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1、第四章第四章 反向遗传学及其相关技术反向遗传学及其相关技术1优质课件一、概述一、概述(一)遗传研究的二条途径(一)遗传研究的二条途径1、表、表里:里:正向遗传学研究正向遗传学研究杂交或诱变杂交或诱变表型观察表型观察遗传规律遗传规律确定存在确定存在的基因及数目的基因及数目基因的功能及作用性质。基因的功能及作用性质。这一途径是从生物体的性状、表型变化来研究这一途径是从生物体的性状、表型变化来研究遗传物质的组成、分布与传递规律,属于正向遗传物质的组成、分布与传递规律,属于正向遗传学采用的研究方法。遗传学采用的研究方法。2优质课件2、里里表:表:反向遗传学研究反向遗传学研究在在已已知知DNA序序列列的
2、的基基础础上上,通通过过DNA重重组组、定定点点突突变变、插插入入/缺缺失失等等遗遗传传修修饰饰手手段段创创造造突突变变体体并并研研究究突突变变所所造造成成的的表表型型效效应应,从从而而研研究究基基因因的的生生物物学学功功能能,阐阐明明生生命命的的本本质质现现象象与与规规律。律。与反向遗传学相关的遗传操作技术为反向遗传与反向遗传学相关的遗传操作技术为反向遗传学技术。学技术。3优质课件(二)(二)RNA病毒的反向遗传学病毒的反向遗传学 n采采用用病病毒毒的的遗遗传传材材料料,在在培培养养细细胞胞或或易易感感宿宿主主中中重重新拯救出活病毒或类似病毒物质。新拯救出活病毒或类似病毒物质。 n能能够够拯
3、拯救救病病毒毒的的遗遗传传材材料料称称为为感感染染性性克克隆隆,一一般般是是在在细细菌菌质质粒粒中中含含有有整整个个病病毒毒基基因因组组的的cDNA拷拷贝贝,使使得得cDNA本本身身或或从从cDNA体体外外转转录录所所得得的的RNA具具有感染性。有感染性。 nRNA病病毒毒的的反反向向遗遗传传系系统统通通过过定定向向修修饰饰病病毒毒的的基基因因组组序序列列,检检测测被被拯拯救救的的人人工工改改造造病病毒毒的的表表型型,可可以以在在体体内内(in vivo)有有效效地地研研究究病病毒毒基基因因结结构构、功功能能和和病毒病毒-宿主相互作用。宿主相互作用。 4优质课件nRNA病毒的反向遗传操作病毒的
4、反向遗传操作 RT-PCR构建构建RNA病毒的全长病毒的全长cDNA,并进行遗传修饰,并进行遗传修饰 与与RNA聚合酶启动子结合聚合酶启动子结合 体外转录病毒体外转录病毒RNA 转录物转录物RNA感染哺乳动物细胞感染哺乳动物细胞 拯救到活病毒拯救到活病毒 拯救病毒的表型变化拯救病毒的表型变化 病毒基因组的表达、调控、致病机理、病毒基因组的表达、调控、致病机理、 病毒与宿主细胞互作、疫苗制造等病毒与宿主细胞互作、疫苗制造等5优质课件单正股单正股RNA病毒:病毒:RNA聚合酶聚合酶+mRNA + +中间型中间型 结构蛋白结构蛋白+子代正股子代正股RNA单负股单负股RNA病毒:病毒:RNA聚合酶聚合
5、酶 +结构蛋白结构蛋白子代负股子代负股RNA逆转录病毒逆转录病毒:RNARNA/DNA中间体中间体逆转录酶逆转录酶DNA/DNA宿主宿主子代子代RNA正股正股RNA与负股与负股RNA病毒、逆转录病毒病毒、逆转录病毒?6优质课件(三)真核生物的反向遗传学(三)真核生物的反向遗传学采采用用反反向向遗遗传传学学鉴鉴定定基基因因功功能能是是真真核核生生物物功功能基因组学的主要内容。能基因组学的主要内容。研研究究手手段段包包括括基基因因的的互互补补实实验验、超超表表达达、反反义义抑抑制制、基基因因敲敲除除/基基因因打打靶靶、基基因因陷陷阱阱、基基因激活等手段。因激活等手段。利利用用基基因因敲敲除除或或基
6、基因因沉沉默默而而产产生生的的功功能能变变化化研究基因功能是主要的反向遗传学技术。研究基因功能是主要的反向遗传学技术。7优质课件二、反向遗传学相关技术二、反向遗传学相关技术1、基因的同源重组、基因的同源重组2、基因的位点突变、基因的位点突变3、基因沉默、基因沉默基因敲除基因敲除8优质课件利用利用DNA转化技术,将含有目的基因和靶基因转化技术,将含有目的基因和靶基因同源片段的重组载体导入靶细胞,通过载体与同源片段的重组载体导入靶细胞,通过载体与靶细胞染色体上同源序列间的重组,将外源基靶细胞染色体上同源序列间的重组,将外源基因整合入内源基因组内,使外源基因得以表达。因整合入内源基因组内,使外源基因
7、得以表达。通过研究靶细胞或者个体在目的基因插入前后通过研究靶细胞或者个体在目的基因插入前后遗传特性的改变,达到研究基因功能的目的。遗传特性的改变,达到研究基因功能的目的。1、基因的同源重组、基因的同源重组9优质课件完完全全敲敲除除:通通过过同同源源重重组组直直接接将将靶靶基基因因在在细胞或者动物个体中的活性完全消除。细胞或者动物个体中的活性完全消除。条条件件敲敲除除:将将某某个个基基因因的的修修饰饰限限制制于于特特定定类型的细胞或个体发育特定的阶段。类型的细胞或个体发育特定的阶段。完全敲除完全敲除条件敲除条件敲除特定组织特定组织/时间基因敲除时间基因敲除基因敲除基因敲除10优质课件1)通过同源
8、重组的基因敲除步骤)通过同源重组的基因敲除步骤构建重组载体构建重组载体 重组重组DNA转入受体转入受体细胞核内细胞核内 筛选目的细胞筛选目的细胞 转基因生物转基因生物重组载体的类型:重组载体的类型:a)替换性载体系统:替换性载体系统:包括同源序列片段、替包括同源序列片段、替换基因的启动子、报道换基因的启动子、报道基因等成分。基因等成分。b)插入性载体系统:插入性载体系统:插入基因片段插入基因片段(目的基目的基因因)、同源序列片段、同源序列片段、标志基因片段。标志基因片段。11优质课件用用替替换换型型(a)或或插插入入型型(b)载载体体进进行行完完全全基基因因敲敲除除实验实验12优质课件2)Re
9、s同源重组系同源重组系统统源于源于噬菌体噬菌体Res重组酶的重组系重组酶的重组系统统Ha 和和Hb: 同源重组区域同源重组区域 Pa 和和Pb: 引物位点引物位点sm: 筛选标记筛选标记Red 同源重组技术用于基因打靶同源重组技术用于基因打靶13优质课件3)Cre-LoxP同源重组系统同源重组系统 源自源自P1噬菌体的重组系统噬菌体的重组系统 属属于于传传统统的的同同源源重重组组载载体体,但但具具有有时时空空调调控控的的功功能能。该该系系统统由由P1噬噬菌菌体体的的Cre重重组组酶酶和和LoxP位位点点两两部部分组成。分组成。nCre重重组组酶酶:由Cre基因编码,识别LoxP位点,介介导导两
10、两个个LoxPLoxP位位点点(序序列列)之之间间的的特特异异性性重重组组,使使LoxPLoxP位点间的基因序列被删除或重组。位点间的基因序列被删除或重组。nLoxP位位点点:由2个13bp的反向重复序列和1个8bp的间隔区域构成。14优质课件Cre酶 Cre酶 Cre酶 CreCre重组酶重组酶13bp的反向重复序列的反向重复序列 15优质课件Cre-LoxP 重组系统的特点重组系统的特点CreCrea) Cre 重组酶所催化的是一个可逆的重组事件重组酶所催化的是一个可逆的重组事件b) Cre催化重组不需要任何辅助因子的参与催化重组不需要任何辅助因子的参与介导两个同向介导两个同向LoxP位点
11、之间序列的插入位点之间序列的插入/缺失(下左)缺失(下左)介导两个反向介导两个反向LoxP位点之间序列颠倒(下右)位点之间序列颠倒(下右)介导两条含介导两条含LoxP位点位点DNA链的交换或染色体易位。链的交换或染色体易位。 1616优质课件优质课件Cre-Loxp gene knock-out system17优质课件4) 高等动物基因敲除技术高等动物基因敲除技术真真真真核核核核生生生生物物物物基基基基因因因因敲敲敲敲除除除除的的的的技技技技术术术术路路路路线线线线主主主主要要要要包包包包括括括括构构构构建建建建重重重重组组组组基基基基因因因因载载载载体体体体,用用用用电电电电穿穿穿穿孔孔孔
12、孔、显显显显微微微微注注注注射射射射等等等等方方方方法法法法把把把把重重重重组组组组DNADNA导导导导入入入入胚胚胚胚胎胎胎胎干干干干细细细细胞胞胞胞纯纯纯纯系系系系中中中中,使使使使外外外外源源源源DNADNA与与与与胚胚胚胚胎胎胎胎干干干干细细细细胞胞胞胞基基基基因因因因组组组组中中中中相相相相应应应应部部部部分分分分发发发发生生生生同同同同源源源源重重重重组组组组,将将将将重重重重组组组组载载载载体体体体中中中中的的的的DNADNA序列整合到内源基因组中并得以表达。序列整合到内源基因组中并得以表达。序列整合到内源基因组中并得以表达。序列整合到内源基因组中并得以表达。显显显显微微微微注注
13、注注射射射射命命命命中中中中率率率率较较较较高高高高,技技技技术术术术难难难难度度度度相相相相对对对对大大大大些些些些。电电电电穿穿穿穿孔孔孔孔法命中率比显微注射低,操作使用方法命中率比显微注射低,操作使用方法命中率比显微注射低,操作使用方法命中率比显微注射低,操作使用方 便。便。便。便。胚胚胚胚胎胎胎胎干干干干细细细细胞胞胞胞(ESES细细细细胞胞胞胞)分分分分离离离离和和和和体体体体外外外外培培培培养养养养的的的的成成成成功功功功奠奠奠奠定定定定了哺乳动物基因敲除的技术基础。了哺乳动物基因敲除的技术基础。了哺乳动物基因敲除的技术基础。了哺乳动物基因敲除的技术基础。18优质课件模式动物小模式
14、动物小鼠中完全基鼠中完全基因敲除的步因敲除的步聚聚近交系,白近交系,白色,易产生色,易产生免疫缺陷免疫缺陷 19优质课件2、基因的位点突变、基因的位点突变1)点突变)点突变TILLING技术技术TILLING (targeting induced local lesions in genomes) 定向诱导基因组局部突变定向诱导基因组局部突变,是一种快速有效地从由化学诱变,是一种快速有效地从由化学诱变剂剂(EMS)诱变过的突变群体中鉴定出点突变的方法。诱变过的突变群体中鉴定出点突变的方法。 先先用用化化学学诱诱变变剂剂(甲甲基基磺磺酸酸乙乙酯酯,EMS)诱诱发发产产生生一一系系列列的的点点突突
15、变变,再再用用设设计计的的特特异异性性引引物物进进行行PCR扩扩增增,然然后后将将PCR扩扩增增产产物物变变性性和和退退火火形形成成异异源源双双链链核核酸酸分分子子,再再用用特特异异切切割割错错配配的的内内切切酶酶CELl酶酶切切,最最后后变变性性处处理理后后采采用用双双色色聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝胶凝胶(PAGE)电泳检测分析。电泳检测分析。20优质课件(建池)(建池)21优质课件22优质课件TILLING特点:特点: TILLING技术属于高频率点突变和技术属于高频率点突变和PCR筛选相结筛选相结合的技术,可发现基因的错义突变、基因截短型合的技术,可发现基因的错义突变、基因截短型损伤等突变类
16、型。损伤等突变类型。u可可获获得得大大量量的的等等位位基基因因系系列列,对对长长度度很很小小基基因因,复等位基因等具有独特的技术优势。复等位基因等具有独特的技术优势。u可可诱诱导导产产生生高高频频率率的的点点突突变变,筛筛选选目目的的基基因因需需要要较小的突变群体。较小的突变群体。u不不依依赖赖于于农农杆杆菌菌介介导导转转化化或或内内源源标标签签系系统统,无无需需耗时的转基因和复杂的组织培养。耗时的转基因和复杂的组织培养。u需要知道所研究基因的序列。需要知道所研究基因的序列。23优质课件2)随机插入突变)随机插入突变A.T-DNA插入突变插入突变 以以农农杆杆菌菌介介导导的的转转化化为为基基础
17、础的的一一种种插插入入突突变变研研究究方方法法,根根据据插插入入位位点点的的基基因因序序列列与与植植物物表表型型变变异异等等的的相相互互关关系系可可以以从从基基因因组组中中分分离离出出相相应应的的基基因因并并鉴定其功能。鉴定其功能。构建构建T-DNA载体载体转化转化突变体的筛选及遗传分突变体的筛选及遗传分析析分离分离T-DNA 插入位点的侧翼序列插入位点的侧翼序列基因的基因的定位、结构与功能分析。定位、结构与功能分析。24优质课件T-DNA法法敲敲除除植植物物基基因因及突变体筛选:及突变体筛选: a.引引物物设设计计。LP和和RP分分别别代代表表插插入入基基因因两两端端的的引引物物,LB是是指
18、指载载体体上上的的一一段段 引引物物。旁旁邻邻序序列列是是经经测测序序后后获获得得的的DNA序列。序列。 b. PCR产产物物电电泳泳结结果果。分分别别代代表表野野生生型型、杂杂合合子子和和纯合子纯合子PCR条带。条带。25优质课件T-DNA插入特点:插入特点:n不能控制其在生物体基因组中的插入位点。在植物不能控制其在生物体基因组中的插入位点。在植物中用中用T-DNA 插入来敲除一个特定基因仍需要运气。插入来敲除一个特定基因仍需要运气。n隐性突变与显性突变:隐性隐性突变与显性突变:隐性表型的变化只能在表型的变化只能在转化体的部分后代中体现出来(基因敲除);显性转化体的部分后代中体现出来(基因敲
19、除);显性可以在转化体中直接观察到(基因激活)。可以在转化体中直接观察到(基因激活)。n某些特定基因,由于其特性在基因敲除后并不体现某些特定基因,由于其特性在基因敲除后并不体现出功能的丧失。原因:重要的功能基因突变致死和出功能的丧失。原因:重要的功能基因突变致死和冗余基因。冗余基因。n染色体重排:突变体表型与染色体重排:突变体表型与T-DNA 插入无关。插入无关。n效率不高,工作量大。建立饱和的突变体库。效率不高,工作量大。建立饱和的突变体库。26优质课件B.转座子插入突变转座子插入突变利用某些能随机插入基因序列的转座子,在目标细胞利用某些能随机插入基因序列的转座子,在目标细胞基因组中进行随机
20、插入突变,建立一个携带随机插入基因组中进行随机插入突变,建立一个携带随机插入突变的细胞库,然后通过相应的标记进行筛选获得相突变的细胞库,然后通过相应的标记进行筛选获得相应的基因敲除细胞。应的基因敲除细胞。由由转转座座子子引引起起的的突突变变可可以以转转座座子子DNA为为探探针针,从从突突变变体体的的基基因因组组DNA文文库库中中筛筛选选到到突突变变的的基基因因,再再利利用用这这部分序列从野生型基因文库中获得完整的基因。部分序列从野生型基因文库中获得完整的基因。也可以利用也可以利用PCR的方法扩增转座子的侧翼序列,进而的方法扩增转座子的侧翼序列,进而得到完整的基因信息。得到完整的基因信息。27优
21、质课件转座子插入特点:转座子插入特点:插入的是完整的元件,便于分析。插入的是完整的元件,便于分析。可从插入位点切除,产生回复突变,因此不仅可以可从插入位点切除,产生回复突变,因此不仅可以据此确认真正由转座子引起的突变,还可以进一步据此确认真正由转座子引起的突变,还可以进一步验证突变基因的功能。验证突变基因的功能。转座子倾向于插入转座子的临近区域,可以用来研转座子倾向于插入转座子的临近区域,可以用来研究基因组某一局部区域的结构。究基因组某一局部区域的结构。通过不断跳动产生新的突变,相对较少的起始转化通过不断跳动产生新的突变,相对较少的起始转化系就可以获得整个基因组的饱和突变,大大减少了系就可以获
22、得整个基因组的饱和突变,大大减少了工作量。工作量。可以应用于转化效率不高的植物。可以应用于转化效率不高的植物。28优质课件转座子系统转座子系统I.Ac/ Ds 系统系统 由由自自主主性性元元件件(Ac)和和非非自自主主性性元元件件(Ds)构构成成。Ds元元件件能能够够在在Ac编编码码的的转转座座酶酶的的作作用用下下移移动动,去去除除Ac元件可使其自身不能转座。元件可使其自身不能转座。 通通过过遗遗传传杂杂交交引引入入自自主主性性元元件件,转转座座子子插插入入序序列列可可以以重重新新移移动动。因因此此,Ac/Ds 转转座座子子插插入入系系统统只只需需要要少少量量的的转转基基因因品品系系(启启动动
23、品品系系)作作为为转转座座源源即可。即可。29优质课件在真核系统中,转座插入事件常不能产生可在真核系统中,转座插入事件常不能产生可见的表型,这是因为功能基因的冗余或在早见的表型,这是因为功能基因的冗余或在早期产生致死效应。采用经修饰的转座子可克期产生致死效应。采用经修饰的转座子可克服这些困难。服这些困难。修饰:转座因子后带一个报告基因,报告基修饰:转座因子后带一个报告基因,报告基因的表达只有在转座事件发生的情况下才能因的表达只有在转座事件发生的情况下才能获得,这样就可以通过报告基因来检测转座获得,这样就可以通过报告基因来检测转座子的表达情况。子的表达情况。修饰的修饰的Ac/Ds转座子系统转座子
24、系统30优质课件n增强子陷阱增强子陷阱( enhancer trap ):转座子含:转座子含有一个具弱小启动子驱动的报告基因。报告有一个具弱小启动子驱动的报告基因。报告基因的表达只有在转座发生在内源增强子附基因的表达只有在转座发生在内源增强子附近时才能获得。近时才能获得。n启动子陷阱启动子陷阱(promoter trap):转座子带有:转座子带有一个无启动子的报告基因,这个基因只有在一个无启动子的报告基因,这个基因只有在转座子插入一个植物活跃的内源启动子下游转座子插入一个植物活跃的内源启动子下游时才能表达。时才能表达。修饰的方法修饰的方法-增强子陷阱与启动子陷阱增强子陷阱与启动子陷阱31优质课
25、件II.Mu转座子转座子系统系统n转转座座子子打打靶靶载载体体是是以以两两种种噬噬菌菌体体Mu为为基基础础的的mini-Mu转座子,每个转座子上都携带标记基因。转座子,每个转座子上都携带标记基因。n可可以以在在拟拟删删除除基基因因两两侧侧各各插插入入一一个个mini-Mu转转座座子,然后在两个插入位点之间制造缺失。子,然后在两个插入位点之间制造缺失。n这这种种缺缺失失可可以以使使两两个个转转座座子子加加上上靶靶区区之之间间的的部部分分基因转移。基因转移。n特点:特点:u不需要知道基因组序列,仅已知外显子即可不需要知道基因组序列,仅已知外显子即可u载体构建迅速,技术简单载体构建迅速,技术简单u载
26、载体体可可以以携携带带多多种种不不同同抗抗性性基基因因,可可以以同同时时处处理理多基因。多基因。32优质课件三、基因沉默技术三、基因沉默技术I. 反义反义RNAII. RNA干扰干扰(RNAi)33优质课件I.反义反义RNA技术技术反义反义RNA技术是根据技术是根据RNA序列人工合成的互补序列人工合成的互补RNA。根据反义。根据反义RNA的作用机制可将其分为三类:的作用机制可将其分为三类:1、反反义义RNA是是直直接接作作用用于于靶靶mRNA的的核核蛋蛋白白体体结结合合位位点点或或与与靶靶mRNA直直接接结结合合形形成成双双链链RNA,从从而而直直接接抑抑制制mRNA的翻译或被的翻译或被RNA
27、酶酶识别降解。识别降解。2、反反义义RNA是是与与mRNA的的非非编编码码区区结结合合,引引起起mRNA构构象的变化,从而抑制其翻译。象的变化,从而抑制其翻译。3、反反义义RNA是是作作用用于于基基因因的的启启动动子子,直直接接抑抑制制靶靶mRNA的转录。的转录。34优质课件(一)概念(一)概念RNA干扰干扰(RNA interference,RNAi):与靶基因序列同源的双链与靶基因序列同源的双链RNA所诱导的所诱导的一种序列特异性转录后一种序列特异性转录后基因沉默基因沉默现象。现象。II.RNA干扰干扰35优质课件基因沉默基因沉默转录水平的基因沉默转录水平的基因沉默(Transcripti
28、onal Gene Silencing, TGS) 转录后水平的基因沉默转录后水平的基因沉默(Post-transcriptional Gene Silencing, PTGS)基因沉默基因沉默36优质课件转转录录水水平平的的基基因因沉沉默默(TGSTGS)是是指指基基因因在在细细胞胞核核内内RNARNA合合成成受受到到了了阻阻止止而而导导致致基基因因沉沉默默。转转录录水水平平基基因因沉沉默默可可以以通过有性世代传递,表现为减数分裂的可遗传性。通过有性世代传递,表现为减数分裂的可遗传性。引起转录水平基因沉默的机制主要有以下几种:引起转录水平基因沉默的机制主要有以下几种: 1.1.基基因因及及其
29、其启启动动子子甲甲基基化化:通通常常发发生生在在DNADNA的的CGCG序序列列的的碱碱基基上上,该区域碱基甲基化往往导致转录受抑制该区域碱基甲基化往往导致转录受抑制。 2.2.同同源源基基因因间间的的反反式式失失活活:拥拥有有同同源源序序列列的的沉沉默默位位点点和和其其他他位位点点的的DNADNA的的相相互互作作用用而而引引起起的的基基因因沉沉默默。甲甲基基化化并并失失活活的的基基因因能能作作为为一一种种“沉沉默默子子”,对对其其他他具具有有同同源源性性的的靶靶基基因因施施加加一一种种反反式式作作用用,使使具具有有同同源源序序列列的的靶靶基基因因发发生生甲甲基基化化并并导导致致失失活活。反反
30、式式失失活活的的靶靶基基因因既既可可以以与与沉沉默默基基因因是是等等位位基因,也可以是非等位基因。基因,也可以是非等位基因。 37优质课件3.后后成成修修饰饰作作用用导导致致的的基基因因沉沉默默:指指转转基基因因的的序序列列和和碱碱基基组组成成不不发发生生改改变变,但但是是其其功功能能却却在在个个体体发发育育的的某某一一阶阶段段受受到到细细胞胞内内因因子子的的修修饰饰作作用用后后而而关关闭闭。这这种种修修饰饰作作用用所所造造成成的的转转基基因因沉沉默默是是可可以以随随着着修修饰饰作作用用的的解解除除而而被被消消除除。后后成成修修饰作用导致的转基因沉默与受体植物的核型构成有关。饰作用导致的转基因
31、沉默与受体植物的核型构成有关。4.重重复复序序列列:外外源源基基因因如如果果以以多多拷拷贝贝形形式式整整合合到到同同一一位位点点上上,形形成成首首尾尾相相连连的的正正向向重重复复或或头头对对头头、尾尾对对尾尾的的反反向向重重复复,则则不不能能表表达达,而而且且拷拷贝贝数数越越多多,基基因因沉沉默默现现象象越越严严重重。这这种种重重复复序序列列诱诱导导的的基基因因沉沉默默可可能能是是重重复复序序列列间间自自发发配配对对,甲甲基基化化酶酶特特异异性性识识别别这这种种配配对对结结构构而而使使其其甲甲基基化化,从从而而抑抑制其表达。制其表达。38优质课件转转录录后后水水平平基基因因沉沉默默(PTGSP
32、TGS)则则是是指指基基因因能能够够在在细细胞胞核核里里被被稳稳定定地地转转录录,但但在在细细胞胞质质里里却却无无相相应应的的mRNAmRNA存存在的现象。在的现象。引起转录后水平的基因沉默机制主要有以下几种:引起转录后水平的基因沉默机制主要有以下几种:1.1.共共抑抑制制:由由NapoliNapoli在在转转CHSCHS基基因因的的矮矮牵牵牛牛花花中中发发现现,普普遍遍存存在在于于转转基基因因植植物物中中。其其发发生生是是由由于于外外源源基基因因编编码码区区与与受受体体细细胞胞基基因因间间存存在在同同源源性性而而导导致致外外源源基基因因与与内内源基因的表达同时受到抑制。源基因的表达同时受到抑
33、制。 具具有有同同源源性性的的外外基基因因和和内内源源基基因因在在细细胞胞核核内内的的转转录录速速率率很很高高,但但在在细细胞胞质质内内无无mRNAmRNA积积累累,是是典典型型的的转转录录后后水水平平基基因因沉沉默默。共共抑抑制制的的产产生生不不仅仅同同内内、外外源源基基因因间间编编码码区区的的同同源源性性有有关关,还还与与控控制制外外源源基基因因的的启启动动子子的的强度等因素有关。强度等因素有关。 39优质课件2.基基因因压压制制:CogoniCogoni等等首首先先在在粗粗糙糙脉脉孢孢霉霉的的转转化化实实验验中中发发现现,外外源源基基因因可可以以抑抑制制自自身身和和相相应应内内源源基基因
34、因的的表表达达,他他们们把把这这一一现现象象定定为为基基因因压压制制。基基因因压压制制是是可可逆逆的的,而而且且这这种种逆逆转转会会伴伴随随有有外外源源拷拷贝贝的的丢丢失失。基基因因压压制制发发生生在在转转录录后后水水平平,导导致致已已复复制的稳定态制的稳定态mRNAmRNA大量减少。大量减少。 3.3.RNARNA干干扰扰:指指将将与与靶靶基基因因的的mRNAmRNA同同源源互互补补的的双双链链RNA RNA (dsRNA) (dsRNA) 导导入入细细胞胞后后并并被被切切割割成成21212323个个核核苷苷酸酸长长度度的的短短核核苷苷酸酸双双链链,在在其其它它作作用用因因子子的的参参与与下
35、下能能够够特特异异地地与与其其同同源源的的mRNAmRNA结结合合并并导导致致其其降降解,从而产生相应的功能表型缺失。解,从而产生相应的功能表型缺失。 40优质课件RNAi 一种新的遗传工具一种新的遗传工具RNAi是是植植物物、果果蝇蝇、线线虫虫和和包包括括哺哺乳乳动动物物在在内内的的许许多多生生物物抵抵抗抗病病毒毒感感染染和和限限制制转转座座子子运运动动的的一一种种自然存在的防御机制。自然存在的防御机制。RNAi可可以以作作为为一一种种简简单单、有有效效的的代代替替基基因因敲敲除除的的遗遗传传工工具具,来来制制备备特特定定基基因因缺缺失失表表型型的的个个体体,从从而研究该基因的功能而研究该基
36、因的功能. 这这项项技技术术在在疾疾病病的的基基因因治治疗疗上上也也有有光光明明的的应应用用前前景景。特特别别可可以以用用于于阻阻断断某某些些突突变变基基因因的的表表达达,或或者由蛋白过量表达引起的疾病。者由蛋白过量表达引起的疾病。 41优质课件( (二二) )、RNARNA干扰的发现干扰的发现 19941994年年 CogoniCogoni等证明真菌中亦等证明真菌中亦有类似现象,此称为有类似现象,此称为基因压制基因压制(quelling)(quelling)。共抑制现象共抑制现象(cosuppression)(cosuppression) 上上世世纪纪9090年年代代初初,美美国国和和荷荷兰
37、兰的的两两个个转转基基因因植植物物实实验验组组在在对对矮矮牵牵牛牛( (petuniaspetunias) )的研究中发现的研究中发现: :转转基基因因的的植植株株不不仅仅没没有有新新基基因因表表达达,反反而而使使原原有有的的色色素素基基因因也也受受到了抑制。到了抑制。42优质课件19951995年,康乃尔大学的年,康乃尔大学的Su GuoSu Guo博士在博士在试图阻断秀丽新小杆线虫试图阻断秀丽新小杆线虫(C.elegans)(C.elegans)的的par-1par-1基因实验中发现:基因实验中发现:反义反义RNARNA与正义与正义RNARNA(对照)都能切断(对照)都能切断par-1pa
38、r-1基因的表达。该研究小组一直未基因的表达。该研究小组一直未能给这个意外以合理解释。能给这个意外以合理解释。 Guo S, Kemphues KJ, Par L. Cell, 1995,81:611-620.秀丽新小杆线虫转基因实验秀丽新小杆线虫转基因实验反义反义RNA与正义与正义RNA?反义RNA -与靶核酸与靶核酸(如如mRNA或有义或有义DNA)链互补的链互补的RNA分子,可抑制靶核酸的功能。分子,可抑制靶核酸的功能。 正义正义RNA-与与mRNA对应的对应的RNA分子。分子。43优质课件RNARNA干扰的发现干扰的发现 19981998年年,FireFire和和MelloMello(
39、美美)首首次次在在秀秀丽丽新新小小杆杆线线虫虫中中证证明明上上述述现现象象属属于于转转录录后后水水平平的的基基因因沉沉默默。他他们们发发现现Su Su GuoGuo博博士士遇遇到到的的正正义义RNARNA抑抑制制基基因因表表达达的的现现象象,以以及及过过去去的的反反义义RNARNA技技术术对对基基因因表表达达的的阻阻断断,都都是是由由于于体体外外转转录录所所得得RNARNA中中污污染染了了微微量量双双链链RNARNA而引起:而引起:将将体体外外转转录录得得到到的的单单链链RNARNA纯纯化化后后注注射射线线虫虫,基基因因抑抑制制效效应应变变得得十十分分微微弱弱,而而经经过过纯纯化化的的双双链链
40、RNARNA却却正正好好相相反反,能能够够高高效效特特异异性性阻阻断断相相应应基基因因的的表表达达,其其抑抑制制基基因因表表达达的的效效率率比比纯纯化化后后的的反义反义RNARNA至少高至少高2 2个数量级。该小组将这一现象称为个数量级。该小组将这一现象称为RNARNA干扰干扰。 Fire A, Xu S, Montgomery ME, et al. Nature. 1998,391:806-811.44优质课件(A)Negative control showing lack of staining in the absence of the hybridization probe. (对照,
41、缺(对照,缺mex-3 ,不着色),不着色)(B) Embryo from uninjected parent showing normal pattern of endogenous mex-3 RNA (purple staining). (正常野生型,紫)(正常野生型,紫)(C) Embryo from parent injected with purified mex-3 antisense RNA. These embryos (and the parent animals) retain mex-3 mRNA, although levels may be somewhat les
42、s than wild type. (野生型野生型+反义反义RNA,浅紫),浅紫)(D) Late 4-cell stage embryo from a parent injected with dsRNA corresponding to mex-3 ; no mex-3 RNA is detected. (Templates used for interfering RNA and in situ probes were largely non-overlapping.) (野生型(野生型+双链双链RNA,不着色),不着色)Effects of mex-3 RNA interference
43、 on levels of the endogenous mRNA. Nomarski DIC micrographs show in situ hybridization (原位杂交)(原位杂交)of 4-cell stage embryos. 45优质课件“沉默沉默”是是金金Fire与与Mello获获2006年诺年诺贝尔奖贝尔奖46优质课件在在19991999年一年内年一年内, ,发现发现RNARNA干扰现象广泛存在于植物、真菌、干扰现象广泛存在于植物、真菌、线虫、昆虫、蛙类、鸟类、大鼠、小鼠、猴一直到人类的几线虫、昆虫、蛙类、鸟类、大鼠、小鼠、猴一直到人类的几乎所有的真核生物细胞中。乎所
44、有的真核生物细胞中。20002000年,又先后发现小鼠早期胚年,又先后发现小鼠早期胚胎中和大肠杆菌中也存在胎中和大肠杆菌中也存在RNARNA干扰现象。干扰现象。20002000年提出年提出RNAiRNAi作用机制模型。作用机制模型。Hannond SM et al. Nature, 2000, 404(6775):293-296Zamore PD. Cell, 2000,101(1):25-3320012001年,年,RNAiRNAi技术成功诱导培养的哺乳动物细胞基因沉默现技术成功诱导培养的哺乳动物细胞基因沉默现象。象。NatureNature,20012001,411411(68366836
45、):):494494498498RNAiRNAi技术被技术被ScienceScience评为评为20012001年度的十大科技进展之一。年度的十大科技进展之一。47优质课件20022002年年5 5月,月,Lindenbach(Lindenbach(美美),),双链双链RNARNA艾滋艾滋病病毒病病毒细胞细胞减少艾滋病病毒基因表达减少艾滋病病毒基因表达90%90%以以上。上。20022002年年7 7月月,Novina,Novina等用等用RNAiRNAi技术实现了技术实现了HIV1HIV1病毒的阻抑。病毒的阻抑。20022002年年7 7月月, , McCaffrey(McCaffrey(美
46、美) )等等人人, , 双双链链RNA+RNA+肝肝炎炎病病毒毒- -标标志志基基因因鼠鼠肝肝脏脏抑抑制制标标志志基基因的表达因的表达/ /肝炎病毒基因的表达。肝炎病毒基因的表达。利利用用RNAiRNAi可可以以直直接接和和有有效效地地起起到到抗抗病病毒毒的的作作用。用。48优质课件共共抑抑制制、基基因因压压制制和和RNAidsRNA降降解解靶靶mRNA抑制靶基因的表达。均属于抑制靶基因的表达。均属于PTGS!dsRNA导导入入线线虫虫RNAi ;dsRNA注注射射线线虫虫体体腔腔RNAi ;dsRNA浸浸润润线线虫虫/dsRNA的的工工程程菌菌喂喂养养线虫线虫RNAi。dsRNA导导入入植植
47、物物RNAi;同同样样,dsRNA注注射射植植物物韧韧皮皮部部RNAi;吸吸附附500bp基基因因片片段段的的金金属属片片插插入入植物植物侵入点组织发生侵入点组织发生RNAi。RNAi普普遍遍存存在在于于各各种种生生物物中中,具具有有抗抗病病毒毒、稳稳定定转转座子及监控异常表达座子及监控异常表达mRNA的生物学功能。的生物学功能。49优质课件(三)、(三)、RNARNA干扰的机制干扰的机制 dsRNA:双链:双链RNA,包含正义链和反义链。,包含正义链和反义链。Dicer:属属于于RNase 家家族族的的一一员员,是是dsRNA的的特特异异性性核核酸酸内内切切酶酶,能能以以一一种种ATP依依赖
48、赖的的方方式式逐逐步步切切割割由由外外源源导导入入或或者者由由转转基基因因、病病毒毒感感染染等等各各种种方方式式引入的双链引入的双链RNA。siRNA (small interfering RNA) :小小干干扰扰RNA,是是长长度度为为21-23个个nt大大小小的的双双链链RNA,为为RNAi的的关关键效应分子。键效应分子。名词解释:名词解释:50优质课件Dicer contains two RNAse III domainsDicer contains two RNAse III domainssiRNAslong dsRNA51优质课件siRNA52优质课件RISC(RNA-induci
49、ng silencing complex): RNA诱诱导导沉沉默默复复合合物物,是是一一种种核核蛋蛋白白复复合合物物,具具有有核核酸酸内切、外切以及解旋酶活性。内切、外切以及解旋酶活性。RdRP(RNA-dependent RNA polymerases):): 依依赖赖RNA的的RNA聚聚合合酶酶,是是RNAi的的调调节节因因子子,使使RNAi可以在生物体内传递。可以在生物体内传递。53优质课件RISC: RNA-Induced Silencing ComplexExonucleaseHomology search activityEndonucleaseHelicase53Target
50、mRNAOH35P核酸外切酶核酸外切酶 解旋酶解旋酶 核酸内切酶核酸内切酶 54优质课件dsRNA介导的同源性靶介导的同源性靶mRNA降解过程主要分为两步:降解过程主要分为两步:第第一一步步(起起始始阶阶段段)较较长长dsRNA在在ATP参参与与下下,被被RNase的的特特异异核核酸酸酶酶切切割割加加工工成成2123nt的的,由由正正义义和和反反义义链链组组成成的的小小干干扰扰RNA(small interfering RNA,siRNA)。)。 siRNA的两条单链末端为的两条单链末端为5-磷酸和磷酸和3-羟基,且羟基,且3端均有端均有2个突出的核苷酸。个突出的核苷酸。 Dicer有解旋酶活
51、性并含有有解旋酶活性并含有 dsDNA结合域和结合域和PAZ结构域。结构域。Dicer的类似物相继在拟南芥、秀丽线虫及哺乳动物等机体中的类似物相继在拟南芥、秀丽线虫及哺乳动物等机体中被发现。被发现。步骤步骤55优质课件第第二二步步(效效应应阶阶段段)siRNA 在在ATP参参与与下下被被RNA解解旋旋酶酶解解旋旋成成单单链链,并并由由其其中中反反义义链链指指导导形形成成RNA诱诱导导的的沉沉默默复复合合体体(RNA-induced silencing complex,RISC)。活活化化的的RISC在在单单链链siRNA引引导导下下识识别别互互补补的的mRNA,并并在在RISC中中的的核核酸酸
52、内内切切酶酶作作用用下下从从siRNA引引导导链链中中心心所所对对应应的的靶靶基基因因位位置置切切割割靶靶mRNA,最最后后可可能能再被核酸外切酶进一步降解,从而干扰基因表达。再被核酸外切酶进一步降解,从而干扰基因表达。56优质课件RNAiRNAi的放大效应机制的放大效应机制siRNA不仅可引导不仅可引导RISC切割靶切割靶RNA,而且可作为引,而且可作为引物在物在RNA依赖的依赖的RNA聚合酶聚合酶(RdRP)作用下以靶作用下以靶mRNA为模板合成新的为模板合成新的dsRNA。新合成的长链新合成的长链dsRNA同样可被同样可被RNase核酸酶切割、核酸酶切割、降解而生成大量的降解而生成大量的
53、次级次级siRNA。次级。次级siRNA又可进又可进入合成入合成-切割的循环过程,进一步放大切割的循环过程,进一步放大RNAi作用。这作用。这种合成种合成-切割的循环过程称为切割的循环过程称为随机降解性随机降解性PCR(random degradative PCR)。)。57优质课件Gisela Storz, Science, 296(5571):1263-1265, 2002.异常的单链RNA依赖RNA的RNA聚合酶特异性核酸内切酶RNA诱导沉默复合物58优质课件RNAi是转录后水平的基因沉默机制;是转录后水平的基因沉默机制;RNAiRNAi具有很高的特异性:具有很高的特异性:a.只有只有d
54、sRNA才能诱导产生才能诱导产生RNAi;b.只有针对编码区的只有针对编码区的dsRNA才能产生有效的和特异性的干扰;才能产生有效的和特异性的干扰;c.注射同源注射同源dsRNA可以引起内源性可以引起内源性mRNA特异性的降解;特异性的降解;d.d.dsRNAdsRNA不不得得短短于于2121个个碱碱基基,大大于于30bp30bp的的dsRNAdsRNA不不能能在在哺哺乳乳动动物物中中诱诱导导特特异异的的RNARNA干干扰扰,而而是是细细胞胞非非特特异异性性和和全全面面的的基基因因表达受抑制凋亡;表达受抑制凋亡; RNAi具有高效性具有高效性: RNAi抑抑制制基基因因表表达达具具有有很很高高
55、的的效效率率,可可达达到到缺缺失失突突变变体体表表型型的的程程度度,而而且且相相对对很很少少量量的的dsRNA分分子子就就能能完完全全抑抑制制相相应基因的表达,这是通过催化放大的方式进行的;应基因的表达,这是通过催化放大的方式进行的;RNAi干扰的几个重要生物学特征干扰的几个重要生物学特征59优质课件RNAi具具有有很很好好的的稳稳定定性性:siRNA分分子子33端端有有突突出出的的非非配配对对碱碱基基的的双双链链分分子子,在在细细胞胞内内可可稳稳定定存存在在3- 3- 4d4d,以以33端端悬悬垂垂TTTT碱碱基基的的双双链链RNARNA尤尤为为稳稳定定,半半衰衰期期远远长长于于反反义义寡寡
56、聚聚核核苷酸。苷酸。 RNAi的的可可传传播播性性和和遗遗传传性性:RNAi抑抑制制基基因因表表达达的的效效应应可可以以长长距距离离传传递递和和维维持持信信号号甚甚至至传传播播至至整整个个有有机机体体以以及及可可遗遗传给传给F1,但,但F2往往恢复为野生型。往往恢复为野生型。RNAi效效应应的的依依赖赖性性:只只有有连连续续产产生生dsRNA才才能能产产生生长长期期效应,否则只产生短暂的沉默反应。效应,否则只产生短暂的沉默反应。RNAi作用迅速,作用迅速,mRNA快速降解;快速降解;60优质课件miRNA及其作用机制及其作用机制miRNA(microRNA) : 微小微小RNA,指长度约,指长
57、度约2125nt的小分子单链的小分子单链RNA,位于基因组的非编码区,位于基因组的非编码区,进化上高度保守,可在进化上高度保守,可在翻译水平上翻译水平上对基因表达进行对基因表达进行调节的调节的RNA家族。其介导的沉默机制也属于转录后家族。其介导的沉默机制也属于转录后的基因沉默。的基因沉默。miRNA基基因因的的表表达达具具有有特特定定模模式式: 阶阶段段特特异异性性和和组组织织特特异异性性,在在不不同同组组织织中中表表达达有有不不同同类类型型的的miRNA,在生物发育的不同阶段里有不同的,在生物发育的不同阶段里有不同的miRNA 表达。表达。61优质课件miRNA的的作用机制作用机制62优质课
58、件相同点相同点:长度都约长度都约22 nt 左右;左右;同是同是Dicer产物,因此具有产物,因此具有Dicer产物的特点;产物的特点;二者生成都需二者生成都需Argonaute 家族蛋白的存在;家族蛋白的存在;同是同是RISC的组分。的组分。miRNA与与siRNA比较比较63优质课件来来源源不不同同:siRNA来来源源于于转转基基因因或或病病毒毒RNA,由由长长dsRNA转转变变而而来来;miRNA来来源源于于内内源源转转录录本本,是是细细胞胞内内RNA的的固固有组分之一,由具有发夹状结构的有组分之一,由具有发夹状结构的pre-miRNA转变而来;转变而来;结结构构不不同同:siRNA主主
59、要要以以双双链链形形式式存存在在,其其3端端存存在在2个个非非配对的碱基,通常为配对的碱基,通常为UU;miRNA主要以单链形式存在;主要以单链形式存在;对对靶靶RNA 的的特特异异性性不不同同: siRNA与与靶靶mRNA完完全全互互补补配配对对结结合合;miRNA与与靶靶RNA并并不不完完全全互互补补,存存在在错错配配现现象象。靶靶序序列列有有一一个个核核苷苷酸酸突突变变,就就会会影影响响到到siRNA的的作作用用功功能能,但但不会影响到不会影响到miRNA的功能;的功能;作作用用形形式式不不同同:siRNA主主要要在在转转录录后后通通过过降降解解mRNA发发挥挥作作用,而用,而miRNA
60、只在蛋白质翻译水平上负调控靶基因的表达。只在蛋白质翻译水平上负调控靶基因的表达。不同点不同点:64优质课件(四)、(四)、RNARNA干扰的研究方法干扰的研究方法 一般技术路线一般技术路线65优质课件(五)、(五)、RNARNA干扰的应用干扰的应用 1.基因功能研究基因功能研究由由于于RNAi具具有有高高度度的的序序列列专专一一性性和和有有效效的的干干扰扰活活力力,可可以以特特异异地地使使特特定定基基因因沉沉默默,获获得得功功能能丧丧失失或或降降低低突突变变,因因此此可可以作为功能基因组学的一种强有力的研究工具。以作为功能基因组学的一种强有力的研究工具。已已有有研研究究表表明明RNAi能能够够
61、在在哺哺乳乳动动物物中中抑抑制制特特定定基基因因的的表表达达,制制作作多多种种表表型型,而而且且抑抑制制基基因因表表达达的的时时间间可可以以控控制制在在发发育育的的任何阶段,产生任何阶段,产生类似基因敲除的效应类似基因敲除的效应。与与传传统统的的基基因因敲敲除除技技术术相相比比,这这一一技技术术具具有有投投入入少少,周周期期短短,操操作作简简单单等等优优势势,近近来来RNAi成成功功用用于于构构建建转转基基因因动动物物模模型型的的报报道道日日益益增增多多,标标志志着着RNAi将将成成为为研研究究基基因因功功能能不不可可或或缺的工具。缺的工具。 66优质课件2.病毒性疾病的治疗病毒性疾病的治疗
62、使使用用RNAi技技术术来来阻阻止止艾艾滋滋病病病病毒毒进进入入人人体体细细胞胞。某某研研究究小小组组设设计计合合成成的的lenti病病毒毒载载体体引引入入siRNA,激激发发RNAi使使其其抑抑制制了了HIV-1的的coreceptor-CCR5(化化介介素素受受体体, HIV-1的的辅辅因因子子)进进入入人人体体外外周周淋淋巴巴细细胞胞,而而不不影影响响另另一一种种HIV-1主主要要的的coreceptor-CCR4,从从而而使使以以lenti病病毒毒载载体体为为媒媒介介引引导导siRNA进进入入细细胞胞内内产产生生了了免免疫疫应应答答,由由此此治治疗疗HIV-1和和其其他他病病毒毒感感染
63、染性性疾疾病的可行性大大增加。病的可行性大大增加。艾滋病艾滋病67优质课件2.病毒性疾病的治疗病毒性疾病的治疗 Shlomai和和Shaul设设计计了了各各针针对对HBV基基因因19nt的的两两种种pSUPER载载 体体 : pSUPER X-siRNA和和 pSUPER core-siRNA。已已转转染染含含1.3 X wt HBV基基因因质质粒粒载载体体的的Huh7细细胞胞再再被被 X-siRNA或或 core-siRNA转转染染后后,core蛋蛋 白白 水水 平平 分分 别别 降降 低低 了了 89%、 63%, 转转 染染 X-siRNA的的 细细 胞胞 中中 HBsAg降降 低低 6
64、0%, 但但 转转 染染 core-siRNA对对HBsAg表表达达无无明明显显影影响响(X-siRNA干干扰扰沉沉默默了了所所有有的的病病毒毒转转录录物物,而而core-siRNA仅仅沉沉默默3.5kb、3.9kb的的mRNA)。)。 HBV(乙肝病毒)(乙肝病毒)68优质课件2.病毒性疾病的治疗病毒性疾病的治疗 Randall等等证证明明了了针针对对HCV RNA的的siRNA转转染染细细胞胞4天天后后可可使使细细胞胞质质中中复复制制的的HCV RNA降降低低80倍倍;将将siRNA 转转染染至至已已有有HCV感感染染、复复制制的的细细胞胞,siRNA对对98%以以上上可可检检测测到到HC
65、V抗抗原原、HCV复复制制活活跃跃的的细细胞胞有有抑抑制制作作用用;siRNA干干扰扰沉沉默默HCV RNA具具有有剂剂量量依依赖赖性性和和序序列列特特异异性性。Kapadia等等 也也证证明明了了siRNA特异抑制特异抑制HCV RNA复制、阻止相关蛋白表达的作用。复制、阻止相关蛋白表达的作用。 HCV(丙肝病毒)(丙肝病毒)69优质课件2.病毒性疾病的治疗病毒性疾病的治疗 RNAi还还可可应应用用于于其其它它病病毒毒感感染染如如脊脊髓髓灰灰质质炎炎病病毒毒等等,siRNA已已证证实实介介导导人人类类细细胞胞的的细细胞胞间间抗抗病病毒毒免免疫疫,用用siRNA对对Magi细细胞胞进进行行预预
66、处处理理可可使使其其对对病病毒毒的的抵抵抗抗能能力增强。力增强。严严 重重 急急 性性 呼呼 吸吸 综综 合合 征征 (severe acute respiratory syndrome,SARS)的的防防治治研研究究,RNAi也也受受到到了了重重视视。siRNA在在感感染染的的早早期期阶阶段段能能有有效效地地抑抑制制病病毒毒的的复复制制,病病毒毒感感染染能能被被针针对对病病毒毒基基因因和和相相关关宿宿主主基基因因的的siRNA所阻断,这些结果提示所阻断,这些结果提示RNAi能胜任许多病毒的治疗。能胜任许多病毒的治疗。 脊髓灰质炎病毒脊髓灰质炎病毒/SARS70优质课件3.肿瘤治疗肿瘤治疗 用
67、用RNAiRNAi特异性地抑制癌基因、癌相关基因或突变基因的过度表特异性地抑制癌基因、癌相关基因或突变基因的过度表达,使这类基因保持在静默或休眠状态,从而有望用这种新的达,使这类基因保持在静默或休眠状态,从而有望用这种新的手段治疗各种恶性肿瘤。手段治疗各种恶性肿瘤。(1)RNAi可应用于敲除点突变激活的癌基因。可应用于敲除点突变激活的癌基因。(2)RNAi可应用于抑制插入基因及融合基因的表达。可应用于抑制插入基因及融合基因的表达。(3)RNAi可应用于抑制基因扩增。可应用于抑制基因扩增。Li等在等在3个个肝癌肝癌细胞系细胞系Hep3B、HepG2、SNU449中对中对cyclin E的研究中发
68、现,的研究中发现,转染转染siRNA组组48 h后生长抑制均达到后生长抑制均达到90,而对照组无作用,而对照组无作用,3天后凋亡率分别为天后凋亡率分别为16 、44和和3l,而,而对照组仅为对照组仅为l。71优质课件3.肿瘤治疗肿瘤治疗 Survivin基基因因是是迄迄今今为为止止克克隆隆出出的的最最小小凋凋亡亡抑抑制制蛋蛋白白家家族族成成员员 , 可可 通通 过过 抑抑 制制 caspase级级 链链 反反 应应 下下 游游 的的 caspase3,caspase7发发挥挥其其抗抗凋凋亡亡作作用用。现现在在研研究究已已证证实实survivin基基因因参参与与了了肝肝癌癌的的发发生生与与发发展
69、展,并并且且还还与与化化疗疗的的耐耐药药性性相相关关。降降低低survivin基基因因在在肝肝癌癌细细胞胞中中的的表表达达不不仅仅可可诱诱导导肝肝癌癌细细胞胞的的凋凋亡亡、抑抑制制肝肝癌癌细细胞胞的的生生长长,还还可可增增强强其其对对化化疗疗的的敏敏感感性性,从而提高肝癌治疗的整体疗效。从而提高肝癌治疗的整体疗效。CHENG等通过等通过RNAi抑制肝癌细胞抑制肝癌细胞SMMC7721中中survivin基基因的表达因的表达,使细胞株中,使细胞株中survivin基因表达几乎缺失,凋亡指基因表达几乎缺失,凋亡指数增加数增加156,肝癌细胞生长被抑制。,肝癌细胞生长被抑制。 肝癌肝癌Survivi
70、n基因表达抑制基因表达抑制72优质课件3.肿瘤治疗肿瘤治疗 MDR (Muhidrug resistance 多多药药耐耐性性)是是肿肿瘤瘤化化疗疗失失败败的的主主要要原原因因,形形成成MDR的的最最常常见见的的因因素素是是肿肿瘤瘤细细胞胞MDR基基因因编编码码的的糖糖蛋蛋白白过过度度表表达达,其其中中,MDR1对对于于细细胞胞的的多多重重耐耐药药性性起起着着重重要要的的作作用用。Nieth等等表表明明,特特异异siRNA可可以以抑抑制制MDR1基基因因的表达,从而显著降低肿瘤细胞的耐药性。的表达,从而显著降低肿瘤细胞的耐药性。PLK1基基因因在在多多种种癌癌症症中中都都呈呈高高度度表表达达,
71、当当使使用用RNAi技技术术减减少少其其表表达达后后,所所有有癌癌细细胞胞的的PLKlmRNA和和蛋蛋白白水水平平都都有有显显著著降降低低,如如MCF-7乳乳腺腺癌癌细细胞胞的的PLKlmRNA下下降降了了70% ,蛋蛋白白水水平平下下降降了了90% ,而而且且细细胞胞凋凋亡亡率率提提高高了了百百分分之之几几至至50%不不等等。所所以以,PLK1的的siRNA具具有有抵抵抗抗癌癌细细胞胞的的增增殖殖作作用用,是是一一种种治治疗癌症的新途径。疗癌症的新途径。 MDR/PLK1基因表达抑制基因表达抑制73优质课件4.药物开发药物开发 利利用用RNAi技技术术来来研研究究药药物物作作用用的的特特异异性性和和机机制制对对于于加加快快药药物物开开发发的的研研制制速速度度大大有有益益处处。在在药药物物开开发发过过程程中中,用用RNAi技技术术可可以以对对靶靶基基因因的的功功能能进进行行分分析析,有有助助于于搞搞清清药药物物的的作作用用机机制制以以及及与与基基因因编编码码产产物物,及及与与相相应应化化合合物物的的相相互互作作用用,从从而而更更正正确确地地发发现药靶,开发更有效的候选药物。现药靶,开发更有效的候选药物。74优质课件