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1、CHAPTER7聚合酶链反应福建医科大学分子医学研究中心福建医科大学分子医学研究中心福建医科大学分子医学研究中心福建医科大学分子医学研究中心医学分子生物学PCR的用途的用途体体外外扩扩增增特特异异DNA片片段段的的技技术术，能能快快速速、特特异异地扩增目的地扩增目的DNA片段。片段。p能能通通过过试试管管内内的的数数小小时时反反应应将将特特定定的的DNA片段扩增数百万倍。片段扩增数百万倍。p迅迅速速获获取取大大量量的的单单一一核核酸酸片片段段，为为分分子子生生物学研究提供了强大的工具。物学研究提供了强大的工具。1953年年，Watson和和Crick提提出出DNA双双螺螺旋旋结构及结构及半保留
2、复制半保留复制模型。模型。1958年年，Meselson和和Stahl用用实实验验证证实实DNA半保留复制模型。半保留复制模型。70年年代代以以来来，人人们们采采用用两两种种思思路路去去尝尝试试建建立立基基因因的的无无性性繁繁殖殖体体系系，一一是是基基因因克克隆隆技技术，二是术，二是体外扩增体外扩增技术。技术。发展历程发展历程1971年年，Khorana（美美国国MIT教教授授，1968年年诺诺贝贝尔尔医医学学奖奖得得主主）：“经经过过DNA变变性性，与与合合适适引引物物杂杂交交，用用DNA聚聚合合酶酶延延伸伸引引物物，并并不断重复该过程便可克隆不断重复该过程便可克隆tRNA基因。基因。”核酸
3、体外扩增最早设想被遗忘原因核酸体外扩增最早设想被遗忘原因:（1）很难进行测序和合成寡核苷酸引物；）很难进行测序和合成寡核苷酸引物；（2）1970年年Smith等等发发现现了了II型型限限制制性性内内切切酶，体外克隆基因已成为可能。酶，体外克隆基因已成为可能。1976年年，台台籍籍科科学学家家钱钱嘉嘉韵韵（AliceChien）从从黄黄石石国国家家公公园园的的嗜嗜热热菌菌Thermusaquaticus中分离出热稳定的中分离出热稳定的TaqDNA聚合酶聚合酶。1985年年，美美国国Cetus公公司司人人类类遗遗传传研研究究室室的的Mullis发发 明明 聚聚 合合 酶酶 链链 反反 应应 （ P
4、olymeraseChainReaction，PCR），Saiki等等首首次次应应用用PCR法法成成功功地地扩扩增增了了人人 -珠珠蛋蛋白白的的DNA，并并应用于镰刀状红细胞贫血的产前诊断。应用于镰刀状红细胞贫血的产前诊断。1988年年Saiki开开始始将将耐耐热热性性TaqDNA聚聚合合酶酶应应用用于于PCR，整整个个反反应应只只加加一一次次酶酶即即可可，扩扩增特异性和效率都明显改善，操作大为简化。增特异性和效率都明显改善，操作大为简化。1989年年被被誉誉为为“分分子子年年”，列列PCR为为十十余余项项发明之首。发明之首。1993年，年，Mullis荣获诺贝尔化学奖。荣获诺贝尔化学奖。PC
5、R的基本原理的基本原理试管中进行的试管中进行的DNA复制反应，依据复制反应，依据DNA半保留复制半保留复制的机理；的机理；体体外外DNA分分子子于于不不同同温温度度下下可可变变性性和和复复性性的性质；的性质；通过人为控制体外合成系统的温度，使通过人为控制体外合成系统的温度，使双链双链DNA变成单链变成单链，单链单链DNA与人工合成的与人工合成的引物退火引物退火，DNA聚聚合合酶酶使使引引物物沿沿着着单单链链模模板板延延伸伸为为双双链链DNA。待扩增片段待扩增片段高温变性高温变性低温退火低温退火中温延伸中温延伸uPCR每每一一步步的的转转换换通通过过温温度度的的改改变变控控制制。DNA模模板板解
6、解链链（变变性性）、引引物物与与模模板板结结合合（退退火火）、DNA聚聚合合酶酶催催化化新新生生DNA的的合合成成（延延伸伸）三三个个步步骤骤构构成成PCR反反应应的的一一个个循环。循环。u此此循循环环反反复复进进行行，可可使使目目的的DNA得得以以迅迅速速扩增。扩增。u理理论论扩扩增增率率：2n递递增增（n为为循循环环次次数数），2530循环，目标循环，目标DNA可增加可增加109倍。倍。u实实际际扩扩增增率率：()n，X为为PCR的的实实际际扩扩增率，增率，平均约为平均约为75%。u由由于于引引物物和和底底物物的的消消耗耗，酶酶活活力力的的下下降降等等因因素素，扩扩增增产产物物的的增增加加
7、，逐逐渐渐由由指指数数形形式式变变为为线线性性形形式式，所所以以实实际际上上进进行行30个个循循环环后后，扩扩增倍数一般可达增倍数一般可达106107。u以以上上“变变性性、退退火火、延延伸伸”三三部部曲曲为为PCR一一轮循环。轮循环。PCR扩增曲线扩增曲线PCR反应体系与流程反应体系与流程反应体系反应体系模板模板（DNA或或RNA）引物引物TaqDNA聚合酶聚合酶10PCR缓冲液缓冲液1.54mMMg2+0.2mMdNTP反应流程反应流程预变性预变性变性变性退火退火延伸延伸延伸完全延伸完全终止终止2535循环循环一、一、PCR的反应体系的反应体系1.引物（引物（primer）2.酶酶（Taq
8、DNApolymerase）3.dNTP4.模板模板（template）5.Mg2+（magnesium）1 1、引物、引物引物：决定引物：决定PCR反应的特异性反应的特异性PCR产物的特异性取决于引物与模板产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度互补的程度理论上，只要知道任何一段模板理论上，只要知道任何一段模板DNA序序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，用物，用PCR就可将模板就可将模板DNA在体外大量在体外大量扩增扩增u基基本本原原则则是是最最大大限限度度地地提提高高扩扩增增效效率率和和特特异性，同时尽可能抑制非特异性扩增。异性，同时尽可能抑制
9、非特异性扩增。引物设计的原则引物设计的原则引物长度：引物长度：15-30bp，常用，常用20bp左右左右引物的有效长度不能大于引物的有效长度不能大于引物的有效长度不能大于引物的有效长度不能大于 38bp38bp，否则最适，否则最适，否则最适，否则最适延伸温度会超过延伸温度会超过延伸温度会超过延伸温度会超过TaqDNATaqDNA聚合酶的最适温度聚合酶的最适温度聚合酶的最适温度聚合酶的最适温度（7474），不能保证），不能保证），不能保证），不能保证PCRPCR扩增产物的特异性扩增产物的特异性扩增产物的特异性扩增产物的特异性引物扩增跨度：引物扩增跨度：以以500bp为宜为宜特定条件下可扩增长至特
10、定条件下可扩增长至特定条件下可扩增长至特定条件下可扩增长至10kb10kb的片段的片段的片段的片段引物碱基：引物碱基：G+C含量以含量以40-60%为宜为宜G+CG+C太少扩增效果不佳，太少扩增效果不佳，太少扩增效果不佳，太少扩增效果不佳，G+CG+C过多易出现非过多易出现非过多易出现非过多易出现非特异条带特异条带特异条带特异条带ATGCATGC最好随机分布，避免最好随机分布，避免最好随机分布，避免最好随机分布，避免5 5个以上的嘌呤或个以上的嘌呤或个以上的嘌呤或个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列，尤其嘧啶核苷酸的成串排列，尤其嘧啶核苷酸的成串排列，尤其嘧啶核苷酸的成串排列，尤其33端不应超过
11、端不应超过端不应超过端不应超过3 3个连续个连续个连续个连续的的的的GG或或或或C C，因为这样会使引物在，因为这样会使引物在，因为这样会使引物在，因为这样会使引物在G+CG+C富集区富集区富集区富集区 引发错引发错引发错引发错误延伸误延伸误延伸误延伸避免引物内部出现二级结构和引物间互补避免引物内部出现二级结构和引物间互补特别避免特别避免特别避免特别避免 33端的互补，否则会形成引物二聚体，端的互补，否则会形成引物二聚体，端的互补，否则会形成引物二聚体，端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异性的扩增条带产生非特异性的扩增条带产生非特异性的扩增条带产生非特异性的扩增条带 引物引物3端的碱基要
12、求严格配对（不能做任何端的碱基要求严格配对（不能做任何修饰）修饰）特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端碱基不配对而导致碱基不配对而导致碱基不配对而导致碱基不配对而导致PCRPCR失败失败失败失败引物引物5端可修饰端可修饰引物引物引物引物55端限定着端限定着端限定着端限定着PCRPCR产物的长度，但对扩增特产物的长度，但对扩增特产物的长度，但对扩增特产物的长度，但对扩增特异性影响不大；引物异性影响不大；引物异性影响不大；引物异性影响不大；引物55端碱基可不与模板端碱基可不与
13、模板端碱基可不与模板端碱基可不与模板DNADNA互补而呈游离状态；引物互补而呈游离状态；引物互补而呈游离状态；引物互补而呈游离状态；引物55端最多可加端最多可加端最多可加端最多可加1010个碱个碱个碱个碱基而对基而对基而对基而对PCRPCR反应无影响反应无影响反应无影响反应无影响35 5 35 5 限制性内切酶的识别序列限制性内切酶的识别序列限制性内切酶的识别序列限制性内切酶的识别序列启动子序列启动子序列启动子序列启动子序列定点突变定点突变定点突变定点突变探针标记探针标记探针标记探针标记引物的特异性：引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同
14、引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性源性源性源性引物量：引物量：每条引物的浓度每条引物的浓度每条引物的浓度每条引物的浓度0.10.50.10.5 MM，以最低引物量产，以最低引物量产，以最低引物量产，以最低引物量产生所需要的结果为好生所需要的结果为好生所需要的结果为好生所需要的结果为好引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会可增加引物之间形成二聚体的机会可增加引物之间形成二聚体的机会可增加引物之间形
15、成二聚体的机会实例：设计人类实例：设计人类GAPDH基因基因mRNA的引物的引物1.用用PrimerPremier软件设计引物；软件设计引物；2.在在UCSCGenomeBrowser上验证（如果上验证（如果失败则重新设计）失败则重新设计）1.我们设计的引物，是根据我们设计的引物，是根据GAPDH的的mRNA序列设计的，理论扩增长度是序列设计的，理论扩增长度是318bp，但它，但它却在人类基因组上扩增出了却在人类基因组上扩增出了两个片段两个片段；2.第一个片段来自第一个片段来自12号染色体号染色体的扩增，长度为的扩增，长度为2409bp；第二个片段来自；第二个片段来自X染色体染色体的扩增，的扩
16、增，片段长度是片段长度是318bp。那么，那个扩增片段才是正确的呢？我们设那么，那个扩增片段才是正确的呢？我们设计的这一对引物可否用于扩增人类计的这一对引物可否用于扩增人类GAPDH基因片段呢？基因片段呢？12号染色体扩增出的序列是真正的号染色体扩增出的序列是真正的GAPDH基因。基因。在下面的序列比对中，我们可以发现，在下面的序列比对中，我们可以发现，X染染色体上被扩增出的序列实际上是色体上被扩增出的序列实际上是GAPDH的的加工的假基因加工的假基因（processedpseudogene）。）。因此，如果我们能保证作为模板的因此，如果我们能保证作为模板的cDNA不不混杂有染色体混杂有染色体
17、DNA，就可以用这一对引物，就可以用这一对引物扩增扩增GAPDH。2、酶及其浓度、酶及其浓度n目前有两种目前有两种目前有两种目前有两种 TaqDNATaqDNA聚合酶供应聚合酶供应聚合酶供应聚合酶供应天然酶：从水生嗜热杆菌中提纯天然酶：从水生嗜热杆菌中提纯天然酶：从水生嗜热杆菌中提纯天然酶：从水生嗜热杆菌中提纯基因工程酶：大肠菌合成基因工程酶：大肠菌合成基因工程酶：大肠菌合成基因工程酶：大肠菌合成n一个典型的一个典型的一个典型的一个典型的 PCRPCR反应约需酶量反应约需酶量反应约需酶量反应约需酶量1-2.5U/100ul1-2.5U/100ul体系体系体系体系n浓度过高可引起非特异性扩增，浓
18、度过低则合成产浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少物量减少物量减少物量减少DNA聚合聚合酶l lKlenow片段片段l lT4DNA聚合聚合酶l l TaqDNA聚合聚合酶（应用最广）用最广）l l其他其他DNA聚合聚合酶：TthDNA聚合聚合酶VentDNA聚合聚合酶 PfuDNA聚合聚合酶等等Taq酶的保真性不高酶的保真性不高53聚合酶活性和聚合酶活性和53外切酶活性外切酶活性，无无35外切外切活性活性;在在PCR反应中如发生某些碱基的错配，该反应中如发生某些碱基的错配，该酶是没有校正功
19、能的。保真性不如酶是没有校正功能的。保真性不如PfuDNA聚合酶聚合酶等等。3、dNTP的质量与浓度的质量与浓度在在在在PCRPCR反应中，反应中，反应中，反应中，dNTPdNTP应为应为应为应为5050200200 MM，浓度，浓度，浓度，浓度过低会降低过低会降低过低会降低过低会降低PCRPCR产物的产量产物的产量产物的产量产物的产量注意注意注意注意4 4种种种种dNTPdNTP的浓度要相等（等摩尔配制的浓度要相等（等摩尔配制的浓度要相等（等摩尔配制的浓度要相等（等摩尔配制 ）, ,如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏如其中任何一种浓度不同于其它几种时
20、（偏如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配高或偏低），就会引起错配高或偏低），就会引起错配高或偏低），就会引起错配高浓度的高浓度的高浓度的高浓度的dNTPdNTP可与可与可与可与MgMg2+2+结合，使游离的结合，使游离的结合，使游离的结合，使游离的MgMg2+2+浓度下降，影响浓度下降，影响浓度下降，影响浓度下降，影响DNADNA聚合酶的活性聚合酶的活性聚合酶的活性聚合酶的活性 4、模板、模板DNA模板模板模板模板DNADNA的来源：的来源：的来源：的来源： 微生物中提取微生物中提取微生物中提取微生物中提取DNADNA从细胞中提取从细胞中提取从细胞中提取从细胞中提取D
21、NADNA：血细胞、绒毛、尿样、毛：血细胞、绒毛、尿样、毛：血细胞、绒毛、尿样、毛：血细胞、绒毛、尿样、毛发、精斑、口腔上皮细胞发、精斑、口腔上皮细胞发、精斑、口腔上皮细胞发、精斑、口腔上皮细胞 固定和包埋的组织标本：脱蜡、蛋白酶固定和包埋的组织标本：脱蜡、蛋白酶固定和包埋的组织标本：脱蜡、蛋白酶固定和包埋的组织标本：脱蜡、蛋白酶KK消化消化消化消化模板模板模板模板DNADNA的浓度：的浓度：的浓度：的浓度： 0.10.12ug/100ul2ug/100ul体系体系体系体系 PCRPCR产量随模板产量随模板产量随模板产量随模板DNADNA浓度的增加而显著升高浓度的增加而显著升高浓度的增加而显著
22、升高浓度的增加而显著升高 模板模板模板模板DNADNA浓度浓度浓度浓度过高导致过高导致过高导致过高导致非特异性产物非特异性产物非特异性产物非特异性产物增加增加增加增加 5、Mg2+浓度浓度Mg2+对对PCR扩增的扩增的特异性特异性和和产量产量有显著有显著的影响的影响在一般的在一般的PCR反应中，各种反应中，各种dNTP浓度为浓度为200umol/L时，时，Mg2+浓度为浓度为1.52.0mmol/L为宜为宜Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，非特异扩增，浓度过低会降低浓度过低会降低TaqDNA聚合酶的活性，使反应产物减少聚合酶的活性，使反应产物减少二
23、、二、PCR的反应流程的反应流程1.温度与时间的设置温度与时间的设置2.循环次数循环次数3.常见问题常见问题1、温度与时间的设置、温度与时间的设置设置变性设置变性-退火退火-延伸三个温度点延伸三个温度点标准反应中采用标准反应中采用三温度点法三温度点法，双链，双链DNA在在9095变性，再迅速冷却至变性，再迅速冷却至4060退火，然后快速升温至退火，然后快速升温至7075延延伸，伸，对于较短靶基因（对于较短靶基因（长度长度100300bp）可可采用采用二温度点法二温度点法，将退火与延伸温度合将退火与延伸温度合二为一，一般采用二为一，一般采用94变性，变性，65左右左右退火与退火与延伸。延伸。变性
24、温度与时间：变性温度与时间：一般一般9394，1min足以使足以使模板变性模板变性若低于若低于若低于若低于9393则需延长时间则需延长时间则需延长时间则需延长时间但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。影响。影响。影响。退火退火(复性复性)温度与时间：温度与时间：退火温度是影响退火温度是影响PCR特异性的重要因素特异性的重要因素退火温度与时间，取决于引物的长度、退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基因序列的碱基组成及其浓度，还有靶基因序列的长度长度
25、对于对于20个核苷酸，个核苷酸，G+C含量约含量约50%的引的引物，物，55作为选择最适退火温度的起点作为选择最适退火温度的起点较为理想较为理想引物的复性温度引物的复性温度通过以下公式帮助选择合适的温度：通过以下公式帮助选择合适的温度：Tm（解链温度解链温度）4(G+C)+2(A+T)复性温度复性温度=Tm值（值（510）在在在在TmTm值允许范围内，选择较高的复性温度可值允许范围内，选择较高的复性温度可值允许范围内，选择较高的复性温度可值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提大大减少引物和模板间的非特异性结合，提大大减少引物和模板间的非特异性结合，提大大减少引
26、物和模板间的非特异性结合，提高高高高PCRPCR反应的特异性反应的特异性反应的特异性反应的特异性复性时间一般为复性时间一般为3060s，足以使引物与模足以使引物与模板之间完全结合板之间完全结合延伸温度与时间：延伸温度与时间：TaqDNA聚合酶的生物学活性：聚合酶的生物学活性：7080150核苷酸核苷酸/S/酶分子酶分子7060核苷酸核苷酸/S/酶分子酶分子5524核苷酸核苷酸/S/酶分子酶分子高于高于90时，时，DNA合成几乎不能进行合成几乎不能进行延伸温度与时间：延伸温度与时间：延伸温度：一般选择在延伸温度：一般选择在7075之间之间常用温度为常用温度为常用温度为常用温度为7272过高的延伸
27、温度不利于引物和模板的结合。过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定1Kb1Kb以内的以内的以内的以内的DNADNA片段，延伸时间片段，延伸时间片段，延伸时间片段，延伸时间1min1min（足够）（足够）（足够）（足够） 3 34kb4kb的靶序列需的靶序列需的靶序列需的靶序列需3 34min4min扩增扩增扩增扩增10kb10kb需延伸至需延伸至需延伸至需延伸至15min15min延伸时间过长会导致非特异性扩增延伸时间过长会导致非特异性扩增对低浓度
28、模板的扩增，延伸时间要稍长些对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些2、循环次数、循环次数循环次数循环次数决定决定决定决定PCRPCR扩增程度扩增程度扩增程度扩增程度循环次数循环次数主要取决于模板主要取决于模板主要取决于模板主要取决于模板DNADNA的浓度的浓度的浓度的浓度循环次数：循环次数：选在选在3040次之间次之间循环次数越多，非特异性产物的量亦随之循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多增多如何提高如何提高PCR中的中的DNA聚合酶的保真性？聚合酶的保真性？在在在在PCRPCR反反反反应应应应体体体体系系系系中中中中，除除除除使使使使用用用用TaqTaq DNADNA聚聚聚聚合合合合酶酶酶
29、酶，掺掺掺掺入入入入少少少少量量量量的的的的具具具具有有有有3535外外外外切切切切酶酶酶酶活活活活性性性性的的的的耐耐耐耐热热热热DNADNA聚聚聚聚合合合合酶酶酶酶，如如如如PfuPfu，VentVent，PwoPwo等等等等，错错错错配配配配率率率率可可可可降降降降为为为为原原原原来来来来的的的的 1/101/10；MgMg2+2+浓度浓度浓度浓度尽可能低，但不影响尽可能低，但不影响尽可能低，但不影响尽可能低，但不影响DNADNA合成；合成；合成；合成；减少高温反应时间，这样减少高温反应时间，这样减少高温反应时间，这样减少高温反应时间，这样DNADNA热损伤将减少；热损伤将减少；热损伤将
30、减少；热损伤将减少；减少循环数。减少循环数。减少循环数。减少循环数。如何提高如何提高PCR扩增的特异性？扩增的特异性？升高退火温度可增加引物与模板结合的特异性；升高退火温度可增加引物与模板结合的特异性；升高退火温度可增加引物与模板结合的特异性；升高退火温度可增加引物与模板结合的特异性；缩缩缩缩短短短短退退退退火火火火和和和和延延延延伸伸伸伸时时时时间间间间，可可可可减减减减少少少少错错错错误误误误引引引引发发发发及及及及多多多多余余余余的的的的DNADNA聚合酶分子参与酶促延伸的机会；聚合酶分子参与酶促延伸的机会；聚合酶分子参与酶促延伸的机会；聚合酶分子参与酶促延伸的机会；降降降降低低低低引引
31、引引物物物物和和和和酶酶酶酶的的的的浓浓浓浓度度度度也也也也可可可可以以以以减减减减少少少少错错错错误误误误引引引引发发发发，尤尤尤尤其是能减少引物二聚体的引发；其是能减少引物二聚体的引发；其是能减少引物二聚体的引发；其是能减少引物二聚体的引发；改变改变改变改变MgMg2+2+的浓度可进一步提高扩增的特异性。的浓度可进一步提高扩增的特异性。的浓度可进一步提高扩增的特异性。的浓度可进一步提高扩增的特异性。引物设计的特异性；引物设计的特异性；引物设计的特异性；引物设计的特异性；减少循环次数；减少循环次数；减少循环次数；减少循环次数；热热热热启启启启动动动动（HotHotStartStart）。即即
32、即即首首首首先先先先将将将将模模模模板板板板变变变变性性性性，然然然然后后后后在在在在较较较较高高高高温温温温度度度度时时时时加加加加入入入入TaqTaq DNADNA聚聚聚聚合合合合酶酶酶酶、引引引引物物物物及及及及MgClMgCl2 2等等等等一一一一些些些些重重重重要要要要成成成成分分分分，这这这这样样样样使使使使得得得得引引引引物物物物在在在在较较较较高高高高温温温温度度度度下下下下与与与与模模模模板板板板退退退退火火火火，提提提提高高高高了了了了反反反反应应应应的的的的严严严严谨谨谨谨性性性性，使使使使扩扩扩扩增增增增更特异；更特异；更特异；更特异；采采采采用用用用二二二二对对对对引
33、引引引物物物物即即即即外外外外引引引引物物物物和和和和内内内内引引引引物物物物进进进进行行行行扩扩扩扩增增增增来来来来提提提提高高高高扩增的特异性。扩增的特异性。扩增的特异性。扩增的特异性。pRT-PCR及定量及定量RT-PCR（1）RT-PCR（reversetranscription-PCRreversetranscription-PCR）原原原原理理理理：先先先先在在在在逆逆逆逆转转转转录录录录酶酶酶酶的的的的作作作作用用用用下下下下、以以以以mRNAmRNA为为为为模模模模板板板板合合合合成成成成互互互互补补补补的的的的cDNAcDNA（complementarycomplementa
34、ry DNADNA），再再再再以以以以cDNAcDNA为模板进行为模板进行为模板进行为模板进行PCRPCR反应。反应。反应。反应。是是是是一一一一种种种种快快快快速速速速、简简简简便便便便、敏敏敏敏感感感感性性性性极极极极高高高高的的的的检检检检测测测测mRNAmRNA表表表表达达达达的方法。的方法。的方法。的方法。PCR技术的主要类型技术的主要类型常用的两种逆转录酶常用的两种逆转录酶AMV（avianmyeloblastosisvirus）：）：酶活性最适温度酶活性最适温度42MMLV（Moloneymurineleukemiavirus）：酶活性最适温度酶活性最适温度37（2）定量）定量R
35、T-PCR（qRT-PCR）：）：利利用用RT-PCR对对mRNA水水平平进进行行半半定定量量或或绝对定量分析。绝对定量分析。半定量半定量RT-PCR选用在组织中普遍表达、表达量比较恒定的管家选用在组织中普遍表达、表达量比较恒定的管家选用在组织中普遍表达、表达量比较恒定的管家选用在组织中普遍表达、表达量比较恒定的管家基因基因基因基因mRNAmRNA作为内源性基因模板标准。作为内源性基因模板标准。作为内源性基因模板标准。作为内源性基因模板标准。管家基因管家基因管家基因管家基因mRNAmRNA和目的和目的和目的和目的mRNAmRNA混合物共同进行逆混合物共同进行逆混合物共同进行逆混合物共同进行逆转
36、录，在各自的引物引导转录，在各自的引物引导转录，在各自的引物引导转录，在各自的引物引导下扩增。下扩增。下扩增。下扩增。计算计算计算计算出扩增后出扩增后出扩增后出扩增后目的基因扩增子目的基因扩增子目的基因扩增子目的基因扩增子/ / / /管家基因扩增子管家基因扩增子管家基因扩增子管家基因扩增子的的的的比值，从而达到半定量的目的。比值，从而达到半定量的目的。比值，从而达到半定量的目的。比值，从而达到半定量的目的。p实时荧光定量实时荧光定量PCR常规定量常规定量常规定量常规定量PCRPCR技术：技术：技术：技术：对对对对PCRPCR扩增反应的扩增反应的扩增反应的扩增反应的终产物终产物终产物终产物进行
37、定量进行定量进行定量进行定量重复性差重复性差重复性差重复性差半定量半定量半定量半定量实时定量实时定量实时定量实时定量PCRPCR技术：技术：技术：技术：对对对对PCRPCR扩增反应中扩增反应中扩增反应中扩增反应中每一个循环的产物每一个循环的产物每一个循环的产物每一个循环的产物进行定量进行定量进行定量进行定量实时荧光定量实时荧光定量PCR原理原理在在PCR反应体系中加入荧光基团，利用反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个荧光信号积累实时监测整个PCR进程，进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。分析。（1）Ct值值是是荧光定量荧光定量PCR的
38、的一一个重要个重要的的概念，概念，C代代表表Cycle，t代表代表threshold。含义是：含义是：每个反应管内的荧光信号每个反应管内的荧光信号到达到达设定设定的域值时所经历的循环数的域值时所经历的循环数。（2）荧光域值（）荧光域值（threshold）的设定）的设定PCR反应的前反应的前15个循环的荧光信号作为个循环的荧光信号作为荧光本底信号荧光本底信号荧光域值是荧光域值是3-15个循环的荧光信号的标准个循环的荧光信号的标准偏差的偏差的10倍，即：倍，即：threshold=10SDcycle3-153-15Ct值的确定 （3）Ct值与起始模板的关系值与起始模板的关系理想的理想的理想的理想
39、的PCRPCR反应：反应：反应：反应：X=XX=X0 0*2*2n n非理想的非理想的非理想的非理想的PCRPCR反应：反应：反应：反应：X=XX=X0 0(1+Ex)(1+Ex)n nnn：扩增反应的循环次数：扩增反应的循环次数：扩增反应的循环次数：扩增反应的循环次数X X：第：第：第：第n n次循环后的产物量次循环后的产物量次循环后的产物量次循环后的产物量X X0 0：初始模板量：初始模板量：初始模板量：初始模板量ExEx：扩增效率：扩增效率：扩增效率：扩增效率在扩增产物达到阈值线时在扩增产物达到阈值线时在扩增产物达到阈值线时在扩增产物达到阈值线时: :XXCtCt=X=X0 0 (1+E
40、x)(1+Ex)CtCt=M(1)=M(1) X XCtCt：荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量。荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量。荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量。荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量。 在阈值线设定以后，它是一个常数，我们设为在阈值线设定以后，它是一个常数，我们设为在阈值线设定以后，它是一个常数，我们设为在阈值线设定以后，它是一个常数，我们设为MM。方程式方程式方程式方程式(1)(1)两边同时取对数得两边同时取对数得两边同时取对数得两边同时取对数得: :logM=logXlogM=logX0 0(1+Ex)(1+Ex)CtCt(2)(2)整理方程式整理方程
41、式整理方程式整理方程式(2)(2)得得得得: :loglogX X0 0=-log(1+Ex)*=-log(1+Ex)*CtCt+logM+logM(3)(3)LogLog浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到到到到域值的循环数即域值的循环数即域值的循环数即域值的循环数即CtCt值，值，值，值，就可计算出样品中所含的模就可计算出样品中所含的模就可计算出样品中所含的模就可计算出样品中所含的模板量。板量。板量。板量。q 模板模板模板模板DNADNADNADNA量越多，荧光达到域值的循
42、环数越少，量越多，荧光达到域值的循环数越少，量越多，荧光达到域值的循环数越少，量越多，荧光达到域值的循环数越少，即即即即CtCtCtCt值越小值越小值越小值越小q LogLogLogLog浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品CtCtCtCt值，值，值，值，就可以计算出样品中所含的模板量就可以计算出样品中所含的模板量就可以计算出样品中所含的模板量就可以计算出样品中所含的模板量q确定未知样品的确定未知样品的确定未知样品的确定未知样品的 C(t)C(t)值值值值 q通过标准曲线由未知样品的通过标准曲线由未知样品的通过标准曲线由未知样品的通过标准曲线由未知样品的C(t)C(t)值推算出其初始值推算出其初始值推算出其初始值推算出其初始量量量量Sample25（4）荧光标记方法荧光标记方法可可分为两种：分为两种：荧光探针（荧光探针（Taqman）荧光染料（荧光染料（SYBRGreen）
