连续复制四次标记的脱氧核苷酸为原料，连续复制四次之后，则之后，则15N标记的标记的DNA分子占全部分子占全部DNA分分子总数的比例是子总数的比例是_。【解析解析】(1)PCR技术利用热变性原理使技术
13、利用热变性原理使DNA双链之间的氢键断裂，称为变性，而在双链之间的氢键断裂，称为变性，而在细胞内是在解旋酶的作用下使氢键断裂。细胞内是在解旋酶的作用下使氢键断裂。(2)PCR分为三个基本反应步骤分为三个基本反应步骤:变性变性(95 )、复性、复性(55 )、延伸、延伸(72 )，其特异性依赖，其特异性依赖于与靶序列互补的引物，引物是两段与待扩于与靶序列互补的引物，引物是两段与待扩增增DNA序列互补的片段，两引物之间的距离序列互补的片段，两引物之间的距离决定扩增片段的长度。决定扩增片段的长度。由于由于DNA聚合酶不能从头开始合成聚合酶不能从头开始合成DNA，只，只能从引物的能从引物的3端延伸端延
14、伸DNA链，则链，则DNA的合成的合成方向总是从子链的方向总是从子链的5端向端向3端延伸。端延伸。(3)PCR技术与细胞内的技术与细胞内的DNA复制不完全相同，除了复制不完全相同，除了需要模板、原料、酶以外，至少还需要液体需要模板、原料、酶以外，至少还需要液体环境环境(稳定的缓冲液稳定的缓冲液)，每一个步骤需要适宜的，每一个步骤需要适宜的温度和酸碱度等。温度和酸碱度等。(4)一个一个DNA分子连续复制分子连续复制四次之后，形成四次之后，形成16个个DNA分子，分子，15N标记的标记的DNA分子有分子有2个，则个，则15N标记的标记的DNA分子占全分子占全部部DNA分子总数的比例为分子总数的比例
15、为1/8。【答案答案】(1)氢氢变性变性解旋解旋(2)两两3从子链的从子链的5端向端向3端延伸端延伸(3)温度温度酸碱度酸碱度PCR仪仪缓冲液缓冲液(4)1/8互动探究互动探究(1)PCR中由碱基错配而引起哪种变异？中由碱基错配而引起哪种变异？(2)假假设设对对一一个个DNA进进行行扩扩增增，第第一一次次循循环环时时某某一一条条模模板板链链上上发发生生碱碱基基错错配配，则则扩扩增增若若干干次次后后检检测测所所用用DNA的的扩扩增增片片段段，与与原原DNA相相应片段相同的占多少？应片段相同的占多少？【提示提示】(1)基因突变。基因突变。(2)50%。【误区警示误区警示】关于关于DNA的扩增方向容
16、易发的扩增方向容易发生混淆，为了明确表示生混淆，为了明确表示DNA的方向，通常将的方向，通常将DNA的羟基的羟基(OH)末端称为末端称为3端，磷酸基团端，磷酸基团的末端称为的末端称为5端，子链从引物端，子链从引物3端开始延伸，端开始延伸，而子链的合成方向是从而子链的合成方向是从5端向端向3端延伸。端延伸。要点三要点三实验操作与结果分析实验操作与结果分析1.检测检测PCR扩增效果的过程扩增效果的过程2.结果分析结果分析DNA片段的扩增是否成功的判断片段的扩增是否成功的判断(1)对对于于电电泳泳检检测测的的方方法法，可可以以通通过过在在紫紫外外线线下下直直接接观观察察DNA带带的的分分布布及及粗粗
17、细细程程度度来来评评价价扩增的效果。扩增的效果。(2)扩增不成功的可能原因有：扩增不成功的可能原因有：漏加了漏加了PCR的反应成分；的反应成分；各反应成分的用量不当；各反应成分的用量不当；PCR程序设置不当等。程序设置不当等。 在在PCR扩扩增增DNA的的实实验验中中，预预计计一一分分子子DNA经经过过30次次循循环环后后，应应该该得得到到230个个DNA分分子子，但但是是结结果果只只有有约约210个个DNA分分子子，那么不是出现该现象的原因是那么不是出现该现象的原因是()ATaq DNA聚聚合合酶酶的的活活力力不不够够，或或活活性性受受到抑制到抑制B系统设计欠妥系统设计欠妥C循环次数不够循环
18、次数不够D复性时，部分亲链与亲链结合复性时，部分亲链与亲链结合例例3【解解析析】如如果果Taq DNA聚聚合合酶酶活活力力不不够够，或或活活性性受受到到抑抑制制，则则导导致致催催化化效效率率降降低低，得得到到的的产产物物比比预预期期的的少少。如如果果PCR系系统统设设置置不不妥妥，达达不不到到预预期期的的结结果果。复复性性时时，模模板板链链既既可可以以和和引引物物结结合合，互互补补的的模模板板链链也也可可相相互互结结合，从而导致产物减少。合，从而导致产物减少。【答案答案】C变式训练变式训练DNA在在_nm的的紫紫外外线线波波段段存存在在一一强强烈烈的的吸收峰，其峰值的大小与吸收峰，其峰值的大小与DNA含量有关含量有关()A220 B240C260 D280解析：选解析：选C。DNA在在260 nm的紫外线波段存的紫外线波段存在一强烈的吸收峰，其峰值的大小与在一强烈的吸收峰，其峰值的大小与DNA含含量有关。据此，可以进行量有关。据此，可以进行DNA含量的测定。含量的测定。
